大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡的研究
作者：田涛 吴朝晖 金惠铭 顾玉东
单位：田涛(200032 上海医科大学病理生理学教研室)；吴朝晖(200032 上海医科大学病理生理学教研室)；金惠铭(200032 上海医科大学病理生理学教研室)；顾玉东(上海医科大学附属华山医院手外科)
关键词：骨骼肌萎缩；失神经；脱噬作用
中华医学杂志000717【摘要】目的 研究大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系以及肌细胞凋亡的基因调控机制。方法 应用臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩的大鼠模型，采用流式细胞仪PI法、PI和Annexin V双标记法、原位末端标记、DNA凝胶电泳和电镜等多种方法研究骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系。并用免疫组织化学和Northern-Blot方法检测凋亡相关基因Fas、FADD、Caspase-8、Bcl-2、P53、c-myc的表达。结果 骨骼肌萎缩时，DNA凝胶电泳呈梯形, 电镜下可见细胞凋亡的早期改变等，流式细胞仪、原位末端标记 (TUNEL)检测发现肌细胞凋亡百分率增高；免疫组织化学和Northern-Blot检测结果发现，骨骼肌萎缩时肌细胞内Fas、FADD、Caspase 8基因表达增加，Bcl-2基因表达减少。结论 臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡加强。在肌细胞凋亡的发生机制中，Fas介导的Fas-FADD-FLICE级联放大激活途径起了重要作用，其中Bcl-2的表达降低也起了一定作用。
, 百拇医药
Apoptosis in atrophic skeletal muscle induced by brachial plexus injury in rats
TIAN Tao WU Zhaohui JIN Huiming et al.
(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
【Abstract】Objective To study the role of apoptosis and the expression of apoptosis-associated genes in skeletal muscle atrophy induced by brachial plexus injury in rats. Methods Rat models of skeletal muscle atrophy were established by cutting off brachial plexus of one upper limb. Apoptosis of muscular cells was investigated by TUNEL, flowcytometry, DNA electrophoresis and electromicroscopic observation. The apoptosis associated genes such as Fas, FADD, Caspase 8, c-myc, P53 and Bcl-2 were detected by immunohistochemical method (ABC) and Northern-blot. Results It was found with TUNEL and flowcytometry that the percentage of apoptotic muscle cell rose obviously in atrophic skeletal muscle (P<0.05). DNA laddering could be seen in DNA gel electrophoresis of atrophic muscle after brachial injury. Morphologic changes of early stage in apoptotic cell could be seen under eletcromicroscope, such as the aggregation of chromosome, the expansion of nucleic cistern and the contraction of nucleus. Fas, FADD and Caspase genes were expressed highly and Bcl-2 gene was expressed lowly with immunohistochemical method in atrophic muscle. The results were all significantly different with that of the controls (P<0.01). But the expression changes in P53 and c-myc genes were not obvious. The result of Northern-blot indicated that the mRNA of Fas gene rose and that of Bcl-2 gene decreased obviously (P<0.01) in atrophic muscle induced by brachial plexus injury. Conclusion There are much more apoptotic cells in atrophic muscle induced by brachial plexus injury, and apoptosis plays an important role in its pathogenesis. The apoptotic signal maybe transmitted through Fas→FADD→Caspase 8, and the decrease in Bcl-2 gene expression aggravates the process.
