NJS小鼠短暂性前脑缺血后海马细胞改变的初步研究
作者：高志强 陈光辉 孙桂勤 孙敬方 田小芸
单位：高志强(南京军区南京总医院神经内科，江苏南京 210002)；陈光辉(南京军区南京总医院神经内科，江苏南京 210002)；孙桂勤(南京军区南京总医院病理科，江苏南京 210002)；孙敬方(南京军区南京总医院南京军区动物实验中心，江苏南京 210002)；田小芸(南京军区南京总医院南京军区动物实验中心，江苏南京 210002)
关键词：NJS小鼠；高胆固醇血症；短暂性脑缺血；海马
医学研究生学报000515中图分类号： R743.31 文献标识码： A 文章编号： 1008-8199(2000)05-0329-02
0 引 言
自发性高胆固醇血症小鼠(NJS)是经高度近交培育出的品系，这种小鼠在正常配方普通食物喂养下血清胆固醇浓度即明显高于正常小鼠[1，2]，具有易发冠状动脉粥样硬化的生化及行为特征[3]。为进一步了解NJS小鼠对脑缺血的反应，我们观察了这种小鼠短暂性前脑缺血后海马神经元的改变。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物选择 选择8月龄的雄性NJS小鼠和美国肿瘤研究学会培育的实验小鼠(ICR)各18只。其中雄性各10只，雌性各8只，实验小鼠由南京军区动物实验中心提供(苏动质字97001)。NJS小鼠的血清胆固醇浓度(5.65±0.83)mmol/L，为ICR小鼠的2倍左右。两种品系小鼠在相同的清洁级环境(苏动环字97001)饲养。采用普通配方全价颗粒饲料，人工光照(12 h/d)，室温(23.5±4.6)℃，相对湿度(50.9±9.3)%，噪音48 dB，照度220 lux。
1.2 脑缺血模型的制备和选择 ①参照沙土鼠及小鼠前脑缺血模型的方法，制作短暂性脑缺血模型(Himori 1990)[4]，氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，颈部正中纵行切口，在气管两侧分离出双侧颈总动脉，以动脉夹夹闭双侧颈总动脉，10 min后去掉动脉夹，恢复脑供血，并缝合皮肤。 ②手术中夹闭动脉后观察小鼠双侧眼球是否变苍白，术后2 h、4 h及6 h观察小鼠运动能力，是否有瘫痪。术前及术后3天称体重。 ③术后3天断头取双侧大脑组织，以10%中性甲醛固定，1周后行石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察双侧海马细胞死亡的情况，同时取相同标本用TdT介导dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)方法行免疫组化染色，用于观察细胞凋亡情况。统计海马各区每个高倍视野(400倍)细胞死亡数。
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1.3 两种小鼠的海马细胞死亡数以及术后3天体重下降的克数，进行对比分析，资料采用t检验，术中出现眼球变白、术后出现瘫痪的比例，采用精确概率法检验(fisher exact test)。所有统计过程均在计算机上由SPSS 8.0版完成。
2 结 果
2.1 术中出现情况 ①心跳骤停死亡,NJS小鼠4只，雌雄各2只；ICR小鼠2只，均为雄性。术后3天NJS小鼠体重下降较ICR小鼠明显(P<0.001)。②术中出现眼球变苍白，NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.014)；术后2 h出现一侧肢体瘫痪，表现为行走时向一侧旋转，在NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.026)。随着时间推移，向一侧旋转现象逐渐消失，6 h以后两组小鼠瘫痪情况均消失(详见表1)。表1 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后症状比较 指 标
NJS小鼠
, 百拇医药
ICR小鼠
P
眼球变苍白
11/14
5/16
0.014
2 h瘫痪
10/14
4/16
0.026
4 h瘫痪
3/14
1/16
, 百拇医药
0.315
6 h瘫痪
1/14
0/16
0.467
体重减轻
5.1±1.9
2.1±1.3
0.000
注：检验方法为Fisher Exact Test(体重减轻一项为T Test).
