靶肌肉注射睫状神经营养因子促周围神经再生的功能评价
作者：韩久卉 张经歧 张英泽 田德虎
单位：韩久卉(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)；张经歧(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)；张英泽(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)；田德虎(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)
关键词：周围神经；神经再生；睫状神经营养因子；功能评价
中国修复重建外科杂志000208 摘 要：目的 评价靶肌肉注射睫状神经营养因子(CNTF)对受损周围神经功能恢复的影响。方法 用硅胶管桥接80只大鼠左侧坐骨神经长6 mm缺损，随机分为两组，分别行CNTF、生理盐水(NS)靶肌肉注射。术后行坐骨神经功能指数(SFI)测定、电生理检测、轴突图像分析及霍乱毒素-辣根过氧化物酶(CB-HRP)逆行追踪。结果 CNTF组SFI恢复率、各项电生理及轴突图像分析指标、CB-HRP标记的脊髓前角运动细胞数明显优于NS组。结论 靶肌肉注射CNTF可明显促进周围神经再生和神经功能恢复。
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A FUNCTIONAL EVALUATION ON PERIPHERAL NERVE REGENERATION ENHANCED BY TARGETED MUSCULAR INJECTION OF CILIARY NEUROTROPHIC FACTOR
HAN Jiu-hui ZHANG Jing-qi ZHANG Ying-ze et al.
(Department of Hand Surgery, the Third Hospital of Hebei Medical University. Shijiazhuang Hebei, P.R.China 050051)
Abstract：Objective To investigate the effects of targeted muscular injection of ciliary neurotrophic factor (CNTF) on the regeneration of injuried peripheral nerves.Methods The left sciatic nerves of 80 Sprague-Dawley rats were excised to form 6 mm defect and the two ends were bridged by silicone tubes, they were randomly divided into two groups, CNTF group and normal saline (NS) group. The CNTF group was given recombinant human CNTF， 1mg/kg every other day for 30 days， and the NS group was given equal quantity of normal saline as NS group. The sciatic nerve functional index (SFI), electrophysiological assessment, morphometric analysis of axons, and choleratoxin horseradish peroxidase (CB-HRP) retrograde-labelling were measured postoperatively.Results The SFI, electrophysiological parameters (nerve conduction velocity, latency and amplitude of compound muscle action potentials), myelinated axons counts, mean axons diameters and myelin sheath thickness,number of CB-HRP labelled ventral horn motor neurons of spinal cord were significantly higher in CNTF group than that of NS group.Conclusion Targeted muscular injection of CNTF can promote the regeneration of peripheral nerve and improve the nerve functional recovery.
, 百拇医药
Key words：Peripheral nerve Nerve regeneration Ciliary neurotrophic factor Functional evaluation▲
近年来发现睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)能促进运动神经轴突再生[1～3]。但其给药途径单一，且缺乏对受损神经功能恢复的直接评价。我们利用大鼠坐骨神经损伤模型，将基因重组人CNTF注射入坐骨神经支配的肌肉，观察其对神经再生的影响，旨在从神经功能的恢复方面评价CNTF对神经再生的促进作用，同时为CNTF提供又一给药途径。
1 材料与方法
1.1 动物分组及手术方法
选SD大鼠80只，体重180～220 g。左侧大腿后部正中切口，显露坐骨神经，在梨状肌下缘10 mm处切除长5 mm的一段神经。在10倍手术显微镜下以9/0无创针线将神经两断端分别套入长10 mm的硅胶管中(外径2.0 mm，内径1.5 mm)，神经两断端间相距6 mm。术后将动物随机分成两组，每组40只。一组从术后第1天开始，于左胫前肌及腓肠肌注射CNTF 1 mg/kg[4]，隔日一次，至术后30天，即CNTF组；另一组同时在肌肉内注入等量生理盐水(normal saline,NS)，即NS组。
