S-100蛋白β亚单位ELISA检测方法的建立和初步应用*
作者：赵玉峰 张万会 朱运龙 胡玉珍 陈健康 李琦 安书成
单位：赵玉峰，张万会，朱运龙，胡玉珍，陈健康：第四军医大学，生理学教研室；李琦：免疫学教研室，西安，710031；安书成：陕西师范大学生命科学学院。
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990229S-100蛋白是1965年由Moore发现并命名的一组酸性钙结合蛋白，相对分子质量(Mr)约为20000,由α链和β链组成。根据组合方式，S-100可分为S-100a(αβ)，S-100b(ββ)和S-100ao(αα)3种基本亚型。S-100的分布具有组织特异性，S-100a主要见于神经组织中的神经元，S-100b主要见于胶质细胞中，S-100ao则主要存在于心脏、横纹肌和肾脏等组织[1]。
S-100作为病理学标志性蛋白，已用于黑色素瘤、神经胶质瘤、脊索瘤及脂肪瘤等的病理诊断。近期发现，体液中S-100蛋白的含量在许多疾病时可发生变化，如阿尔采末病、Down's综合征及癫痫患者的脑脊液[2]、缺血性脑损伤患者的脑脊液及血液[3]、转移性黑色素瘤[4]和脱髓鞘性疾病[5,6](如多发性硬化症、格林巴利综合征)患者的血清中，S-100蛋白的浓度均升高，且升高程度与神经组织损伤的严重性呈正相关。上述资料表明，S-100蛋白(特别是S-100b)在神经组织的病理及病理生理过程中起着一定的作用，并可作为神经组织疾病辅助诊断和预后的一项重要指标。
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在离体条件下，S-100蛋白不但存在于细胞内,也可分泌至胞外，如C6胶质瘤细胞株在生长过程中可分泌S-100蛋白[1]。S-100蛋白可促进培养的神经元轴突生长和维持神经元存活，并刺激C6胶质瘤细胞株和黑色素瘤细胞株M14，M15和M19的增殖[1]。这些现象提示，S-100蛋白在细胞间通讯中也起着重要作用，并可能与肿瘤的发生、发展有一定的关系。垂体前叶中，表达S-100蛋白的滤泡星形细胞可互相连接形成网架结构，在机体内分泌状态变动时，此类细胞可出现明显的形态变化[7]。滤泡星形细胞可影响垂体前叶激素的释放，S-100蛋白在其中可能起一定的作用[8]。为深入研究S-100蛋白在细胞中的合成、分泌及其作用，本实验室建立了一种灵敏、特异、结果可靠的检测S-100蛋白的双抗体夹心ELISA法。
1 材料和方法
1.1 材料 牛S-100b蛋白及小鼠抗牛S-100βmAb，均购自Sigma公司。兔抗牛S-100PcAb，购自Dako公司。羊抗兔IgG-HRP购自华美公司。ABTS为美国AMERISCO产品。酶标板为Nunc公司产品。牛血清白蛋白由上海生物制品厂制备。酶标仪为BioRAD550型。
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1.2 方法
1.2.1 S-100蛋白检测方法的建立 采用双抗体夹心ELISA法。具体步骤是：用抗S-100mAb(40mg/L)包被酶标板，4℃包被48h。洗涤液(PBS+0.05%Tween20)洗涤3次，加入标准品(牛S-100b蛋白)及待检样品，37℃作用1h。洗板，加入S-100PcAb(1∶5000)，4℃过夜再置室温1h，洗板同前。加入IgG-HRP(1∶700)，37℃作用1h。洗板，加入显色液(底物液10ml+ABTS5mg+3%H2O220μl)，37℃显色15～30min后读记A410值。实验中以稀释液作为阴性对照，测定10孔，取平均值，以大于平均值的2.1倍作为阳性判断标准确定最低检测值。
1.2.2 标准曲线的绘制 用0.1%PBSA(PBS+0.1%白蛋白)将S-100b蛋白自16μg/L起，2倍连续稀释至0.016μg/L，每个浓度加3孔，测定A410值。以A410平均值为纵座标，S-100b蛋白浓度为横座标绘制标准曲线。
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1.2.3 特异性鉴定 以抗S-100mAb包被酶标板，分别加入IL-6，IL-1，P物质，GH和ACTH等物质，每种样品均设复孔测定A410值，并与阴性对照值做比较，观察有无交叉反应。
1.2.4 可信度测定 将S-100蛋白标准品在同一块板上分别测定16孔，另将同一样品在不同时间加入酶标板中，每板分别测定8孔，共测定5次，然后分别计算变异系数(CV)。