, 百拇医药
【Key words】Skeletal muscle atrophy； Denervation； Apoptosis
骨骼肌萎缩是臂丛神经损伤后常见而难治的临床表现，常导致上肢运动功能丧失，因此其研究受到广泛的重视。骨骼肌萎缩时肌细胞的变化与细胞凋亡的形态改变十分相似。有人猜测细胞凋亡可能在肌肉萎缩中起着一定作用。但至今尚无明确的结论。本文应用臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩的大鼠模型，研究大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的改变，探讨骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系。并检测了凋亡相关基因的表达，试图阐明臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡的部分信号转导通路。
材料与方法
一、材料
1.动物：雄性SD大鼠55 只，体重120 g±10 g。
2.试剂：TUNEL和Ladder电泳检测凋亡试剂购自美国Boehringer Mannheim公司；Fas兔多克隆抗体、FADD (Fas-associating protein with death domain) 羊多克隆抗体、Caspase 8羊多克隆抗体、Bcl-2兔多克隆抗体、wtP53小鼠单克隆抗体均购自SANTA CRUZ公司。c-myc兔多克隆抗体购自博士德公司。ABC-抗小鼠IgG浓缩型试剂盒、ABC-抗兔IgG浓缩型试剂盒购自华美生物工程公司。总RNA抽提系统试剂购自美国Promega公司；地高辛寡核苷酸加尾标记试剂盒购自Boehringer公司；Fas探针序列为TGATACCAGCACTGGAGCAG，上海生工生物工程有限公司合成；Bcl-2探针序列为CAGCCAGGAAAG-ATCAAACAGAGG购自湖南来福佐公司；结合了碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(Anti-digoxigenin-AP)购自美国Boehringer公司。
, 百拇医药
二、方法
1.按照已经报道的方法[1]制备大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩动物模型，饲养4～18周。手术后每5d测量一次上臂中点臂围。取标本时仔细分出两侧肱三头肌，称量肌肉湿重。然后取材，一部分肌肉用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片。另一部分按已经报道的方法[2]制备成肌细胞悬液。
2.流式细胞仪PI标记法以及Annexin V和PI双标记法检测成肌细胞的凋亡：在成肌细胞单细胞悬液中加入50 μg/ml碘化丙啶 (PI) 50 μl (PI法)；或各加入Annexin V和PI至终浓度1 μg/ml (Annexin V和PI双标记法)。 然后应用流式细胞仪 (Facs Calibur,美国Becton Dickinson公司)对标本进行检测。采用CELLQUEST软件计算细胞凋亡百分率。
3.TUNEL法检测肌细胞凋亡：骨骼肌横切面的石蜡切片。阳性对照用DNase I(1 mg/ml)消化10 min后加入TUNEL反应混合液；阴性对照在TUNEL反应混合液中只加入标记液。具体操作参照Sirzen[2]的方法。
, 百拇医药
4.常规方法取材制备透射电镜标本，电镜下观察摄片。
5.免疫组织化学ABC法检测Fas、Fas 相关死亡区域蛋白(FADD)、Caspase-8 (半胱天冬酶)、Bcl-2、p53、c-myc基因蛋白水平的表达，方法按常规免疫组化ABC检测法。
6.Northern-blot检测Fas、Bcl-2 mRNA的表达：抽提肌肉总RNA同时将寡核苷酸探针用地高辛标记；总RNA进行甲醛变性电泳；毛细管虹吸法将RNA吸引转移到尼龙膜后进行预杂交、杂交；NBT/BCIP显色摄片。
7.免疫组织化学结果的图像分析：采用LEICA公司的Q500IW图象分析系统对免疫组织化学结果进行图像分析，每张切片上随机选择6个区域，调节系统去除本底后测量特异染色的平均光密度值。
8.统计学处理：数据资料用均数±标准差表示。组间比较采用配对及非配对t检验，并对部分资料进行了相关性分析。
, 百拇医药
结果
1.上臂臂围和肌肉湿重：臂丛神经损伤15 d后，手术侧与对照侧相比差异有显著意义(P<0.05)。15、25、35 d各时间点的手术侧臂围自身比较差异无显著意义，但与对照侧相比差异有显著意义(P<0.05) 。手术侧的肌肉湿重与对照侧相比，从4周到16周每个时间点差异均有显著意义(P<0.05)。手术侧不同时间点自身比较差异无显著意义(P>0.05)。
2.凋亡细胞百分率：采用流式细胞仪PI法、Annexin V和PI双标记法、TUNEL 3种方法检测了肌细胞的凋亡百分率分别为15%±14%，69%±12%，22%±12%。臂丛神经损伤后肌萎缩时肌细胞凋亡百分率均明显增高，分别为47%±10%，79%±9%，61%±10%，(均P<0.05)。并对凋亡百分率(PI法)和肌湿重进行相关性分析，结果两者呈显著负相关(y=-0.78x+0.55，r=-0.76,P<0.05)。
