葛根对蛋白质非酶糖基化的抑制作用
作者：段有金 王韶颖 王晓颖 董瑶 韩玉素
单位：段有金(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 王韶颖(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 王晓颖(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 董瑶(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 韩玉素(中国医科大学第一临床学院内分泌科，沈阳 110001)
关键词：葛根；蛋白质非酶糖基化；糖尿病并发症
沈阳药科大学学报000119 摘 要：观察了中药葛根(Radix Puerariae)对人血清白蛋白和大鼠晶状体蛋白的非酶糖基化的抑制作用.结果表明，葛根的乙醇提取物对此两种蛋白质的糖基化均有不同程度的抑制作用.当葛根浓度为0.1%，0.3%和0.5%时，对人血浆白蛋白糖基化的抑制百分率分别是对照的：33，45和66；对于大鼠晶状体蛋白的糖基化抑制百分率分别是对照的：39，50和74.实验结果提示，在中药葛根中可能存在着较有应用前景的蛋白非酶糖基化抑制剂成分.
, 百拇医药
分类号：R 931.71；R965
Inhibitory Effects of Radix Puerariae on the Glycation
Duan Youjin,Wang Shaoying，Wang Xiaoying,Dong Yao,(Institute of Basic Medicine of Liaoning Province,Shenyang 110005)
Han Yusu
Abstract：It was observed that glycation of huminalbumin(HSA) and rat lens protein were effectively inhibited by the ethanol-extract of radix puerariae.As the concentration of ethanol-extract of radix puerariae was 0.1，0.3，and 0.5%(W/V) in the reaction mixture,the inhibitory rate was 33，45，and 66 percent of the control for the glycation of HSA,and 39，50，and 74 percent of the control for the glycation of rat lens protein respectively.These results suggest that Radix puerariae may be used as an inhibitor of glycation.
, http://www.100md.com
Key words：Radix puerariae；glycation;diabetic complications▲
近年来的研究证实，蛋白质非酶糖基化(简称糖基化)反应不仅在体外存在，在生物体内也广泛而缓慢地进行着.蛋白质经过反复糖基化发生交联、褐色变并有荧光生成，促使蛋白质功能降低和老化，从而引起机体组织产生病理改变，这与某些疾病的发病如糖尿病晚期合并症和动脉硬化及机体老化的发生有着密切的关系〔1，2〕.许多人致力于研究这种蛋白质非酶糖基化的抑制剂以达到防病治病的目的.中药葛根治疗“消渴症”(部分相当于现今的糖尿病)早有记载，但其中是否有抑制蛋白质非酶糖基化的成分及作用，至今未见报道.本文应用蛋白质糖基化的体外实验观察了葛根的乙醇提取物是否具有抑制蛋白质糖基化的作用，以便于对该药物进一步开发利用.
1 材料与方法
1.1 化学试剂及药物
, http://www.100md.com
人血清白蛋白(HSA)(Fraction V)购于Sigma,D〔U-14C〕葡萄糖和闪烁液Clear-sol Ⅰ分别购于Amersham和Nacalai Tesque Inc.,其余试剂均为分析纯.葛根的无水乙醇提取的干燥粉末是由日本粉末药品株式会社赠送，并直接应用于本实验.
1.2 大鼠晶状体蛋白的制备
50只Wistar种系大鼠晶状体在0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH7.4)10 mL中制成匀浆，高速离心(13 500×g)30 min，取其上清置透析膜内用蒸馏水透析，然后高速离心(15 000×g)30 min，其上清液经冷冻干燥后保存于-50℃备用.
1.3 蛋白质的糖基化实验方法
, 百拇医药
本实验是利用在含有蛋白质和葡萄糖的反应液中加入少量14C-葡萄糖，在反应一定时间后测定与蛋白质结合的14C-葡萄糖的量来测定该蛋白质的糖基化程度〔3〕.总量为2.3 mL的反应液中含有：0.1 mol/L缓冲液KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH7.4)，10 mmol/L 葡萄糖，1 μci/mL 14C-葡萄糖，2.7 mmol/L NaN3，2.0 mg/mL HSA或大鼠晶状体蛋白(含量同HSA)，及一定浓度葛根的乙醇提取物，不加葛根的作为对照.把上述反应液置于37℃水浴中轻轻振荡7天(晶状体蛋白为10天).保温后的反应液中加冷20%三氯醋酸(TCA)0.5 mL(晶状体蛋白的反应液中加0.7 mL)迅速混合并在冰浴中放置30 min后离心(5 000×g)20 min以沉淀蛋白质.在被沉淀的蛋白质中加入0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH7.4)/2.7 mmol/L NaN3(溶液Ⅰ)及冷20% TCA各0.5 mL后再次沉淀蛋白质，并再重复一次该步骤.用0.5 mL溶液Ⅰ溶解沉淀的蛋白质并在50℃水浴中加热10 min.加入5 mL闪烁液Clear-sol Ⅰ，应用液闪仪(Beckman 公司)计数.