1.2.5 S-100蛋白的检测 抽取正常SD大鼠血清。收获胰酶消化的大鼠垂体前叶、后叶细胞，调整至3×105/ml，按200μl/孔种植于96孔培养板中培养，于第2天收集细胞培养上清。脑脊液标本由西京医院神经内科提供(10例为蛛网膜下腔出血，8例为脑出血，7例为非神经系统疾病)，上述检样均冻存于-20℃待检。按1.2.1的方法进行检测，各检样均作复孔测定。
1.2.6 PLS对S-100蛋白释放的影响 按1.2.5的方法培养大鼠垂体前叶细胞。24h后，按1mg/L的浓度加入LPS。再培养24h后，收集细胞培养上清，检测S-100蛋白量的变化。
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2 结果
2.1 检测体系最佳条件的确定
2.1.1 包被抗体的选择 分别用抗S-100蛋白的mAb和PcAb作为包被抗体，做双抗体夹心ELISA并绘制标准曲线。结果表明，以mAb作为包被抗体时，灵敏度高、可测范围宽。
2.1.2 抗体浓度的确定 将S-100蛋白标准品自1mg/L起，10倍连续稀释至1ng/L，作为包被抗体的抗S-100βmAb取3个浓度(40mg/L，20mg/L,10mg/L)；作为夹心抗体的S-100PcAb取3个浓度(1∶3000,1∶5000和1∶10000)；酶标抗体稀释度为1∶700，采用棋盘滴定法确定抗体的最佳浓度。当包被抗体为40mg/L，检测抗体为1∶5000时，标准曲线的线性关系最佳，阴性对照值最小，灵敏度最高，结果较为理想。
2.1.3 反应时间的确定 于4℃包被48h，抗体可最大限度地吸附于酶标板上，抗原、抗体反应在37℃下1h即可达到平衡。但因抗S-100PcAb的亲和力较抗S-100mAb差，为了提高测定体系的灵敏度，在加入S-100PcAb后，将反应时间延长为4℃过夜再室温1h，以利于抗原、抗体最大限度地结合。结果表明，所获标准曲线最佳，且未增强非特异性吸附。
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2.2 测定体系的指标
2.2.1 标准曲线 以吸光度为纵坐标，以S-100b蛋白浓度为横座标，绘制的标准曲线，如图1所示。
图1 S-100蛋白β链ELISA检测方法的标准曲线
2.2.2 灵敏度 应用本文建立的ELISA法，可检出S-100蛋白的最低含量为0.03μg/L。
2.2.3 精确度 将S-100蛋白标准品在同一块板上，分别测定数孔及于不同时间测定5次。结果表明，前一种情况的CV为6.4%，后一种情况为12.5%。
2.2.4 特异性 分别加入IL-6，IL-1，P物质，GH和ACTH孔的A410值，与阴性对照孔的A410值相比较，经统计学处理无明显差别(P>0.05)，表明S-100蛋白与这些物质均无交叉反应。
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2.3 三种样品中S-100蛋白的检测 正常大鼠血清及垂体前、后叶细胞培养上清中，S-100蛋白的检测结果见表1；患者脑脊液中S-100蛋白的检测结果见图2。
表1 大鼠血清和垂体细胞培养上清中S-100蛋白的检测
样本来源
例数
(n)
±SD
(μg/L)
检测范围
(μg/L)
血清
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12
0.71±0.30
0.25-1.30
垂体前叶培养上清
5
0.27±0.01
0.17-0.39
垂体后叶培养上清
5
0.65±0.10
0.54-0.76
, 百拇医药
图2 LPS对垂体前叶细胞培养上清中S-100蛋白的影响
2.4 LPS对S-100蛋白检出的影响 培养第2天的大鼠垂体前叶细胞的上清中，含有少量的S-100蛋白(约为0.27μg/L)，加入LPS的培养上清中，S-100蛋白的含量明显减少。而在标准品中加入1mg/LLPS绘制的标准曲线，与未加LPS的标准品绘制的标准曲线完全一致(图略)，说明培养上清中S-100蛋白检出量的减少不是测定方法的原因，而是LPS对培养的垂体前叶细胞作用的结果。经4次独立实验结果完全一致，图3是其中的结果之一。
图3 临床患者脑脊液中S-100蛋白的检测
3 讨论
S-100蛋白作为组织标识物，已在病理学等领域得到广泛应用。近来倍受关注的是体液中S-100蛋白的含量与疾病之间的关系，但国内未见有S-100蛋白检测方法的报道。为此,本室采用两种商品化的抗S-100蛋白抗体成功地建立了此检测体系。在S-100蛋白的研究中，已建立了荧光标记、放免分析和酶联免疫试验等检测体系。这些检测方法在灵敏度、特异性和应用范围上差别很大。本检测体系的灵敏度为0.03μg/L，与国外研究者Green等[9]的报道相近。其中，购于Sigma公司的抗S-100βmAb具有高度的特异性,与其它EF-hand家族钙结合蛋白无交叉反应，保证了检测体系的高度特异性。S-100蛋白具有种属保守性，抗S-100蛋白抗体可识别人、牛、猪、兔、和大鼠来源的S-100蛋白，所以此检测体系不但可用于实验动物样品中S-100蛋白的检测，而且也可用于分析临床患者体液中S-100蛋白的水平。