, 百拇医药 3.Ladder电泳结果：DNA凝胶电泳发现萎缩肌肉DNA电泳可呈梯形现象。
4.电镜结果：萎缩肌肉组织的电镜观察未见典型的凋亡小体，但发现臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时，肌细胞DNA染色体聚集，核周池扩大，核缩小，周围皱褶增多等细胞凋亡前期改变(图1)。
5.免疫组织化学(ABC)法检测Fas、FADD、Caspase-8、Bcl-2、P53、c-myc基因蛋白水平的表达，并用图象分析系统进行光密度检测，结果发现肌肉萎缩时Fas、FADD、Caspase 8表达增高，Bcl-2表达减少，P53和c-myc表达变化不明显(表1，图2)。
图1 萎缩骨骼肌细胞凋亡的透射电镜检测结果。左图为正常肌细胞核 ×7 500，右图为肌肉萎缩时肌细胞染色体聚集，核周池扩大 ×10 000
, 百拇医药
A、C、E、G分别为正常骨骼肌的Fas、Bcl-2、FADD、Caspase 8蛋白表达；B、F、H、D分别为萎缩骨骼肌细胞Fas、FADD、Caspase 8蛋白表达明显增加，Bcl-2蛋白表达明显减少
图2 骨骼肌萎缩时肌细胞内凋亡相关基因的蛋白表达免疫组化(ABC)法染色 ×400
表1 凋亡相关基因蛋白表达免疫组织化学检测
光密度分析结果(A值，
±s) 组别
相关蛋白
Fas
FADD
Caspase 8
, 百拇医药
Bcl-2
P53
c-myc
实验侧
5.06±
0.46
4.74±
0.33
4.12±
0.25
1.45±
0.43
1.69±
, 百拇医药
0.37
1.49±
0.45
对照侧
1.39±
0.98
1.25±
0.51
1.03±
0.47
6.31±
0.65
1.54±
, http://www.100md.com
0.72
1.63±
0.87
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
>0.05
6.Northern-blot检测Fas、Bcl-2 的mRNA的表达结果：Northern-blot检测灰度分析结果发现，臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞Fas基因mRNA的表达增高、Bcl-2 的mRNA的表达下降(图3)。讨论
, 百拇医药
我们应用切断臂丛神经的方法在40例大鼠上成功地制备了臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩的模型，并且发现大鼠去神经后发生的肌肉萎缩在15d内进展最快，4周后减慢，表现为臂围和肌湿重随时间延长而变化不明显，与前人的研究[3]一致。
近年来，有人将肌肉萎缩与细胞凋亡联系起来，认为骨骼肌萎缩中可能有细胞凋亡的机制参与。丹麦哥本哈根大学的研究人员[4]在电镜下观察到去神经比目鱼肌出现细胞皱缩、核固缩、核周池扩大、染色质浓缩等细胞凋亡的形态学改变，但未发现明显核碎片，认为这可能是一种无DNA降解的细胞凋亡。Tews等[5]则认为失神经支配后的肌肉存在细胞凋亡现象。他用TUNEL法检测了切断神经的大鼠面肌，发现失神经支配后大鼠面肌细胞出现DNA碎片。我们用流式细胞仪PI法以及PI和Annexin V双标记法检测结果发现，大鼠臂丛神经损伤后肌萎缩时肌细胞的凋亡百分率增高；原位末端标记(TUNEL)法结果发现萎缩肌肉中有较多的凋亡细胞；DNA凝胶电泳观察到萎缩肌细胞出现梯形电泳现象；萎缩肌肉组织的电镜观察虽未发现典型的凋亡小体，但发现肌萎缩时，肌细胞DNA染色体聚集，核周池扩大，核缩小，周围皱褶增多的细胞凋亡早期改变。通过以上几种方法相互印证，表明臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡明显增加。
, 百拇医药
图3 Northern-blot检测Fas、Bcl-2 mRNA的表达
细胞凋亡是一系列基因调控的自杀性死亡过程。Yamada等[6]曾经用免疫组织化学和Westernblot方法，研究了肌营养不良病人萎缩肌肉活检组织中凋亡相关基因Fas和Bcl-2的蛋白表达，发现II型肌纤维的凋亡与Fas基因的表达有关，与Bcl-2基因无关。受此工作的启发，我们首先用免疫组织化学ABC法检测了凋亡相关基因Fas、Bcl-2、c-myc和P53的蛋白表达，发现在臂丛神经损伤引起的骨骼肌萎缩中也有Fas 表达增高，同时伴有Bcl-2基因的表达减少，而c-myc和P53变化不明显。然后我们用Northern-Blot检测了Fas和Bcl-2基因的mRNA的表达，发现臂丛神经损伤后萎缩的骨骼肌细胞Fas基因mRNA表达增高，Bcl-2基因mRNA 表达减少。说明上述基因蛋白水平的改变是由于mRNA水平的改变造成的。由此我们认为，可能是由于Fas表达的增高诱导了肌细胞的凋亡，Bcl-2表达减少，使细胞凋亡的抑制作用减弱，两者协同作用导致细胞凋亡加强。
, 百拇医药