, 百拇医药
2 实验结果
2.1 葛根对HSA糖基化的抑制作用
由表1可知，HSA在一定浓度的葡萄糖存在下经过7天保温后出现了明显的糖基化反应，14C-葡萄糖的参入量以dpm表示为1 543，在相同条件下，含有葛根乙醇提取物的保温液中的14C-葡萄糖的参入量则明显减少，当葛根乙醇提取物在保温液中的浓度为0.1%，0.3%和0.5%时，其对HSA糖基化抑制的百分率分别为33，45和66.葛根浓度与其对糖基化的抑制百分率成正相关(r=0.948)，而且相关关系非常显著(P<0.01).
Tab.1 Inhibitory effects of radix puerariae of different concentrations
on the glycation of HSA Concentration of
, http://www.100md.com
radix puerariae
(W/V)/%
Incorpration
content of 14C-
glucose/dpm
Inhibitory
rate/%
0(control)
1543±39
0
0.1
, 百拇医药 1034±30*
33
0.3
840±21*
45
0.5
520±13*
66
*P<0.01，compared with the control;the values are expressed as
±s，and the number of experiments is 8;the inhibitory rate is significantly correlated with the concentration of radix puerariae(r=0.948，P<0.01)2.2 葛根对大鼠晶状体蛋白糖基化抑制作用
, 百拇医药
表2显示了不同浓度葛根对晶状体蛋白糖基化的抑制作用.对照的晶状体蛋白质与葡萄糖经过10天保温后其14C-葡萄糖的参入量为945 dpm，明显小于HSA的葡萄糖参入量，说明晶状体蛋白的糖化反应慢于HSA，这一结果符合从前的报道〔4〕.在相同条件下，含有葛根乙醇提取物的保温液的14C-葡萄糖的参入量则明显减少，当葛根乙醇提取物在保温液中的浓度为0.1%，0.3%和0.5%时，其对大鼠晶状体蛋白糖基化抑制的百分率分别为39，50和74.葛根浓度与其对糖基化抑制的百分率成正相关(r=0.937)，而且相关关系非常显著(P<0.01).
Tab.2 Inhibitory effects of radix puerariae of different concentrations
on the glycation of lens protein Concentration of
, 百拇医药
radix puerariae
(W/V)/%
Incorpration
content of 14C-
glucose/dpm
Inhibitory
rate/%
0(control)
945±30
0
0.1
, 百拇医药 575±15*
35
0.3
470±12*
50
0.5
250±10*
74
*P<0.01，compared with the control;the values are expressed as±s，and the number of experiments is 8;the inhibitory rate is significantly correlated with concentration of radix puerariae(r=0.948，P<0.01)3 讨论
, 百拇医药
糖尿病是一种慢性代谢性疾病.由于胰岛素缺乏或相对缺乏，形成持续性高血糖症.这种持续性的高血糖症，可以导致一些组织器官的代谢异常，产生功能障碍及形态的异常，从而出现众多慢性并发症.这些并发症的发病机制，目前仍未清楚了解，但一些研究工作确实提供了重要线索.目前认为在高血糖的情况下机体组织的许多重要蛋白质发生非酶性糖基化反应增强使之功能障碍则是这些慢性并发症的主要发病机制之一〔1，2〕.本实验结果也证实，在10 mmol/L葡萄糖的存在下无论代谢较快的HSA还是代谢缓慢的晶状体蛋白经过一段时间的保温后都发生了非酶糖基化反应，而且前者的糖基化率高于后者， 与从前的工作相符〔4〕.
