激光扫描共聚焦显微镜观察血小板内钙离子浓度的变化
作者：丛玉隆 王俊玫 李 楠 于立方
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院
关键词：血小板；激光扫描共聚焦显微镜检查
中华医学杂志970915 目的 观察血小板内钙离子浓度的变化及细胞外钙离子对其影响，为探讨血小板内Ca++与疾病的关系及阐明药物作用机制提供理论依据。方法 用不同浓度的二磷酸腺苷(ADP)、5-羟色胺(5-HT)、花生四烯酸、瑞斯托霉素、胶原、凝血酶诱导血小板，通过激光扫描共聚焦显微镜观察标记了Fluo-3的单个血小板内钙离子变化，以及细胞外钙离子对其影响。结果 (1) 除凝血酶外，其余诱导剂均可引起血小板钙离子浓度变化，且随着诱导剂浓度增加，钙波动频率增加，持续时间延长；(2) ADP引起的血小板钙波动，在细胞外无钙离子时，只是幅度减少，而无频率变化；(3) 5-HT引起的钙波动，在细胞外无钙时，波动消失。结论 (1)ADP、5-HT、花生四烯酸、瑞斯托霉素、胶原可引起血小板产生钙浓度变化。(2) 不同诱导剂诱发的钙波动，其钙离子来源不同。
, http://www.100md.com
Platelet calcium oscillation by laser scanning confocal microscopy Cong Yulong, Wang Junmei, LiNan et al. General Hospital of PLA Beijing, 100853
Objective To observe platelet calcium oscillation and the influence of extracellular Ca2+ on it. Methods We observed a single platelet intracellular Ca++ change and the influence of extracellular Ca2+ on it by laser sanning confocal microscopy when various agonists of different concentrations stimulated platelets. Results The other agonists except thrombin induced platelet calcium oscillation. With increasing agonis concentrations, the frequence of calcium oscillation enhanced and calcium oscillation sustained longer. In the absence of Ca++, the amplitude of ADP-induced calcium oscillation was smaller without frequence variations, and 5-TH induced calcium oscillation was inhibited. Conclusions Platelet calcium oscillation increased from fluctuation either in the entry of external calcium or the release from internal stores.
, 百拇医药
Key words Blood platelets Laser scanning confocalmicroscopy
(Natl Med J China, 1997, 77：687-691)
细胞内游离钙离子在血小板及其它细胞中起着第二信使的作用[1]，是细胞功能的重要调节因子。胞浆内游离钙的升高决定着血小板的形状变化，聚集和释放反应[2]。诱导剂作用时，细胞内Ca2+升高，介导细胞各种反应。在许多细胞中发现，诱导剂作用细胞时，各个细胞反应差异很大，有的表现瞬时变化，有的表现钙波动，与群体细胞的平均反应不同。为了了解诱导剂激活后单个血小板的钙离子变化，进一步阐明受体介导的钙离子动员机制。我们应用激光共聚焦显微镜[3，4]，观察标记了荧光染料Flou-3的单个活血小板加入不同诱导剂后的Ca2+变化。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、材料