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1.2 观察指标
1.2.1 坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index,SFI) 采用沈宁江等[5]的改良方法于术前及术后每10天测定一次大鼠实验足(E)及正常足(N)的足印长度(PL)、足趾宽度(TS)及中间足趾距离(IT)，至术后3个月。将数据代入Bain公式，计算SFI。
SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT)]-8.8
1.2.2 电生理检测 术后90天用DISA 1500型肌电诱发电位仪检测坐骨神经传导速度、复合肌肉动作电位的潜伏期和波幅。
1.2.3 轴突图像分析 术后90天在吻合口的远端2 mm处取长2 mm神经段，按电镜切片要求包埋，半超薄切片，甲苯胺蓝染色，用Mias-1000图像分析系统做图像分析，计数有髓神经纤维数目、直径及髓鞘厚度。
, 百拇医药
1.2.4 霍乱毒素-辣根过氧化物酶(choleratoxin horseradish peroxidase,CB-HRP)逆行标记 将30% CB-HRP 15 μl多点注入术后90天及正常大鼠腓肠肌中，存活72小时后行心脏灌流固定。取腰骶髓做横断面冰冻切片，经HRP-TMB孵育成色、贴片复染后，光镜下计数正常组、CNTF组和NS组被标记的脊髓前角运动细胞数。
1.3 统计学方法
实验所得数据均采用配对t检验方法进行统计学处理。
2 结果
2.1 坐骨神经功能指数
CNTF组术后SFI的恢复率明显高于NS组，经统计学处理有显著性差异(P<0.01)，结果见附图。
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附图 CNTF组与NS组术后SFI恢复情况比较
Fig. Comparison of the recovery of SFI after sciatic transection in CNTF group and NS group
2.2 电生理检测
CNTF组潜伏期为(2.20±0.95) ms，传导速度为(34.48±5.50) m/s，波幅为(6.10±2.74) mV；NS组潜伏期为(3.07±1.04) ms，传导速度为(19.67±6.55) m/s，波幅为(3.20±1.30) mV。两组之间比较有显著性差异(P<0.01)。
2.3 轴突图像分析
CNTF组再生神经远段，有髓神经纤维轴突数目为(3 590.00±427.92) 条/mm2，轴突直径为(3.95±0.42) μm，髓鞘厚度为(1.33±0.13) μm。NS组有髓神经纤维轴突数目为(2 048.00±414.87) 条/mm2，轴突直径为(2.88±0.53) μm，髓鞘厚度为(0.98±0.20) μm。两组之间比较均有显著性差异(P<0.01)。
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2.4 霍乱毒素-辣根过氧化物酶逆行神经标记
被CB-HRP标记的脊髓前角运动细胞集中在腰3～腰5节段前角外侧核。正常组标记的细胞数为(54.38±8.68) 个，CNTF组为(50.40±11.52) 个，两组之间比较无显著性差异(P>0.05)。NS组为(26.62±6.29) 个，CNTF组比NS组标记的细胞数多，两组之间比较有显著性差异(P<0.01)，且CNTF组细胞色深，突起较多、较长。
3 讨论
周围神经切断后，神经远段CNTF免疫反应性、生物活性及mRNA水平急剧降低，当出现轴突再生和髓鞘形成时，CNTF mRNA水平才开始上调[1]。这种现象提示早期局部补充外源性CNTF可弥补损伤部位CNTF的含量不足，而增加对受损神经的营养支持作用。目前的给药途径主要是一次性将微量的CNTF水溶液注入再生室中，但存在溶液从管两端漏出及CNTF在水溶液中生物活性丧失等问题。渗透性缓释药泵可解决这些问题，但成本高，对组织创伤大，不易普及。将CNTF注射于坐骨神经支配的腓肠肌及胫前肌内，与其他部位的肌肉注射一样，在一定时间内，一部分药物被吸收入血，提高其血浆浓度；另一部分药物未被吸收而滞留于局部，提高该部位CNTF水平，在靶组织内形成较明显的CNTF浓度差。这种浓度差可引导轴突生长。神经末梢可不断从靶器官中摄取CNTF，逆行输送到神经再生室，CNTF在再生室内始终保持一定浓度，并经逆向轴流输送到脊髓前角受损神经元胞体发挥营养支持作用，减缓受损神经逆行性变性，从而使再生速度加快，并且减少轴突数的损失和其直径的缩小。同时，这些因素还可导致迅速的轴突-雪旺细胞间的相互作用及轴突的再髓鞘化过程，促进再生神经纤维的成熟。
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组织形态学及免疫组织化学等方法评价周围神经再生均不涉及确切的功能，也就是说这些研究结果并不一定与功能恢复程度相一致。有学者指出，受损神经近端轴突侧支芽生可使许多小轴突长过吻合口，但有些轴突刚通过吻合口就终止于瘢痕组织或神经瘤，而不能到达靶肌肉；有些运动轴突可能误长入感觉神经鞘。在这些情况下，再生轴突无益于神经功能的恢复，而只是改变了再生神经横断面积及轴突计数[6]，影响形态学评价神经再生的实际价值。多年来，电生理方法在评价周围神经再生方面的临床应用一直较为广泛，对其能判断神经再生已达成共识，我们的电生理观察结果也支持这一点。但对电生理检查能否评价再生神经所支配的靶器官的功能恢复情况存在着不同观点。肖颖峰等[7]最近通过兔腓总神经损伤后神经再生模型观察到，肌肉动作电位的振幅及神经肌肉传导速度与肌力之间存在密切的直线相关，认为神经肌肉电生理检查能早期判断损伤神经修复后其靶器官的功能恢复情况。但有些学者发现电生理评价结果与功能恢复程度有较大的差异。
Bain等对大鼠神经损伤后测定行走轨迹的因子进行了多元线性回归分析，修正了以前使用的SFI，使SFI计算公式更加完善、准确、可靠。SFI除反映下肢肌力恢复情况外，还可反映下肢各肌肉间的协调功能，并能随时动态观察，不需处死动物，认为是非常有价值的评价坐骨神经再生的检查方法。
, 百拇医药
我们实验测定SFI并结合电生理、轴突图像分析和CB-HRP逆行追踪，全面完整地评价了神经再生情况，表明靶肌肉注射CNTF能明显促进再生神经结构成熟及功能恢复。但CNTF的最佳剂量及给药时间尚需进一步探索。