近年来，许多人致力于研究这种蛋白质非酶糖基化的抑制剂如D-赖氨酸(D-lysine)〔4〕，氨基胍(Aminoguanidine)〔5〕，Bendazac〔6〕等以达到防病治病的目的，防治糖尿病常用的中草药是否具有抑制蛋白质非酶糖基化的作用至今尚未见报道.葛根作为辛凉解表的中药是中国历代治疗“消渴病”(部分指现今的糖尿病)的常用中药之一，但其治疗机制目前还不清楚.有人报道葛根中的黄酮类化合物葛根素能明显地降低糖尿病小鼠的血糖〔7〕，同时对醛糖还原酶有抑制作用〔8〕.本实验证实葛根的乙醇提取物对代谢率较快的HSA和代谢率较慢的晶状体蛋白的非酶糖基化均有抑制作用，对后者尤为明显.这一结果提示我们，在葛根中可能存在抑制蛋白质非酶糖基化的有效成分，我们正着手进一步研究该药物抑制蛋白糖基化的有效组分.
, 百拇医药
致谢 在本次研究中日本名城大学药学部奥田润教授和三轮一智教授给予多方帮助和亲切指导，特表衷心感谢.■
参考文献：
[1]Monnier VM,Gerami A.Non-enzymatic browning in vivo:possible process for aging of long-lived proteins.Science,1982，211：491～493
[2]Brownlee M,Vlassara H,Cerami A.Nonenzymatic glycosylation and the pathogenesis of diabetic complications.Ann Intern Med,1987，101：527～537
[3]Khatami M，Suldan Z,David I,et al.Inhibition effects of pyridoxal phosphate,ascorbate and aminoguanidine on nonenzymatic glycosylation.Life Sciences,1988，43：1725～1731
, http://www.100md.com
[4]Sensl M,Pricci F,Rossi MGD,et al. D-Lysine effectively decreases the non-enzymic glycation of protein in vitro.Clin Chem,1989，35(3)：384～387
[5]Lewis B,Harding JJ.The effects of aminoguanidine on the glycation(non-enzymic glycation induced by bendazac.Exp Eye Res,1990,50：463～467
[6]Bruno MR,Sensi M,Cioccia GP,et al.Inhibition of proten non-enzymic glycation induced by bendazac.Diabetes Research,1988，9：11～14
[7]申竹芳，谢明智.葛根素与阿斯匹林复方的降血糖作用.药学学报，1985，20(11)：863～865
[8]谢明智，申竹芳.黄酮类化合物对醛糖还原酶的抑制作用.药学学报，1986，21(10)：721～723
收稿日期：1999-05-28, http://www.100md.com
单位：段有金(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 王韶颖(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 王晓颖(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 董瑶(辽宁省基础医学研究所，沈阳 110005；); 韩玉素(中国医科大学第一临床学院内分泌科，沈阳 110001)
关键词：葛根；蛋白质非酶糖基化；糖尿病并发症
沈阳药科大学学报000119 摘 要：观察了中药葛根(Radix Puerariae)对人血清白蛋白和大鼠晶状体蛋白的非酶糖基化的抑制作用.结果表明，葛根的乙醇提取物对此两种蛋白质的糖基化均有不同程度的抑制作用.当葛根浓度为0.1%，0.3%和0.5%时，对人血浆白蛋白糖基化的抑制百分率分别是对照的：33，45和66；对于大鼠晶状体蛋白的糖基化抑制百分率分别是对照的：39，50和74.实验结果提示，在中药葛根中可能存在着较有应用前景的蛋白非酶糖基化抑制剂成分.
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分类号：R 931.71；R965
Inhibitory Effects of Radix Puerariae on the Glycation
Duan Youjin,Wang Shaoying，Wang Xiaoying,Dong Yao,(Institute of Basic Medicine of Liaoning Province,Shenyang 110005)
Han Yusu
Abstract：It was observed that glycation of huminalbumin(HSA) and rat lens protein were effectively inhibited by the ethanol-extract of radix puerariae.As the concentration of ethanol-extract of radix puerariae was 0.1，0.3，and 0.5%(W/V) in the reaction mixture,the inhibitory rate was 33，45，and 66 percent of the control for the glycation of HSA,and 39，50，and 74 percent of the control for the glycation of rat lens protein respectively.These results suggest that Radix puerariae may be used as an inhibitor of glycation.