, 百拇医药
正常大鼠血清中含有一定浓度的S-100蛋白，提示在生理状态下S-100蛋白可释放至血液中，但其组织来源和生理功能有待阐明。大鼠垂体细胞培养上清中S-100蛋白含量测定结果提示，在垂体前叶细胞(可能是滤泡星形细胞)中，S-100蛋白可释放至细胞外，并可能参与调控垂体前叶细胞间的通讯和腺细胞分泌过程。关于LPS可减少垂体前叶细胞培养上清中S-100蛋白检出量的机制尚不清楚，有待深入研究。检测临床患者脑脊液的结果表明，非神经系统疾病患者脑脊液中S-100蛋白的量低于检测的下限；蛛网膜下腔出血患者脑脊液中S-100蛋白微有升高；脑出血患者脑脊液中，S-100蛋白显著升高，提示S-100蛋白可作为脑实质损伤的一项辅助诊断指标。但各个患者脑脊液中S-100蛋白的浓度差别较大，提示S-100蛋白可能与脑出血患者的病情变化及预后有关，这与以往的报道一致。
本实验说明，此检测体系有助于基础及临床研究S-100蛋白的生理功能。此检测体系中抗S-100βmAb可与S-100β链起反应，即与S-100a和S-100b均可起反应，故不能区分此两种蛋白。因此，检出的S-100蛋白应为S-100a和S-100b的混合物，这是此检测体系的不足之处。
, 百拇医药
致谢：本校免疫学教研室金伯泉教授和寄生虫学教研室薛采芳教授均对本工作给予了热情帮助；西京医院神经内科杨毅宁医师提供了宝贵的临床标本，在此一并谨致谢忱!
* 国家教委留学回国人员启动基金及校科研基金资助项目
作者简介：赵玉峰，男，26岁，硕士生。西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374521
参考文献
[1]Fano G, Biocca S, Fulle S. The S-100: a protein family in search of a function. Prog Neurobiol, 1995; 11:301～ 308
[2]Schafer BW. The S-100 family of EF-hand calcium binding proteins: functions and pathology. Trends Biochem Sci, 1996; 21: 134～ 140
, 百拇医药
[3]Rosen H, Rosengren L, Herlitz J, et al. Increased serum levels of the S-100 protein are associated with hypoxic brain damage after cardiac arrest. Stroke, 1998; 29: 473～ 437
[4]Schultz ES, Diepgen TL, Von Den Driesch P. Clinical and prognostic relevance of serum S-100 beta protein in malignant melanoma. Br J Dermatol, 1998; 138: 426～430
[5]Missier U, Wandinger KP, Wiesmann M, et al. Acute exacerbation of multiple sclerosis increases plasma levels of S-100 protein.Acta Neurol Scand,1997;96:142～144
, http://www.100md.com
[6]Mokuno K, Kiyosawa K, Sugimura K, et al. Prognostic value of cerebrospinal fluid neuro specific enolase and S-100b protein in Guillain Barre syndrome. Acta Neurol Scand, 1994; 89:27～30
[7]Kurono C. Intercellular communication within the rat anterior pituitary gland: VI.Development of gap junctions between folliculo-stellate cells under the influence of ovariectomy and sex steroids in the female rat. Anat Rec, 1996; 244: 366～373