Fas分子可以通过其胞浆部分的死亡区域将凋亡信号转导给FADD蛋白。FADD可以通过死亡效应区(DED)把凋亡信号传给下游的Caspase-8(又称FLICE，FADD like ICE)，进一步活化Caspases系统[7]。我们研究了FADD和Caspase 8的蛋白表达情况，结果发现臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞中FADD和Caspase 8基因蛋白表达明显增高。综合以上蛋白水平和mRNA水平的变化，我们认为，臂丛神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的信号转导中Fas介导的Fas→FADD→Caspase 8级联放大激活途径起了重要的作用。
本研究为失神经肌肉萎缩的防治开辟了一条新思路，也是疾病防治中的一个新概念，应当引起我们足够的重视。
基金项目：美国中华医学基金资助项目(95-619)
参考文献
, 百拇医药 1，田涛，吴朝晖，金惠铭.大鼠骨骼肌失神经后肌萎缩和成肌细胞增殖动力学的变化.中华手外科杂志，1999,15：36-38.
2，Sirzen F, Zhivotovsky B, Nilsson A, et al. Higher spontaneous apoptotic index in small cell compared with non-small cell lung carcinoma cell lines; lack of correlation with Bcl-2/Bax. Lung-Cancer , 1998, 22: 1-13.
3，宋浩东.人骨骼肌失神经后细胞增殖状态的变化——PCNA免疫组化研究.中华手外科杂志，1996, 12:52-56.
4，Rodrigues A de C, Schmalbruch. Satellite cells and myonuclei in long term denervated rat muscles. Anat Rec , 1995,243:430-437.
, http://www.100md.com
5，Tews DS, Goebel HH, Schneider I, et al. DNA fragmentation and expression of apoptosis-related proteins in experimentally denervated and reinnervated rat facial muscle. Neuropathol Appl Neurobiol,1997,23:2,141-149.
6，Yamada H, Nakagawa M, Higuchi I, et al. Type II muscle fibers are stained by anti-Fas antibody. J Neurol Sci, 1995, 134:115-118.
7，Depraetere V, Golstein P. Fas and other cell death signaling pathways. Semin Immunol, 1997，9: 93-107.
收稿日期：1999-09-07, 百拇医药
单位：田涛(200032 上海医科大学病理生理学教研室)；吴朝晖(200032 上海医科大学病理生理学教研室)；金惠铭(200032 上海医科大学病理生理学教研室)；顾玉东(上海医科大学附属华山医院手外科)
关键词：骨骼肌萎缩；失神经；脱噬作用
中华医学杂志000717【摘要】目的 研究大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系以及肌细胞凋亡的基因调控机制。方法 应用臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩的大鼠模型，采用流式细胞仪PI法、PI和Annexin V双标记法、原位末端标记、DNA凝胶电泳和电镜等多种方法研究骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系。并用免疫组织化学和Northern-Blot方法检测凋亡相关基因Fas、FADD、Caspase-8、Bcl-2、P53、c-myc的表达。结果 骨骼肌萎缩时，DNA凝胶电泳呈梯形, 电镜下可见细胞凋亡的早期改变等，流式细胞仪、原位末端标记 (TUNEL)检测发现肌细胞凋亡百分率增高；免疫组织化学和Northern-Blot检测结果发现，骨骼肌萎缩时肌细胞内Fas、FADD、Caspase 8基因表达增加，Bcl-2基因表达减少。结论 臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡加强。在肌细胞凋亡的发生机制中，Fas介导的Fas-FADD-FLICE级联放大激活途径起了重要作用，其中Bcl-2的表达降低也起了一定作用。
, 百拇医药
Apoptosis in atrophic skeletal muscle induced by brachial plexus injury in rats
TIAN Tao WU Zhaohui JIN Huiming et al.