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Key words：Radix puerariae；glycation;diabetic complications▲
近年来的研究证实，蛋白质非酶糖基化(简称糖基化)反应不仅在体外存在，在生物体内也广泛而缓慢地进行着.蛋白质经过反复糖基化发生交联、褐色变并有荧光生成，促使蛋白质功能降低和老化，从而引起机体组织产生病理改变，这与某些疾病的发病如糖尿病晚期合并症和动脉硬化及机体老化的发生有着密切的关系〔1，2〕.许多人致力于研究这种蛋白质非酶糖基化的抑制剂以达到防病治病的目的.中药葛根治疗“消渴症”(部分相当于现今的糖尿病)早有记载，但其中是否有抑制蛋白质非酶糖基化的成分及作用，至今未见报道.本文应用蛋白质糖基化的体外实验观察了葛根的乙醇提取物是否具有抑制蛋白质糖基化的作用，以便于对该药物进一步开发利用.
1 材料与方法
1.1 化学试剂及药物
, http://www.100md.com
人血清白蛋白(HSA)(Fraction V)购于Sigma,D〔U-14C〕葡萄糖和闪烁液Clear-sol Ⅰ分别购于Amersham和Nacalai Tesque Inc.,其余试剂均为分析纯.葛根的无水乙醇提取的干燥粉末是由日本粉末药品株式会社赠送，并直接应用于本实验.
1.2 大鼠晶状体蛋白的制备
50只Wistar种系大鼠晶状体在0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH7.4)10 mL中制成匀浆，高速离心(13 500×g)30 min，取其上清置透析膜内用蒸馏水透析，然后高速离心(15 000×g)30 min，其上清液经冷冻干燥后保存于-50℃备用.
1.3 蛋白质的糖基化实验方法
, 百拇医药
本实验是利用在含有蛋白质和葡萄糖的反应液中加入少量14C-葡萄糖，在反应一定时间后测定与蛋白质结合的14C-葡萄糖的量来测定该蛋白质的糖基化程度〔3〕.总量为2.3 mL的反应液中含有：0.1 mol/L缓冲液KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH7.4)，10 mmol/L 葡萄糖，1 μci/mL 14C-葡萄糖，2.7 mmol/L NaN3，2.0 mg/mL HSA或大鼠晶状体蛋白(含量同HSA)，及一定浓度葛根的乙醇提取物，不加葛根的作为对照.把上述反应液置于37℃水浴中轻轻振荡7天(晶状体蛋白为10天).保温后的反应液中加冷20%三氯醋酸(TCA)0.5 mL(晶状体蛋白的反应液中加0.7 mL)迅速混合并在冰浴中放置30 min后离心(5 000×g)20 min以沉淀蛋白质.在被沉淀的蛋白质中加入0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH7.4)/2.7 mmol/L NaN3(溶液Ⅰ)及冷20% TCA各0.5 mL后再次沉淀蛋白质，并再重复一次该步骤.用0.5 mL溶液Ⅰ溶解沉淀的蛋白质并在50℃水浴中加热10 min.加入5 mL闪烁液Clear-sol Ⅰ，应用液闪仪(Beckman 公司)计数.
, 百拇医药
2 实验结果
2.1 葛根对HSA糖基化的抑制作用
由表1可知，HSA在一定浓度的葡萄糖存在下经过7天保温后出现了明显的糖基化反应，14C-葡萄糖的参入量以dpm表示为1 543，在相同条件下，含有葛根乙醇提取物的保温液中的14C-葡萄糖的参入量则明显减少，当葛根乙醇提取物在保温液中的浓度为0.1%，0.3%和0.5%时，其对HSA糖基化抑制的百分率分别为33，45和66.葛根浓度与其对糖基化的抑制百分率成正相关(r=0.948)，而且相关关系非常显著(P<0.01).
Tab.1 Inhibitory effects of radix puerariae of different concentrations
on the glycation of HSA Concentration of
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radix puerariae
(W/V)/%
Incorpration
content of 14C-
glucose/dpm
Inhibitory
rate/%
0(control)
1543±39
0
0.1
, 百拇医药 1034±30*
33
0.3
840±21*
45
0.5
520±13*
66
*P<0.01，compared with the control;the values are expressed as
±s，and the number of experiments is 8;the inhibitory rate is significantly correlated with the concentration of radix puerariae(r=0.948，P<0.01)2.2 葛根对大鼠晶状体蛋白糖基化抑制作用, 百拇医药
表2显示了不同浓度葛根对晶状体蛋白糖基化的抑制作用.对照的晶状体蛋白质与葡萄糖经过10天保温后其14C-葡萄糖的参入量为945 dpm，明显小于HSA的葡萄糖参入量，说明晶状体蛋白的糖化反应慢于HSA，这一结果符合从前的报道〔4〕.在相同条件下，含有葛根乙醇提取物的保温液的14C-葡萄糖的参入量则明显减少，当葛根乙醇提取物在保温液中的浓度为0.1%，0.3%和0.5%时，其对大鼠晶状体蛋白糖基化抑制的百分率分别为39，50和74.葛根浓度与其对糖基化抑制的百分率成正相关(r=0.937)，而且相关关系非常显著(P<0.01).