, http://www.100md.com
[8]Ishikawa H, Nogami H, Shirasawa N. Novel clonal strains from adult rat anterior pituitary producing S-100 protein. Nature, 1983; 303: 711～ 713
[9]Green AJ, Keir C, Thompson EJ. A specific and sensitive ELISA for measuring S 100b in cerebrospinal fluid. J Immunol Methods, 1997; 205: 35～41
收稿：1998-12-30
修回：1999-02-10, 百拇医药
单位：赵玉峰，张万会，朱运龙，胡玉珍，陈健康：第四军医大学，生理学教研室；李琦：免疫学教研室，西安，710031；安书成：陕西师范大学生命科学学院。
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990229S-100蛋白是1965年由Moore发现并命名的一组酸性钙结合蛋白，相对分子质量(Mr)约为20000,由α链和β链组成。根据组合方式，S-100可分为S-100a(αβ)，S-100b(ββ)和S-100ao(αα)3种基本亚型。S-100的分布具有组织特异性，S-100a主要见于神经组织中的神经元，S-100b主要见于胶质细胞中，S-100ao则主要存在于心脏、横纹肌和肾脏等组织[1]。
S-100作为病理学标志性蛋白，已用于黑色素瘤、神经胶质瘤、脊索瘤及脂肪瘤等的病理诊断。近期发现，体液中S-100蛋白的含量在许多疾病时可发生变化，如阿尔采末病、Down's综合征及癫痫患者的脑脊液[2]、缺血性脑损伤患者的脑脊液及血液[3]、转移性黑色素瘤[4]和脱髓鞘性疾病[5,6](如多发性硬化症、格林巴利综合征)患者的血清中，S-100蛋白的浓度均升高，且升高程度与神经组织损伤的严重性呈正相关。上述资料表明，S-100蛋白(特别是S-100b)在神经组织的病理及病理生理过程中起着一定的作用，并可作为神经组织疾病辅助诊断和预后的一项重要指标。
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在离体条件下，S-100蛋白不但存在于细胞内,也可分泌至胞外，如C6胶质瘤细胞株在生长过程中可分泌S-100蛋白[1]。S-100蛋白可促进培养的神经元轴突生长和维持神经元存活，并刺激C6胶质瘤细胞株和黑色素瘤细胞株M14，M15和M19的增殖[1]。这些现象提示，S-100蛋白在细胞间通讯中也起着重要作用，并可能与肿瘤的发生、发展有一定的关系。垂体前叶中，表达S-100蛋白的滤泡星形细胞可互相连接形成网架结构，在机体内分泌状态变动时，此类细胞可出现明显的形态变化[7]。滤泡星形细胞可影响垂体前叶激素的释放，S-100蛋白在其中可能起一定的作用[8]。为深入研究S-100蛋白在细胞中的合成、分泌及其作用，本实验室建立了一种灵敏、特异、结果可靠的检测S-100蛋白的双抗体夹心ELISA法。
1 材料和方法
1.1 材料 牛S-100b蛋白及小鼠抗牛S-100βmAb，均购自Sigma公司。兔抗牛S-100PcAb，购自Dako公司。羊抗兔IgG-HRP购自华美公司。ABTS为美国AMERISCO产品。酶标板为Nunc公司产品。牛血清白蛋白由上海生物制品厂制备。酶标仪为BioRAD550型。
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1.2 方法
1.2.1 S-100蛋白检测方法的建立 采用双抗体夹心ELISA法。具体步骤是：用抗S-100mAb(40mg/L)包被酶标板，4℃包被48h。洗涤液(PBS+0.05%Tween20)洗涤3次，加入标准品(牛S-100b蛋白)及待检样品，37℃作用1h。洗板，加入S-100PcAb(1∶5000)，4℃过夜再置室温1h，洗板同前。加入IgG-HRP(1∶700)，37℃作用1h。洗板，加入显色液(底物液10ml+ABTS5mg+3%H2O220μl)，37℃显色15～30min后读记A410值。实验中以稀释液作为阴性对照，测定10孔，取平均值，以大于平均值的2.1倍作为阳性判断标准确定最低检测值。
1.2.2 标准曲线的绘制 用0.1%PBSA(PBS+0.1%白蛋白)将S-100b蛋白自16μg/L起，2倍连续稀释至0.016μg/L，每个浓度加3孔，测定A410值。以A410平均值为纵座标，S-100b蛋白浓度为横座标绘制标准曲线。