1.试剂：(1) ADP：上海生物化学试剂厂产品；胶原、瑞斯托霉素和花生四烯酸(美国biopool公司产品)、凝血酶(美国Sigma公司)，5-HT和聚乙烯亚胺(日本Tsuroga Woman′s Junior Collega MiroakiN博士惠购)；A23187(美国Sigma公司产品)；EGTA(美国serva公司产品)。以上试剂均用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。(2) fluo-3/AM(美国分子探针公司产品)用二甲亚砜配成1mmol/L，置-30℃冰箱保存。(3) 无钙清洗液(g/L)：8.48gNaCl 0.37。KCl 0.25gMgSO44.7 H2O 1.98g葡萄糖2.38g MEPES0.02g Apyrase调至7.40。(4) 不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液(g/L)：8.01g NaCl1.60 Na2HPO4.12H2O 0.23g NaH2PO4，2H2O。
, 百拇医药
2.仪器：Insight plus激光扫描共聚焦显微镜(简称共焦显微镜)(美国Meridias公司)。
二、方法
1.各种诱导剂不同浓度作用血小板时的细胞内钙离子变化：取二周内未服任何药物的健康者静脉血，用3.8%枸橼酸钠以9：1比例抗凝，500 r/min离心5分钟，将富血小板血浆加入apyrase(防止血小板激活)后(终浓度0.9g/L)，再将血浆以2000 r/min离心10分钟分离获得血小板，用无钙清洗液洗涤一次并配成2×108/L的血小板悬浮液，加入终浓度为20μmol/L的fluo-3，置37℃孵育30分钟，用无钙清洗液洗涤二次。将20μl血小板悬液铺于包被了0.1%聚乙烯亚胺的超薄载玻片上，在液膜上加盖玻片延盖玻片边缘加入1 mmol Ca2+ 5μl。以此方式制备多张血小板液膜片，并在每片分别加入5、10、20 μmol/L二磷酸腺苷(ADP)，1.0、1.5、3.0g/L瑞斯托霉素，0.1、0.5g/L胶原，0.5、1.5 mmol/L花生四烯酸，1.5、4.5 mmol 5-HT，0.1、0.5U/ml凝血酶各5μl以上各片分别置于共焦显微镜下，观察细胞内Ca2+变化。
, http://www.100md.com
2.观察血小板外Ca2+对细胞内钙离子变化的影响：将染色洗涤好的血小板铺于超薄载玻片上，加入1mmol EDTA(EDTA可封密血小板膜防止细胞外钙流入血小板内)置于激光扫描共聚焦显微镜下，分别加入ADP和5-HT观察细胞内Ca2+变化。
3.共焦显微镜：采用5瓦氩离子激光，激发波长为488nm。倒置显微镜在40X物镜下动态观察血小板内Ca2+变化。在Time series程序下开始预扫描，调节扫描参数以取得最大电信号、最小光漂白和最好的信噪比，参数确定后动态扫描数据采集间隔时间为0.2秒，采集次数200次。高速微机逐幅贮存观察到的动态荧光图象并绘制钙离子荧光强度变化的曲线。
结果
1.各种诱导剂对血小板内Ca2+的作用：
, 百拇医药 在细胞外钙1mmol/L浓度条件下，在加入不同浓度，不同诱导剂后，血小板内钙波动变化(图1～8)。纵座标代表钙离子的荧光强度(钙浓度)，横座标代表钙离子变化的时间过程，箭头示加入诱导剂后。除凝血酶外均可引起血小板产生钙浓度变化，且随着诱导剂浓度的增加，钙波动频率增加，钙波动持续时间延长。
图1 在细胞外钙离子浓度为1mmol/L时分别加入1.5g/L(上图)，3.0g/L(下图)瑞斯托霉素后钙波动变化
图2 在细胞外钙离子浓度为1mmol/L时分别加入10μmol/L、20μmol/L(下图)ADP后，钙波动变化
, http://www.100md.com 图3 在细胞外钙离子浓度为1mmol/L时，加入0.5mmol/L 1.5mmol/L(下图)花生四烯酸后的钙波动变化
图4 在细胞外钙1mmol/L时，加入0.1mg/ml，0.5mg/ml胶原后钙波动变化
图5 在细胞外钙1mmol/L时，加入1.5mg/ml，4.5mg/ml(下图)5-HT后钙波动变化
图6 在细胞外钙1mmol/L时，加入0.1μl/ml，0.5μl/ml(下图)凝血酶后钙波动
, http://www.100md.com
图7 在细胞外无钙时，加入20μmol/L ADP后钙波动