Tab.2 Inhibitory effects of radix puerariae of different concentrations
on the glycation of lens protein Concentration of
, 百拇医药
radix puerariae
(W/V)/%
Incorpration
content of 14C-
glucose/dpm
Inhibitory
rate/%
0(control)
945±30
0
0.1
, 百拇医药 575±15*
35
0.3
470±12*
50
0.5
250±10*
74
*P<0.01，compared with the control;the values are expressed as
±s，and the number of experiments is 8;the inhibitory rate is significantly correlated with concentration of radix puerariae(r=0.948，P<0.01)3 讨论, 百拇医药
糖尿病是一种慢性代谢性疾病.由于胰岛素缺乏或相对缺乏，形成持续性高血糖症.这种持续性的高血糖症，可以导致一些组织器官的代谢异常，产生功能障碍及形态的异常，从而出现众多慢性并发症.这些并发症的发病机制，目前仍未清楚了解，但一些研究工作确实提供了重要线索.目前认为在高血糖的情况下机体组织的许多重要蛋白质发生非酶性糖基化反应增强使之功能障碍则是这些慢性并发症的主要发病机制之一〔1，2〕.本实验结果也证实，在10 mmol/L葡萄糖的存在下无论代谢较快的HSA还是代谢缓慢的晶状体蛋白经过一段时间的保温后都发生了非酶糖基化反应，而且前者的糖基化率高于后者， 与从前的工作相符〔4〕.
近年来，许多人致力于研究这种蛋白质非酶糖基化的抑制剂如D-赖氨酸(D-lysine)〔4〕，氨基胍(Aminoguanidine)〔5〕，Bendazac〔6〕等以达到防病治病的目的，防治糖尿病常用的中草药是否具有抑制蛋白质非酶糖基化的作用至今尚未见报道.葛根作为辛凉解表的中药是中国历代治疗“消渴病”(部分指现今的糖尿病)的常用中药之一，但其治疗机制目前还不清楚.有人报道葛根中的黄酮类化合物葛根素能明显地降低糖尿病小鼠的血糖〔7〕，同时对醛糖还原酶有抑制作用〔8〕.本实验证实葛根的乙醇提取物对代谢率较快的HSA和代谢率较慢的晶状体蛋白的非酶糖基化均有抑制作用，对后者尤为明显.这一结果提示我们，在葛根中可能存在抑制蛋白质非酶糖基化的有效成分，我们正着手进一步研究该药物抑制蛋白糖基化的有效组分.
, 百拇医药
致谢 在本次研究中日本名城大学药学部奥田润教授和三轮一智教授给予多方帮助和亲切指导，特表衷心感谢.■
参考文献：
[1]Monnier VM,Gerami A.Non-enzymatic browning in vivo:possible process for aging of long-lived proteins.Science,1982，211：491～493
[2]Brownlee M,Vlassara H,Cerami A.Nonenzymatic glycosylation and the pathogenesis of diabetic complications.Ann Intern Med,1987，101：527～537
[3]Khatami M，Suldan Z,David I,et al.Inhibition effects of pyridoxal phosphate,ascorbate and aminoguanidine on nonenzymatic glycosylation.Life Sciences,1988，43：1725～1731
, http://www.100md.com
[4]Sensl M,Pricci F,Rossi MGD,et al. D-Lysine effectively decreases the non-enzymic glycation of protein in vitro.Clin Chem,1989，35(3)：384～387
[5]Lewis B,Harding JJ.The effects of aminoguanidine on the glycation(non-enzymic glycation induced by bendazac.Exp Eye Res,1990,50：463～467
[6]Bruno MR,Sensi M,Cioccia GP,et al.Inhibition of proten non-enzymic glycation induced by bendazac.Diabetes Research,1988，9：11～14
[7]申竹芳，谢明智.葛根素与阿斯匹林复方的降血糖作用.药学学报，1985，20(11)：863～865
[8]谢明智，申竹芳.黄酮类化合物对醛糖还原酶的抑制作用.药学学报，1986，21(10)：721～723
收稿日期：1999-05-28, http://www.100md.com