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1.2.3 特异性鉴定 以抗S-100mAb包被酶标板，分别加入IL-6，IL-1，P物质，GH和ACTH等物质，每种样品均设复孔测定A410值，并与阴性对照值做比较，观察有无交叉反应。
1.2.4 可信度测定 将S-100蛋白标准品在同一块板上分别测定16孔，另将同一样品在不同时间加入酶标板中，每板分别测定8孔，共测定5次，然后分别计算变异系数(CV)。
1.2.5 S-100蛋白的检测 抽取正常SD大鼠血清。收获胰酶消化的大鼠垂体前叶、后叶细胞，调整至3×105/ml，按200μl/孔种植于96孔培养板中培养，于第2天收集细胞培养上清。脑脊液标本由西京医院神经内科提供(10例为蛛网膜下腔出血，8例为脑出血，7例为非神经系统疾病)，上述检样均冻存于-20℃待检。按1.2.1的方法进行检测，各检样均作复孔测定。
1.2.6 PLS对S-100蛋白释放的影响 按1.2.5的方法培养大鼠垂体前叶细胞。24h后，按1mg/L的浓度加入LPS。再培养24h后，收集细胞培养上清，检测S-100蛋白量的变化。
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2 结果
2.1 检测体系最佳条件的确定
2.1.1 包被抗体的选择 分别用抗S-100蛋白的mAb和PcAb作为包被抗体，做双抗体夹心ELISA并绘制标准曲线。结果表明，以mAb作为包被抗体时，灵敏度高、可测范围宽。
2.1.2 抗体浓度的确定 将S-100蛋白标准品自1mg/L起，10倍连续稀释至1ng/L，作为包被抗体的抗S-100βmAb取3个浓度(40mg/L，20mg/L,10mg/L)；作为夹心抗体的S-100PcAb取3个浓度(1∶3000,1∶5000和1∶10000)；酶标抗体稀释度为1∶700，采用棋盘滴定法确定抗体的最佳浓度。当包被抗体为40mg/L，检测抗体为1∶5000时，标准曲线的线性关系最佳，阴性对照值最小，灵敏度最高，结果较为理想。
2.1.3 反应时间的确定 于4℃包被48h，抗体可最大限度地吸附于酶标板上，抗原、抗体反应在37℃下1h即可达到平衡。但因抗S-100PcAb的亲和力较抗S-100mAb差，为了提高测定体系的灵敏度，在加入S-100PcAb后，将反应时间延长为4℃过夜再室温1h，以利于抗原、抗体最大限度地结合。结果表明，所获标准曲线最佳，且未增强非特异性吸附。
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2.2 测定体系的指标
2.2.1 标准曲线 以吸光度为纵坐标，以S-100b蛋白浓度为横座标，绘制的标准曲线，如图1所示。
图1 S-100蛋白β链ELISA检测方法的标准曲线
2.2.2 灵敏度 应用本文建立的ELISA法，可检出S-100蛋白的最低含量为0.03μg/L。
2.2.3 精确度 将S-100蛋白标准品在同一块板上，分别测定数孔及于不同时间测定5次。结果表明，前一种情况的CV为6.4%，后一种情况为12.5%。
2.2.4 特异性 分别加入IL-6，IL-1，P物质，GH和ACTH孔的A410值，与阴性对照孔的A410值相比较，经统计学处理无明显差别(P>0.05)，表明S-100蛋白与这些物质均无交叉反应。
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2.3 三种样品中S-100蛋白的检测 正常大鼠血清及垂体前、后叶细胞培养上清中，S-100蛋白的检测结果见表1；患者脑脊液中S-100蛋白的检测结果见图2。
表1 大鼠血清和垂体细胞培养上清中S-100蛋白的检测
样本来源
例数
(n)
±SD(μg/L)
检测范围
(μg/L)
血清
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12
0.71±0.30
0.25-1.30
垂体前叶培养上清
5
0.27±0.01
0.17-0.39
垂体后叶培养上清
5
0.65±0.10
0.54-0.76
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图2 LPS对垂体前叶细胞培养上清中S-100蛋白的影响
2.4 LPS对S-100蛋白检出的影响 培养第2天的大鼠垂体前叶细胞的上清中，含有少量的S-100蛋白(约为0.27μg/L)，加入LPS的培养上清中，S-100蛋白的含量明显减少。而在标准品中加入1mg/LLPS绘制的标准曲线，与未加LPS的标准品绘制的标准曲线完全一致(图略)，说明培养上清中S-100蛋白检出量的减少不是测定方法的原因，而是LPS对培养的垂体前叶细胞作用的结果。经4次独立实验结果完全一致，图3是其中的结果之一。