图8 在细胞外无钙时，加入4.5mmol/L 5-HT后钙波动
2.细胞外Ca2+对血小板内Ca2+变化的影响：有细胞外钙存在的条件下，ADP与5-HT诱导的血小板内钙波动变化见图2，5。无细胞外钙的环境中上述诱导剂引起的变化见图7，8，可以看出ADP引起的血小板钙波动，在细胞外无钙时，只是幅度减小，而无频率变化，但5-HT引起的钙波动，在细胞外无钙时，波动消失。
讨论
自Cobbold等首次报道在非兴奋肝细胞内观察到了钙浓度变化以来，随着钙离子荧光染料的问世及监测单个细胞[Ca2+]技术的提高，在许多非兴奋细胞中发现了钙波动的变化。所谓钙波动，就是诱导剂作用使胞液Ca2+升高，然后降低，继而再升高，降低，重复多次。其作为细胞生物行为存在许多细胞中，是细胞内储存钙的周期性释放或依赖细胞外钙钙流入与流出之间平衡的周期性改变引起。
, 百拇医药
我们应用ADP、5-HT、胶原、花生四烯酸、瑞斯托霉素、凝血酶作用血小板，发现除凝血酶外，其余诱导剂可引起血小板产生钙波动现象，并随诱导剂浓度的增加，钙波动频率增加，持续时间延长(见图1～6)。Berridge认为[5]，诱导剂作用细胞时，细胞内IP3增加，IP3与细胞内钙敏感库上IP3受体结合，打开钙通道，引起细胞内Ca++]升高，当Ca++升高到一定程度时，胞液中钙离子与胞内钙不敏感库中的钙离子开始循环，产生钙波动。随着诱导剂浓度的增加，IP3生成亦增多，这可解释钙波动随诱导剂浓度增加，持续时间延长的现象。
引起钙波动机制很多，不同细胞，甚至同一细胞了存在一种或多种机制：5-HT诱导血小板产生的钙波动机制可能与蛋白激酶水平有关[6]，其它诱导剂产生的钙波动机制迄今尚不清楚。
关于钙波动，大多不依赖细胞外钙的存在，是由于细胞内储存Ca++的周期性释放造成，也有少数依赖细胞外钙，由于钙流入与流出之间平衡的周期性改变引起。由图2、7结果推测，ADP诱发的钙波动主要来自细胞内钙动员，而不是通过胞浆膜的钙通道的钙流所起作用。每一周期，细胞内钙池释放Ca2+进入胞浆，接着，又聚集了大部或全部的释放Ca2+。而5-HT诱发的钙波动依赖细胞外钙的存在。可能胞外钙影响着胞内钙池的填充。可见不同诱导剂作用，引起血小板钙波动的Ca2+来源不同。
, http://www.100md.com
不少研究表明，钙波动可以作为细胞内信号控制各种生理过程。钙波动减少了持续高钙导致的细胞损害，降低了由钙泵ATP酶产生的能量的利用，也可避免诱导剂长时间刺激引起的脱敏现象，调节依赖蛋白的磷酸化和脱磷酸化[7]。尽管血小板钙波动的频率对其功能的调节的作用还不清楚，但不能否认这种机制的存在。
参考文献
1 Radmussen H. The calcium messenger system. N Engl J Med,1986，314：1094.
2 Rink TJ, Smith SW, Tsien RY. Cytoplasmic free Ca++ in human platelets: Ca++ thresholds and Ca- independent activation for shape-change and secretion. FEBS, 1982，148：21.
, 百拇医药
3 丛玉隆.激光共焦显微术对血小板钙浓度变化及功能的探讨.中华医学检验杂志，1996，19：3
4 Gundo HR Rao G. Jamed G white. Monitoring signal transduction and cytosleleton alteration by fluorescent imaging and confocal microscopy. Ann New York Aca Sci, 1994, 774：297.
5 Berridge MJ. Inositol trisphosphate-induced membrane potential oscillations in Xenopus occytes. J Physiol, 1988, 403：589.
6 Nisho H, Ikegami Y, Segawa T. Fluorescence digital image analysis of serotonin-induced calcium oscillations in single blood platelets. Cell Calcium, 1991, 12：177.