基金项目：河北省科委指令性课题基金资助项目(9621622D)
参考文献：
[1]Richardson PM.Ciliary neurotrophic factors. Pharmacol Ther,1994;63(2)：187
[2]许家军，何成.睫状神经营养因子，神经生长因子对周围神经再生的作用.中华手外科杂志，1997；13(1)：16
[3]Sahenk Z, Seharaseyon J, Mendell JR. CNTF potentiates peripheral nerve regeneration. Brain Res,1994;655：246
, http://www.100md.com
[4]何成，陈江野，陆长林，等.人睫状神经营养因子基因在大肠杆菌中的表达.生物化学与生物物理学报，1995；27(6)：675
[5]沈宁江，朱家恺.坐骨神经指数在神经功能评价中的应用.中华显微外科杂志，1993；16(4)：284
[6]Hare GMT,Evans PJ, Mackinnon SE, et al. Walking track analysis: A long term assessment of peripheral nerve recovery. Plast Reconstr Surg,1992;89：251
[7]肖颖峰，洪光祥，王发斌，等.电生理检查对再生运动神经功能恢复评价的实验研究.中国修复重建外科杂志，1998；12(6)：367
收稿日期：1998-10-06
修改日期：1999-06-01, 百拇医药
单位：韩久卉(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)；张经歧(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)；张英泽(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)；田德虎(河北医科大学第三医院手外科，石家庄，050051)
关键词：周围神经；神经再生；睫状神经营养因子；功能评价
中国修复重建外科杂志000208 摘 要：目的 评价靶肌肉注射睫状神经营养因子(CNTF)对受损周围神经功能恢复的影响。方法 用硅胶管桥接80只大鼠左侧坐骨神经长6 mm缺损，随机分为两组，分别行CNTF、生理盐水(NS)靶肌肉注射。术后行坐骨神经功能指数(SFI)测定、电生理检测、轴突图像分析及霍乱毒素-辣根过氧化物酶(CB-HRP)逆行追踪。结果 CNTF组SFI恢复率、各项电生理及轴突图像分析指标、CB-HRP标记的脊髓前角运动细胞数明显优于NS组。结论 靶肌肉注射CNTF可明显促进周围神经再生和神经功能恢复。
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A FUNCTIONAL EVALUATION ON PERIPHERAL NERVE REGENERATION ENHANCED BY TARGETED MUSCULAR INJECTION OF CILIARY NEUROTROPHIC FACTOR
HAN Jiu-hui ZHANG Jing-qi ZHANG Ying-ze et al.
(Department of Hand Surgery, the Third Hospital of Hebei Medical University. Shijiazhuang Hebei, P.R.China 050051)
Abstract：Objective To investigate the effects of targeted muscular injection of ciliary neurotrophic factor (CNTF) on the regeneration of injuried peripheral nerves.Methods The left sciatic nerves of 80 Sprague-Dawley rats were excised to form 6 mm defect and the two ends were bridged by silicone tubes, they were randomly divided into two groups, CNTF group and normal saline (NS) group. The CNTF group was given recombinant human CNTF， 1mg/kg every other day for 30 days， and the NS group was given equal quantity of normal saline as NS group. The sciatic nerve functional index (SFI), electrophysiological assessment, morphometric analysis of axons, and choleratoxin horseradish peroxidase (CB-HRP) retrograde-labelling were measured postoperatively.Results The SFI, electrophysiological parameters (nerve conduction velocity, latency and amplitude of compound muscle action potentials), myelinated axons counts, mean axons diameters and myelin sheath thickness,number of CB-HRP labelled ventral horn motor neurons of spinal cord were significantly higher in CNTF group than that of NS group.Conclusion Targeted muscular injection of CNTF can promote the regeneration of peripheral nerve and improve the nerve functional recovery.