2.2 组织学检查 短暂性脑缺血72 h后小鼠双侧大脑半球大体切面未见界限分明的梗死灶，但高倍光镜下可见双侧半球均有神经元的死亡。因海马神经元有其独特的形态学特征，易于辨认，故对海马细胞改变情况进行统计。14只NJS小鼠和16只ICR小鼠做了HE切片染色，12只NJS小鼠和13只ICR小鼠做了TUNEL切片免疫组化染色。两种小鼠双侧海马均有细胞死亡，高倍光镜下可见死亡细胞表现为细胞皱缩、胞质深染，用TUNEL方法进行染色可见这种细胞死亡的性质属凋亡，有些已形成凋亡小体；而未见坏死、水肿和炎性细胞浸润现象。两种小鼠相比NJS小鼠细胞凋亡数要多于ICR小鼠。其中左侧CA1、CA3和齿状核细胞凋亡数量的差异有统计学意义(详见表2)。
, 百拇医药
表2 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后海马细胞死亡数目的比较(
±s) 缺血部位
左 脑
右 脑
NJS
ICR
P
NJS
ICR
P
CA1
23±23
, 百拇医药
8±3
0.03
15±7
12±6
0.26
CA2
17±21
10±6
0.16
15±15
22±28
0.42
CA3
, 百拇医药
31±28
12±10
0.02
21±23
24±20
0.68
CA4
19±14
15±15
0.45
24±27
31±35
0.57
, 百拇医药
齿状核
109±110
41±41
0.03
66±47
80±63
0.49
注：检验方法为independent Samples T Test
3 讨 论
在预实验中发现小鼠比大鼠对脑缺血的耐受性差，结扎双侧颈总动脉后两组小鼠均很快死亡，不能用于持续观察神经功能的变化。夹闭双侧颈总动脉10 min时出现呼吸深大、不规则，心律紊乱，超过10 min后极易死亡。从本实验结果可以看出NJS小鼠脑循环对缺血的耐受性较ICR小鼠更差，表现在夹闭双侧颈总动脉10 min内死亡的只数多、眼球变苍白的比例高(P=0.014)、手术后出现肢体瘫痪只数多(2 h P=0.026)，且持续时间长，术后体重下降明显(P<0.001)。
, 百拇医药
在脑组织病理切片上未见有明确的梗死灶，但可见散在的神经元死亡。NJS小鼠缺血72 h后海马细胞死亡数大于ICR小鼠，在部分海马区的差异有统计学意义。经TUNEL免疫组化染色确认这种细胞死亡应属细胞凋亡，说明不完全性部分脑组织缺血可导致神经元的凋亡，这可能就是缺血性脑血管病患者神经功能逐渐衰退的原因之一。既往对缺血性脑血管病的病理研究，采用制备脑梗死模型的方法[5]，这种方法由于梗死灶区脑血流阻断完全。因而梗死灶内细胞的凋亡不易从梗死的脑细胞坏死灶中分辨出来，其发病过程与人类某些短暂性脑缺血发作过程尚有较大差距。从本实验来看，采用结扎小鼠颈总动脉的方法不会导致明确的脑梗死灶，但脑组织中可见有神经元的凋亡。此种手术方法简单易行、手术死亡率低，术后存活时间较长，无需特殊的实验室条件，易于进行神经行为学观察。
高脂血症和A型行为(Michael 1991)都是心脑血管病的重要诱发因素[6]。NJS小鼠具备了这两种特征，以NJS小鼠做脑缺血模型更类似于人的发病过程，因此探讨NJS小鼠脑缺血后的神经元改变，可能有助于进一步帮助人们研究人类缺血性脑血管病的病理学和神经行为学的改变，以及探讨新的治疗方法。
, http://www.100md.com
高志强(1962-),男,山西长治人,医学硕士,副主任医师人,从事神经内科专业.
参考文献：
[1] 孙敬方. NJS系小鼠的选育研究. Ⅰ、培育历史与建系方法[J]. 上海实验动物学，1996，16(3，4)：131.
[2] 孙敬方. NJS系小鼠的选育研究. Ⅱ、近交过程中血清胆固醇含量的定向选择效应[J]. 畜牧与兽医，1997，29(4)：149.
[3] 高志强，田小芸，孙敬方.自发性高胆固醇血症小鼠神经行为学评估[J].中国行为医学科学,1999，8(3)：180.
[4] 魏 泓 主编.医学实验动物学[M].成都：四川科学技术出版社，1998.335.
[5] 王 伟.严格控制实验条件，建立标准化脑缺血动物模型[J].中华神经科杂志1998，31(5)：261.
[6] 杨菊贤，张锡明主编. 实用心身疾病学[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1992.132-148.