7 Jacob R. Calcium oscillations in electrically non-excitable cells. Biochem Biophys Acta, 1990, 1052：427.
(收稿：1997-01-10 修回：1997-05-22), 百拇医药
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院
关键词：血小板；激光扫描共聚焦显微镜检查
中华医学杂志970915 目的 观察血小板内钙离子浓度的变化及细胞外钙离子对其影响，为探讨血小板内Ca++与疾病的关系及阐明药物作用机制提供理论依据。方法 用不同浓度的二磷酸腺苷(ADP)、5-羟色胺(5-HT)、花生四烯酸、瑞斯托霉素、胶原、凝血酶诱导血小板，通过激光扫描共聚焦显微镜观察标记了Fluo-3的单个血小板内钙离子变化，以及细胞外钙离子对其影响。结果 (1) 除凝血酶外，其余诱导剂均可引起血小板钙离子浓度变化，且随着诱导剂浓度增加，钙波动频率增加，持续时间延长；(2) ADP引起的血小板钙波动，在细胞外无钙离子时，只是幅度减少，而无频率变化；(3) 5-HT引起的钙波动，在细胞外无钙时，波动消失。结论 (1)ADP、5-HT、花生四烯酸、瑞斯托霉素、胶原可引起血小板产生钙浓度变化。(2) 不同诱导剂诱发的钙波动，其钙离子来源不同。
, http://www.100md.com
Platelet calcium oscillation by laser scanning confocal microscopy Cong Yulong, Wang Junmei, LiNan et al. General Hospital of PLA Beijing, 100853
Objective To observe platelet calcium oscillation and the influence of extracellular Ca2+ on it. Methods We observed a single platelet intracellular Ca++ change and the influence of extracellular Ca2+ on it by laser sanning confocal microscopy when various agonists of different concentrations stimulated platelets. Results The other agonists except thrombin induced platelet calcium oscillation. With increasing agonis concentrations, the frequence of calcium oscillation enhanced and calcium oscillation sustained longer. In the absence of Ca++, the amplitude of ADP-induced calcium oscillation was smaller without frequence variations, and 5-TH induced calcium oscillation was inhibited. Conclusions Platelet calcium oscillation increased from fluctuation either in the entry of external calcium or the release from internal stores.
, 百拇医药
Key words Blood platelets Laser scanning confocalmicroscopy
(Natl Med J China, 1997, 77：687-691)
细胞内游离钙离子在血小板及其它细胞中起着第二信使的作用[1]，是细胞功能的重要调节因子。胞浆内游离钙的升高决定着血小板的形状变化，聚集和释放反应[2]。诱导剂作用时，细胞内Ca2+升高，介导细胞各种反应。在许多细胞中发现，诱导剂作用细胞时，各个细胞反应差异很大，有的表现瞬时变化，有的表现钙波动，与群体细胞的平均反应不同。为了了解诱导剂激活后单个血小板的钙离子变化，进一步阐明受体介导的钙离子动员机制。我们应用激光共聚焦显微镜[3，4]，观察标记了荧光染料Flou-3的单个活血小板加入不同诱导剂后的Ca2+变化。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、材料