(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
【Abstract】Objective To study the role of apoptosis and the expression of apoptosis-associated genes in skeletal muscle atrophy induced by brachial plexus injury in rats. Methods Rat models of skeletal muscle atrophy were established by cutting off brachial plexus of one upper limb. Apoptosis of muscular cells was investigated by TUNEL, flowcytometry, DNA electrophoresis and electromicroscopic observation. The apoptosis associated genes such as Fas, FADD, Caspase 8, c-myc, P53 and Bcl-2 were detected by immunohistochemical method (ABC) and Northern-blot. Results It was found with TUNEL and flowcytometry that the percentage of apoptotic muscle cell rose obviously in atrophic skeletal muscle (P<0.05). DNA laddering could be seen in DNA gel electrophoresis of atrophic muscle after brachial injury. Morphologic changes of early stage in apoptotic cell could be seen under eletcromicroscope, such as the aggregation of chromosome, the expansion of nucleic cistern and the contraction of nucleus. Fas, FADD and Caspase genes were expressed highly and Bcl-2 gene was expressed lowly with immunohistochemical method in atrophic muscle. The results were all significantly different with that of the controls (P<0.01). But the expression changes in P53 and c-myc genes were not obvious. The result of Northern-blot indicated that the mRNA of Fas gene rose and that of Bcl-2 gene decreased obviously (P<0.01) in atrophic muscle induced by brachial plexus injury. Conclusion There are much more apoptotic cells in atrophic muscle induced by brachial plexus injury, and apoptosis plays an important role in its pathogenesis. The apoptotic signal maybe transmitted through Fas→FADD→Caspase 8, and the decrease in Bcl-2 gene expression aggravates the process.
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【Key words】Skeletal muscle atrophy； Denervation； Apoptosis
骨骼肌萎缩是臂丛神经损伤后常见而难治的临床表现，常导致上肢运动功能丧失，因此其研究受到广泛的重视。骨骼肌萎缩时肌细胞的变化与细胞凋亡的形态改变十分相似。有人猜测细胞凋亡可能在肌肉萎缩中起着一定作用。但至今尚无明确的结论。本文应用臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩的大鼠模型，研究大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的改变，探讨骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系。并检测了凋亡相关基因的表达，试图阐明臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡的部分信号转导通路。
材料与方法
一、材料
1.动物：雄性SD大鼠55 只，体重120 g±10 g。