收稿日期：2000-02-18, 百拇医药
单位：高志强(南京军区南京总医院神经内科，江苏南京 210002)；陈光辉(南京军区南京总医院神经内科，江苏南京 210002)；孙桂勤(南京军区南京总医院病理科，江苏南京 210002)；孙敬方(南京军区南京总医院南京军区动物实验中心，江苏南京 210002)；田小芸(南京军区南京总医院南京军区动物实验中心，江苏南京 210002)
关键词：NJS小鼠；高胆固醇血症；短暂性脑缺血；海马
医学研究生学报000515中图分类号： R743.31 文献标识码： A 文章编号： 1008-8199(2000)05-0329-02
0 引 言
自发性高胆固醇血症小鼠(NJS)是经高度近交培育出的品系，这种小鼠在正常配方普通食物喂养下血清胆固醇浓度即明显高于正常小鼠[1，2]，具有易发冠状动脉粥样硬化的生化及行为特征[3]。为进一步了解NJS小鼠对脑缺血的反应，我们观察了这种小鼠短暂性前脑缺血后海马神经元的改变。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物选择 选择8月龄的雄性NJS小鼠和美国肿瘤研究学会培育的实验小鼠(ICR)各18只。其中雄性各10只，雌性各8只，实验小鼠由南京军区动物实验中心提供(苏动质字97001)。NJS小鼠的血清胆固醇浓度(5.65±0.83)mmol/L，为ICR小鼠的2倍左右。两种品系小鼠在相同的清洁级环境(苏动环字97001)饲养。采用普通配方全价颗粒饲料，人工光照(12 h/d)，室温(23.5±4.6)℃，相对湿度(50.9±9.3)%，噪音48 dB，照度220 lux。
1.2 脑缺血模型的制备和选择 ①参照沙土鼠及小鼠前脑缺血模型的方法，制作短暂性脑缺血模型(Himori 1990)[4]，氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，颈部正中纵行切口，在气管两侧分离出双侧颈总动脉，以动脉夹夹闭双侧颈总动脉，10 min后去掉动脉夹，恢复脑供血，并缝合皮肤。 ②手术中夹闭动脉后观察小鼠双侧眼球是否变苍白，术后2 h、4 h及6 h观察小鼠运动能力，是否有瘫痪。术前及术后3天称体重。 ③术后3天断头取双侧大脑组织，以10%中性甲醛固定，1周后行石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察双侧海马细胞死亡的情况，同时取相同标本用TdT介导dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)方法行免疫组化染色，用于观察细胞凋亡情况。统计海马各区每个高倍视野(400倍)细胞死亡数。
, http://www.100md.com
1.3 两种小鼠的海马细胞死亡数以及术后3天体重下降的克数，进行对比分析，资料采用t检验，术中出现眼球变白、术后出现瘫痪的比例，采用精确概率法检验(fisher exact test)。所有统计过程均在计算机上由SPSS 8.0版完成。
2 结 果
2.1 术中出现情况 ①心跳骤停死亡,NJS小鼠4只，雌雄各2只；ICR小鼠2只，均为雄性。术后3天NJS小鼠体重下降较ICR小鼠明显(P<0.001)。②术中出现眼球变苍白，NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.014)；术后2 h出现一侧肢体瘫痪，表现为行走时向一侧旋转，在NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.026)。随着时间推移，向一侧旋转现象逐渐消失，6 h以后两组小鼠瘫痪情况均消失(详见表1)。表1 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后症状比较 指 标
NJS小鼠
, 百拇医药
ICR小鼠
P
眼球变苍白
11/14
5/16
0.014
2 h瘫痪
10/14
4/16
0.026
4 h瘫痪
3/14
1/16
, 百拇医药
0.315
6 h瘫痪
1/14
0/16
0.467
体重减轻
5.1±1.9
2.1±1.3
0.000
注：检验方法为Fisher Exact Test(体重减轻一项为T Test).