1.试剂：(1) ADP：上海生物化学试剂厂产品；胶原、瑞斯托霉素和花生四烯酸(美国biopool公司产品)、凝血酶(美国Sigma公司)，5-HT和聚乙烯亚胺(日本Tsuroga Woman′s Junior Collega MiroakiN博士惠购)；A23187(美国Sigma公司产品)；EGTA(美国serva公司产品)。以上试剂均用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。(2) fluo-3/AM(美国分子探针公司产品)用二甲亚砜配成1mmol/L，置-30℃冰箱保存。(3) 无钙清洗液(g/L)：8.48gNaCl 0.37。KCl 0.25gMgSO44.7 H2O 1.98g葡萄糖2.38g MEPES0.02g Apyrase调至7.40。(4) 不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液(g/L)：8.01g NaCl1.60 Na2HPO4.12H2O 0.23g NaH2PO4，2H2O。
, 百拇医药
2.仪器：Insight plus激光扫描共聚焦显微镜(简称共焦显微镜)(美国Meridias公司)。
二、方法
1.各种诱导剂不同浓度作用血小板时的细胞内钙离子变化：取二周内未服任何药物的健康者静脉血，用3.8%枸橼酸钠以9：1比例抗凝，500 r/min离心5分钟，将富血小板血浆加入apyrase(防止血小板激活)后(终浓度0.9g/L)，再将血浆以2000 r/min离心10分钟分离获得血小板，用无钙清洗液洗涤一次并配成2×108/L的血小板悬浮液，加入终浓度为20μmol/L的fluo-3，置37℃孵育30分钟，用无钙清洗液洗涤二次。将20μl血小板悬液铺于包被了0.1%聚乙烯亚胺的超薄载玻片上，在液膜上加盖玻片延盖玻片边缘加入1 mmol Ca2+ 5μl。以此方式制备多张血小板液膜片，并在每片分别加入5、10、20 μmol/L二磷酸腺苷(ADP)，1.0、1.5、3.0g/L瑞斯托霉素，0.1、0.5g/L胶原，0.5、1.5 mmol/L花生四烯酸，1.5、4.5 mmol 5-HT，0.1、0.5U/ml凝血酶各5μl以上各片分别置于共焦显微镜下，观察细胞内Ca2+变化。
, http://www.100md.com
2.观察血小板外Ca2+对细胞内钙离子变化的影响：将染色洗涤好的血小板铺于超薄载玻片上，加入1mmol EDTA(EDTA可封密血小板膜防止细胞外钙流入血小板内)置于激光扫描共聚焦显微镜下，分别加入ADP和5-HT观察细胞内Ca2+变化。
3.共焦显微镜：采用5瓦氩离子激光，激发波长为488nm。倒置显微镜在40X物镜下动态观察血小板内Ca2+变化。在Time series程序下开始预扫描，调节扫描参数以取得最大电信号、最小光漂白和最好的信噪比，参数确定后动态扫描数据采集间隔时间为0.2秒，采集次数200次。高速微机逐幅贮存观察到的动态荧光图象并绘制钙离子荧光强度变化的曲线。
结果
1.各种诱导剂对血小板内Ca2+的作用：
, 百拇医药 在细胞外钙1mmol/L浓度条件下，在加入不同浓度，不同诱导剂后，血小板内钙波动变化(图1～8)。纵座标代表钙离子的荧光强度(钙浓度)，横座标代表钙离子变化的时间过程，箭头示加入诱导剂后。除凝血酶外均可引起血小板产生钙浓度变化，且随着诱导剂浓度的增加，钙波动频率增加，钙波动持续时间延长。
图1 在细胞外钙离子浓度为1mmol/L时分别加入1.5g/L(上图)，3.0g/L(下图)瑞斯托霉素后钙波动变化
图2 在细胞外钙离子浓度为1mmol/L时分别加入10μmol/L、20μmol/L(下图)ADP后，钙波动变化
, http://www.100md.com 图3 在细胞外钙离子浓度为1mmol/L时，加入0.5mmol/L 1.5mmol/L(下图)花生四烯酸后的钙波动变化
图4 在细胞外钙1mmol/L时，加入0.1mg/ml，0.5mg/ml胶原后钙波动变化
图5 在细胞外钙1mmol/L时，加入1.5mg/ml，4.5mg/ml(下图)5-HT后钙波动变化
图6 在细胞外钙1mmol/L时，加入0.1μl/ml，0.5μl/ml(下图)凝血酶后钙波动
, http://www.100md.com
图7 在细胞外无钙时，加入20μmol/L ADP后钙波动
图8 在细胞外无钙时，加入4.5mmol/L 5-HT后钙波动