2.试剂：TUNEL和Ladder电泳检测凋亡试剂购自美国Boehringer Mannheim公司；Fas兔多克隆抗体、FADD (Fas-associating protein with death domain) 羊多克隆抗体、Caspase 8羊多克隆抗体、Bcl-2兔多克隆抗体、wtP53小鼠单克隆抗体均购自SANTA CRUZ公司。c-myc兔多克隆抗体购自博士德公司。ABC-抗小鼠IgG浓缩型试剂盒、ABC-抗兔IgG浓缩型试剂盒购自华美生物工程公司。总RNA抽提系统试剂购自美国Promega公司；地高辛寡核苷酸加尾标记试剂盒购自Boehringer公司；Fas探针序列为TGATACCAGCACTGGAGCAG，上海生工生物工程有限公司合成；Bcl-2探针序列为CAGCCAGGAAAG-ATCAAACAGAGG购自湖南来福佐公司；结合了碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(Anti-digoxigenin-AP)购自美国Boehringer公司。
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二、方法
1.按照已经报道的方法[1]制备大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩动物模型，饲养4～18周。手术后每5d测量一次上臂中点臂围。取标本时仔细分出两侧肱三头肌，称量肌肉湿重。然后取材，一部分肌肉用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片。另一部分按已经报道的方法[2]制备成肌细胞悬液。
2.流式细胞仪PI标记法以及Annexin V和PI双标记法检测成肌细胞的凋亡：在成肌细胞单细胞悬液中加入50 μg/ml碘化丙啶 (PI) 50 μl (PI法)；或各加入Annexin V和PI至终浓度1 μg/ml (Annexin V和PI双标记法)。 然后应用流式细胞仪 (Facs Calibur,美国Becton Dickinson公司)对标本进行检测。采用CELLQUEST软件计算细胞凋亡百分率。
3.TUNEL法检测肌细胞凋亡：骨骼肌横切面的石蜡切片。阳性对照用DNase I(1 mg/ml)消化10 min后加入TUNEL反应混合液；阴性对照在TUNEL反应混合液中只加入标记液。具体操作参照Sirzen[2]的方法。
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4.常规方法取材制备透射电镜标本，电镜下观察摄片。
5.免疫组织化学ABC法检测Fas、Fas 相关死亡区域蛋白(FADD)、Caspase-8 (半胱天冬酶)、Bcl-2、p53、c-myc基因蛋白水平的表达，方法按常规免疫组化ABC检测法。
6.Northern-blot检测Fas、Bcl-2 mRNA的表达：抽提肌肉总RNA同时将寡核苷酸探针用地高辛标记；总RNA进行甲醛变性电泳；毛细管虹吸法将RNA吸引转移到尼龙膜后进行预杂交、杂交；NBT/BCIP显色摄片。
7.免疫组织化学结果的图像分析：采用LEICA公司的Q500IW图象分析系统对免疫组织化学结果进行图像分析，每张切片上随机选择6个区域，调节系统去除本底后测量特异染色的平均光密度值。
8.统计学处理：数据资料用均数±标准差表示。组间比较采用配对及非配对t检验，并对部分资料进行了相关性分析。
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结果
1.上臂臂围和肌肉湿重：臂丛神经损伤15 d后，手术侧与对照侧相比差异有显著意义(P<0.05)。15、25、35 d各时间点的手术侧臂围自身比较差异无显著意义，但与对照侧相比差异有显著意义(P<0.05) 。手术侧的肌肉湿重与对照侧相比，从4周到16周每个时间点差异均有显著意义(P<0.05)。手术侧不同时间点自身比较差异无显著意义(P>0.05)。
2.凋亡细胞百分率：采用流式细胞仪PI法、Annexin V和PI双标记法、TUNEL 3种方法检测了肌细胞的凋亡百分率分别为15%±14%，69%±12%，22%±12%。臂丛神经损伤后肌萎缩时肌细胞凋亡百分率均明显增高，分别为47%±10%，79%±9%，61%±10%，(均P<0.05)。并对凋亡百分率(PI法)和肌湿重进行相关性分析，结果两者呈显著负相关(y=-0.78x+0.55，r=-0.76,P<0.05)。
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4.电镜结果：萎缩肌肉组织的电镜观察未见典型的凋亡小体，但发现臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时，肌细胞DNA染色体聚集，核周池扩大，核缩小，周围皱褶增多等细胞凋亡前期改变(图1)。
5.免疫组织化学(ABC)法检测Fas、FADD、Caspase-8、Bcl-2、P53、c-myc基因蛋白水平的表达，并用图象分析系统进行光密度检测，结果发现肌肉萎缩时Fas、FADD、Caspase 8表达增高，Bcl-2表达减少，P53和c-myc表达变化不明显(表1，图2)。
图1 萎缩骨骼肌细胞凋亡的透射电镜检测结果。左图为正常肌细胞核 ×7 500，右图为肌肉萎缩时肌细胞染色体聚集，核周池扩大 ×10 000
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A、C、E、G分别为正常骨骼肌的Fas、Bcl-2、FADD、Caspase 8蛋白表达；B、F、H、D分别为萎缩骨骼肌细胞Fas、FADD、Caspase 8蛋白表达明显增加，Bcl-2蛋白表达明显减少
图2 骨骼肌萎缩时肌细胞内凋亡相关基因的蛋白表达免疫组化(ABC)法染色 ×400