2.2 组织学检查 短暂性脑缺血72 h后小鼠双侧大脑半球大体切面未见界限分明的梗死灶，但高倍光镜下可见双侧半球均有神经元的死亡。因海马神经元有其独特的形态学特征，易于辨认，故对海马细胞改变情况进行统计。14只NJS小鼠和16只ICR小鼠做了HE切片染色，12只NJS小鼠和13只ICR小鼠做了TUNEL切片免疫组化染色。两种小鼠双侧海马均有细胞死亡，高倍光镜下可见死亡细胞表现为细胞皱缩、胞质深染，用TUNEL方法进行染色可见这种细胞死亡的性质属凋亡，有些已形成凋亡小体；而未见坏死、水肿和炎性细胞浸润现象。两种小鼠相比NJS小鼠细胞凋亡数要多于ICR小鼠。其中左侧CA1、CA3和齿状核细胞凋亡数量的差异有统计学意义(详见表2)。
, 百拇医药
表2 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后海马细胞死亡数目的比较(
±s) 缺血部位左 脑
右 脑
NJS
ICR
P
NJS
ICR
P
CA1
23±23
, 百拇医药
8±3
0.03
15±7
12±6
0.26
CA2
17±21
10±6
0.16
15±15
22±28
0.42
CA3
, 百拇医药
31±28
12±10
0.02
21±23
24±20
0.68
CA4
19±14
15±15
0.45
24±27
31±35
0.57
, 百拇医药
齿状核
109±110
41±41
0.03
66±47
80±63
0.49
注：检验方法为independent Samples T Test
3 讨 论
在预实验中发现小鼠比大鼠对脑缺血的耐受性差，结扎双侧颈总动脉后两组小鼠均很快死亡，不能用于持续观察神经功能的变化。夹闭双侧颈总动脉10 min时出现呼吸深大、不规则，心律紊乱，超过10 min后极易死亡。从本实验结果可以看出NJS小鼠脑循环对缺血的耐受性较ICR小鼠更差，表现在夹闭双侧颈总动脉10 min内死亡的只数多、眼球变苍白的比例高(P=0.014)、手术后出现肢体瘫痪只数多(2 h P=0.026)，且持续时间长，术后体重下降明显(P<0.001)。
, 百拇医药
在脑组织病理切片上未见有明确的梗死灶，但可见散在的神经元死亡。NJS小鼠缺血72 h后海马细胞死亡数大于ICR小鼠，在部分海马区的差异有统计学意义。经TUNEL免疫组化染色确认这种细胞死亡应属细胞凋亡，说明不完全性部分脑组织缺血可导致神经元的凋亡，这可能就是缺血性脑血管病患者神经功能逐渐衰退的原因之一。既往对缺血性脑血管病的病理研究，采用制备脑梗死模型的方法[5]，这种方法由于梗死灶区脑血流阻断完全。因而梗死灶内细胞的凋亡不易从梗死的脑细胞坏死灶中分辨出来，其发病过程与人类某些短暂性脑缺血发作过程尚有较大差距。从本实验来看，采用结扎小鼠颈总动脉的方法不会导致明确的脑梗死灶，但脑组织中可见有神经元的凋亡。此种手术方法简单易行、手术死亡率低，术后存活时间较长，无需特殊的实验室条件，易于进行神经行为学观察。
高脂血症和A型行为(Michael 1991)都是心脑血管病的重要诱发因素[6]。NJS小鼠具备了这两种特征，以NJS小鼠做脑缺血模型更类似于人的发病过程，因此探讨NJS小鼠脑缺血后的神经元改变，可能有助于进一步帮助人们研究人类缺血性脑血管病的病理学和神经行为学的改变，以及探讨新的治疗方法。
, http://www.100md.com
高志强(1962-),男,山西长治人,医学硕士,副主任医师人,从事神经内科专业.
参考文献：
[1] 孙敬方. NJS系小鼠的选育研究. Ⅰ、培育历史与建系方法[J]. 上海实验动物学，1996，16(3，4)：131.
[2] 孙敬方. NJS系小鼠的选育研究. Ⅱ、近交过程中血清胆固醇含量的定向选择效应[J]. 畜牧与兽医，1997，29(4)：149.
[3] 高志强，田小芸，孙敬方.自发性高胆固醇血症小鼠神经行为学评估[J].中国行为医学科学,1999，8(3)：180.
[4] 魏 泓 主编.医学实验动物学[M].成都：四川科学技术出版社，1998.335.
[5] 王 伟.严格控制实验条件，建立标准化脑缺血动物模型[J].中华神经科杂志1998，31(5)：261.
[6] 杨菊贤，张锡明主编. 实用心身疾病学[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1992.132-148.
收稿日期：2000-02-18, 百拇医药