2.细胞外Ca2+对血小板内Ca2+变化的影响：有细胞外钙存在的条件下，ADP与5-HT诱导的血小板内钙波动变化见图2，5。无细胞外钙的环境中上述诱导剂引起的变化见图7，8，可以看出ADP引起的血小板钙波动，在细胞外无钙时，只是幅度减小，而无频率变化，但5-HT引起的钙波动，在细胞外无钙时，波动消失。
讨论
自Cobbold等首次报道在非兴奋肝细胞内观察到了钙浓度变化以来，随着钙离子荧光染料的问世及监测单个细胞[Ca2+]技术的提高，在许多非兴奋细胞中发现了钙波动的变化。所谓钙波动，就是诱导剂作用使胞液Ca2+升高，然后降低，继而再升高，降低，重复多次。其作为细胞生物行为存在许多细胞中，是细胞内储存钙的周期性释放或依赖细胞外钙钙流入与流出之间平衡的周期性改变引起。
, 百拇医药
我们应用ADP、5-HT、胶原、花生四烯酸、瑞斯托霉素、凝血酶作用血小板，发现除凝血酶外，其余诱导剂可引起血小板产生钙波动现象，并随诱导剂浓度的增加，钙波动频率增加，持续时间延长(见图1～6)。Berridge认为[5]，诱导剂作用细胞时，细胞内IP3增加，IP3与细胞内钙敏感库上IP3受体结合，打开钙通道，引起细胞内Ca++]升高，当Ca++升高到一定程度时，胞液中钙离子与胞内钙不敏感库中的钙离子开始循环，产生钙波动。随着诱导剂浓度的增加，IP3生成亦增多，这可解释钙波动随诱导剂浓度增加，持续时间延长的现象。
引起钙波动机制很多，不同细胞，甚至同一细胞了存在一种或多种机制：5-HT诱导血小板产生的钙波动机制可能与蛋白激酶水平有关[6]，其它诱导剂产生的钙波动机制迄今尚不清楚。
关于钙波动，大多不依赖细胞外钙的存在，是由于细胞内储存Ca++的周期性释放造成，也有少数依赖细胞外钙，由于钙流入与流出之间平衡的周期性改变引起。由图2、7结果推测，ADP诱发的钙波动主要来自细胞内钙动员，而不是通过胞浆膜的钙通道的钙流所起作用。每一周期，细胞内钙池释放Ca2+进入胞浆，接着，又聚集了大部或全部的释放Ca2+。而5-HT诱发的钙波动依赖细胞外钙的存在。可能胞外钙影响着胞内钙池的填充。可见不同诱导剂作用，引起血小板钙波动的Ca2+来源不同。
, http://www.100md.com
不少研究表明，钙波动可以作为细胞内信号控制各种生理过程。钙波动减少了持续高钙导致的细胞损害，降低了由钙泵ATP酶产生的能量的利用，也可避免诱导剂长时间刺激引起的脱敏现象，调节依赖蛋白的磷酸化和脱磷酸化[7]。尽管血小板钙波动的频率对其功能的调节的作用还不清楚，但不能否认这种机制的存在。
参考文献
1 Radmussen H. The calcium messenger system. N Engl J Med,1986，314：1094.
2 Rink TJ, Smith SW, Tsien RY. Cytoplasmic free Ca++ in human platelets: Ca++ thresholds and Ca- independent activation for shape-change and secretion. FEBS, 1982，148：21.
, 百拇医药
3 丛玉隆.激光共焦显微术对血小板钙浓度变化及功能的探讨.中华医学检验杂志，1996，19：3
4 Gundo HR Rao G. Jamed G white. Monitoring signal transduction and cytosleleton alteration by fluorescent imaging and confocal microscopy. Ann New York Aca Sci, 1994, 774：297.
5 Berridge MJ. Inositol trisphosphate-induced membrane potential oscillations in Xenopus occytes. J Physiol, 1988, 403：589.
6 Nisho H, Ikegami Y, Segawa T. Fluorescence digital image analysis of serotonin-induced calcium oscillations in single blood platelets. Cell Calcium, 1991, 12：177.
7 Jacob R. Calcium oscillations in electrically non-excitable cells. Biochem Biophys Acta, 1990, 1052：427.
(收稿：1997-01-10 修回：1997-05-22), 百拇医药