图3 临床患者脑脊液中S-100蛋白的检测
3 讨论
S-100蛋白作为组织标识物，已在病理学等领域得到广泛应用。近来倍受关注的是体液中S-100蛋白的含量与疾病之间的关系，但国内未见有S-100蛋白检测方法的报道。为此,本室采用两种商品化的抗S-100蛋白抗体成功地建立了此检测体系。在S-100蛋白的研究中，已建立了荧光标记、放免分析和酶联免疫试验等检测体系。这些检测方法在灵敏度、特异性和应用范围上差别很大。本检测体系的灵敏度为0.03μg/L，与国外研究者Green等[9]的报道相近。其中，购于Sigma公司的抗S-100βmAb具有高度的特异性,与其它EF-hand家族钙结合蛋白无交叉反应，保证了检测体系的高度特异性。S-100蛋白具有种属保守性，抗S-100蛋白抗体可识别人、牛、猪、兔、和大鼠来源的S-100蛋白，所以此检测体系不但可用于实验动物样品中S-100蛋白的检测，而且也可用于分析临床患者体液中S-100蛋白的水平。
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正常大鼠血清中含有一定浓度的S-100蛋白，提示在生理状态下S-100蛋白可释放至血液中，但其组织来源和生理功能有待阐明。大鼠垂体细胞培养上清中S-100蛋白含量测定结果提示，在垂体前叶细胞(可能是滤泡星形细胞)中，S-100蛋白可释放至细胞外，并可能参与调控垂体前叶细胞间的通讯和腺细胞分泌过程。关于LPS可减少垂体前叶细胞培养上清中S-100蛋白检出量的机制尚不清楚，有待深入研究。检测临床患者脑脊液的结果表明，非神经系统疾病患者脑脊液中S-100蛋白的量低于检测的下限；蛛网膜下腔出血患者脑脊液中S-100蛋白微有升高；脑出血患者脑脊液中，S-100蛋白显著升高，提示S-100蛋白可作为脑实质损伤的一项辅助诊断指标。但各个患者脑脊液中S-100蛋白的浓度差别较大，提示S-100蛋白可能与脑出血患者的病情变化及预后有关，这与以往的报道一致。
本实验说明，此检测体系有助于基础及临床研究S-100蛋白的生理功能。此检测体系中抗S-100βmAb可与S-100β链起反应，即与S-100a和S-100b均可起反应，故不能区分此两种蛋白。因此，检出的S-100蛋白应为S-100a和S-100b的混合物，这是此检测体系的不足之处。
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致谢：本校免疫学教研室金伯泉教授和寄生虫学教研室薛采芳教授均对本工作给予了热情帮助；西京医院神经内科杨毅宁医师提供了宝贵的临床标本，在此一并谨致谢忱!
* 国家教委留学回国人员启动基金及校科研基金资助项目
作者简介：赵玉峰，男，26岁，硕士生。西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374521
参考文献
[1]Fano G, Biocca S, Fulle S. The S-100: a protein family in search of a function. Prog Neurobiol, 1995; 11:301～ 308
[2]Schafer BW. The S-100 family of EF-hand calcium binding proteins: functions and pathology. Trends Biochem Sci, 1996; 21: 134～ 140
, 百拇医药
[3]Rosen H, Rosengren L, Herlitz J, et al. Increased serum levels of the S-100 protein are associated with hypoxic brain damage after cardiac arrest. Stroke, 1998; 29: 473～ 437
[4]Schultz ES, Diepgen TL, Von Den Driesch P. Clinical and prognostic relevance of serum S-100 beta protein in malignant melanoma. Br J Dermatol, 1998; 138: 426～430
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收稿：1998-12-30
修回：1999-02-10, 百拇医药