表1 凋亡相关基因蛋白表达免疫组织化学检测
光密度分析结果(A值，
±s) 组别相关蛋白
Fas
FADD
Caspase 8
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Bcl-2
P53
c-myc
实验侧
5.06±
0.46
4.74±
0.33
4.12±
0.25
1.45±
0.43
1.69±
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0.37
1.49±
0.45
对照侧
1.39±
0.98
1.25±
0.51
1.03±
0.47
6.31±
0.65
1.54±
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0.72
1.63±
0.87
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
>0.05
6.Northern-blot检测Fas、Bcl-2 的mRNA的表达结果：Northern-blot检测灰度分析结果发现，臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞Fas基因mRNA的表达增高、Bcl-2 的mRNA的表达下降(图3)。讨论
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我们应用切断臂丛神经的方法在40例大鼠上成功地制备了臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩的模型，并且发现大鼠去神经后发生的肌肉萎缩在15d内进展最快，4周后减慢，表现为臂围和肌湿重随时间延长而变化不明显，与前人的研究[3]一致。
近年来，有人将肌肉萎缩与细胞凋亡联系起来，认为骨骼肌萎缩中可能有细胞凋亡的机制参与。丹麦哥本哈根大学的研究人员[4]在电镜下观察到去神经比目鱼肌出现细胞皱缩、核固缩、核周池扩大、染色质浓缩等细胞凋亡的形态学改变，但未发现明显核碎片，认为这可能是一种无DNA降解的细胞凋亡。Tews等[5]则认为失神经支配后的肌肉存在细胞凋亡现象。他用TUNEL法检测了切断神经的大鼠面肌，发现失神经支配后大鼠面肌细胞出现DNA碎片。我们用流式细胞仪PI法以及PI和Annexin V双标记法检测结果发现，大鼠臂丛神经损伤后肌萎缩时肌细胞的凋亡百分率增高；原位末端标记(TUNEL)法结果发现萎缩肌肉中有较多的凋亡细胞；DNA凝胶电泳观察到萎缩肌细胞出现梯形电泳现象；萎缩肌肉组织的电镜观察虽未发现典型的凋亡小体，但发现肌萎缩时，肌细胞DNA染色体聚集，核周池扩大，核缩小，周围皱褶增多的细胞凋亡早期改变。通过以上几种方法相互印证，表明臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡明显增加。
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图3 Northern-blot检测Fas、Bcl-2 mRNA的表达
细胞凋亡是一系列基因调控的自杀性死亡过程。Yamada等[6]曾经用免疫组织化学和Westernblot方法，研究了肌营养不良病人萎缩肌肉活检组织中凋亡相关基因Fas和Bcl-2的蛋白表达，发现II型肌纤维的凋亡与Fas基因的表达有关，与Bcl-2基因无关。受此工作的启发，我们首先用免疫组织化学ABC法检测了凋亡相关基因Fas、Bcl-2、c-myc和P53的蛋白表达，发现在臂丛神经损伤引起的骨骼肌萎缩中也有Fas 表达增高，同时伴有Bcl-2基因的表达减少，而c-myc和P53变化不明显。然后我们用Northern-Blot检测了Fas和Bcl-2基因的mRNA的表达，发现臂丛神经损伤后萎缩的骨骼肌细胞Fas基因mRNA表达增高，Bcl-2基因mRNA 表达减少。说明上述基因蛋白水平的改变是由于mRNA水平的改变造成的。由此我们认为，可能是由于Fas表达的增高诱导了肌细胞的凋亡，Bcl-2表达减少，使细胞凋亡的抑制作用减弱，两者协同作用导致细胞凋亡加强。
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Fas分子可以通过其胞浆部分的死亡区域将凋亡信号转导给FADD蛋白。FADD可以通过死亡效应区(DED)把凋亡信号传给下游的Caspase-8(又称FLICE，FADD like ICE)，进一步活化Caspases系统[7]。我们研究了FADD和Caspase 8的蛋白表达情况，结果发现臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞中FADD和Caspase 8基因蛋白表达明显增高。综合以上蛋白水平和mRNA水平的变化，我们认为，臂丛神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的信号转导中Fas介导的Fas→FADD→Caspase 8级联放大激活途径起了重要的作用。
本研究为失神经肌肉萎缩的防治开辟了一条新思路，也是疾病防治中的一个新概念，应当引起我们足够的重视。
基金项目：美国中华医学基金资助项目(95-619)
参考文献
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7，Depraetere V, Golstein P. Fas and other cell death signaling pathways. Semin Immunol, 1997，9: 93-107.
收稿日期：1999-09-07, 百拇医药