, 百拇医药
Key words：Peripheral nerve Nerve regeneration Ciliary neurotrophic factor Functional evaluation▲
近年来发现睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)能促进运动神经轴突再生[1～3]。但其给药途径单一，且缺乏对受损神经功能恢复的直接评价。我们利用大鼠坐骨神经损伤模型，将基因重组人CNTF注射入坐骨神经支配的肌肉，观察其对神经再生的影响，旨在从神经功能的恢复方面评价CNTF对神经再生的促进作用，同时为CNTF提供又一给药途径。
1 材料与方法
1.1 动物分组及手术方法
选SD大鼠80只，体重180～220 g。左侧大腿后部正中切口，显露坐骨神经，在梨状肌下缘10 mm处切除长5 mm的一段神经。在10倍手术显微镜下以9/0无创针线将神经两断端分别套入长10 mm的硅胶管中(外径2.0 mm，内径1.5 mm)，神经两断端间相距6 mm。术后将动物随机分成两组，每组40只。一组从术后第1天开始，于左胫前肌及腓肠肌注射CNTF 1 mg/kg[4]，隔日一次，至术后30天，即CNTF组；另一组同时在肌肉内注入等量生理盐水(normal saline,NS)，即NS组。
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1.2 观察指标
1.2.1 坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index,SFI) 采用沈宁江等[5]的改良方法于术前及术后每10天测定一次大鼠实验足(E)及正常足(N)的足印长度(PL)、足趾宽度(TS)及中间足趾距离(IT)，至术后3个月。将数据代入Bain公式，计算SFI。
SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT)]-8.8
1.2.2 电生理检测 术后90天用DISA 1500型肌电诱发电位仪检测坐骨神经传导速度、复合肌肉动作电位的潜伏期和波幅。
1.2.3 轴突图像分析 术后90天在吻合口的远端2 mm处取长2 mm神经段，按电镜切片要求包埋，半超薄切片，甲苯胺蓝染色，用Mias-1000图像分析系统做图像分析，计数有髓神经纤维数目、直径及髓鞘厚度。
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1.2.4 霍乱毒素-辣根过氧化物酶(choleratoxin horseradish peroxidase,CB-HRP)逆行标记 将30% CB-HRP 15 μl多点注入术后90天及正常大鼠腓肠肌中，存活72小时后行心脏灌流固定。取腰骶髓做横断面冰冻切片，经HRP-TMB孵育成色、贴片复染后，光镜下计数正常组、CNTF组和NS组被标记的脊髓前角运动细胞数。
1.3 统计学方法
实验所得数据均采用配对t检验方法进行统计学处理。
2 结果
2.1 坐骨神经功能指数
CNTF组术后SFI的恢复率明显高于NS组，经统计学处理有显著性差异(P<0.01)，结果见附图。
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附图 CNTF组与NS组术后SFI恢复情况比较
Fig. Comparison of the recovery of SFI after sciatic transection in CNTF group and NS group
2.2 电生理检测
CNTF组潜伏期为(2.20±0.95) ms，传导速度为(34.48±5.50) m/s，波幅为(6.10±2.74) mV；NS组潜伏期为(3.07±1.04) ms，传导速度为(19.67±6.55) m/s，波幅为(3.20±1.30) mV。两组之间比较有显著性差异(P<0.01)。
2.3 轴突图像分析
CNTF组再生神经远段，有髓神经纤维轴突数目为(3 590.00±427.92) 条/mm2，轴突直径为(3.95±0.42) μm，髓鞘厚度为(1.33±0.13) μm。NS组有髓神经纤维轴突数目为(2 048.00±414.87) 条/mm2，轴突直径为(2.88±0.53) μm，髓鞘厚度为(0.98±0.20) μm。两组之间比较均有显著性差异(P<0.01)。
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2.4 霍乱毒素-辣根过氧化物酶逆行神经标记
被CB-HRP标记的脊髓前角运动细胞集中在腰3～腰5节段前角外侧核。正常组标记的细胞数为(54.38±8.68) 个，CNTF组为(50.40±11.52) 个，两组之间比较无显著性差异(P>0.05)。NS组为(26.62±6.29) 个，CNTF组比NS组标记的细胞数多，两组之间比较有显著性差异(P<0.01)，且CNTF组细胞色深，突起较多、较长。
3 讨论
周围神经切断后，神经远段CNTF免疫反应性、生物活性及mRNA水平急剧降低，当出现轴突再生和髓鞘形成时，CNTF mRNA水平才开始上调[1]。这种现象提示早期局部补充外源性CNTF可弥补损伤部位CNTF的含量不足，而增加对受损神经的营养支持作用。目前的给药途径主要是一次性将微量的CNTF水溶液注入再生室中，但存在溶液从管两端漏出及CNTF在水溶液中生物活性丧失等问题。渗透性缓释药泵可解决这些问题，但成本高，对组织创伤大，不易普及。将CNTF注射于坐骨神经支配的腓肠肌及胫前肌内，与其他部位的肌肉注射一样，在一定时间内，一部分药物被吸收入血，提高其血浆浓度；另一部分药物未被吸收而滞留于局部，提高该部位CNTF水平，在靶组织内形成较明显的CNTF浓度差。这种浓度差可引导轴突生长。神经末梢可不断从靶器官中摄取CNTF，逆行输送到神经再生室，CNTF在再生室内始终保持一定浓度，并经逆向轴流输送到脊髓前角受损神经元胞体发挥营养支持作用，减缓受损神经逆行性变性，从而使再生速度加快，并且减少轴突数的损失和其直径的缩小。同时，这些因素还可导致迅速的轴突-雪旺细胞间的相互作用及轴突的再髓鞘化过程，促进再生神经纤维的成熟。
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组织形态学及免疫组织化学等方法评价周围神经再生均不涉及确切的功能，也就是说这些研究结果并不一定与功能恢复程度相一致。有学者指出，受损神经近端轴突侧支芽生可使许多小轴突长过吻合口，但有些轴突刚通过吻合口就终止于瘢痕组织或神经瘤，而不能到达靶肌肉；有些运动轴突可能误长入感觉神经鞘。在这些情况下，再生轴突无益于神经功能的恢复，而只是改变了再生神经横断面积及轴突计数[6]，影响形态学评价神经再生的实际价值。多年来，电生理方法在评价周围神经再生方面的临床应用一直较为广泛，对其能判断神经再生已达成共识，我们的电生理观察结果也支持这一点。但对电生理检查能否评价再生神经所支配的靶器官的功能恢复情况存在着不同观点。肖颖峰等[7]最近通过兔腓总神经损伤后神经再生模型观察到，肌肉动作电位的振幅及神经肌肉传导速度与肌力之间存在密切的直线相关，认为神经肌肉电生理检查能早期判断损伤神经修复后其靶器官的功能恢复情况。但有些学者发现电生理评价结果与功能恢复程度有较大的差异。
Bain等对大鼠神经损伤后测定行走轨迹的因子进行了多元线性回归分析，修正了以前使用的SFI，使SFI计算公式更加完善、准确、可靠。SFI除反映下肢肌力恢复情况外，还可反映下肢各肌肉间的协调功能，并能随时动态观察，不需处死动物，认为是非常有价值的评价坐骨神经再生的检查方法。
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我们实验测定SFI并结合电生理、轴突图像分析和CB-HRP逆行追踪，全面完整地评价了神经再生情况，表明靶肌肉注射CNTF能明显促进再生神经结构成熟及功能恢复。但CNTF的最佳剂量及给药时间尚需进一步探索。
基金项目：河北省科委指令性课题基金资助项目(9621622D)
参考文献：
[1]Richardson PM.Ciliary neurotrophic factors. Pharmacol Ther,1994;63(2)：187
[2]许家军，何成.睫状神经营养因子，神经生长因子对周围神经再生的作用.中华手外科杂志，1997；13(1)：16
[3]Sahenk Z, Seharaseyon J, Mendell JR. CNTF potentiates peripheral nerve regeneration. Brain Res,1994;655：246
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[4]何成，陈江野，陆长林，等.人睫状神经营养因子基因在大肠杆菌中的表达.生物化学与生物物理学报，1995；27(6)：675
[5]沈宁江，朱家恺.坐骨神经指数在神经功能评价中的应用.中华显微外科杂志，1993；16(4)：284
[6]Hare GMT,Evans PJ, Mackinnon SE, et al. Walking track analysis: A long term assessment of peripheral nerve recovery. Plast Reconstr Surg,1992;89：251
[7]肖颖峰，洪光祥，王发斌，等.电生理检查对再生运动神经功能恢复评价的实验研究.中国修复重建外科杂志，1998；12(6)：367
收稿日期：1998-10-06
修改日期：1999-06-01, 百拇医药