成人动脉和心脏cDNA文库的构建及新全长cDNAs的克隆
作者：魏英杰 丁金凤 赵 勇 王新日 刘玉清 许有元 熊 辉 周 严 惠汝太 高润霖 强伯勤
单位：100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心管病研究所 阜外心血管病医院 分子医学中心(魏英杰、丁金凤、赵勇、刘玉清、许有元、惠汝太)，心内科(王新日、高润霖)，心外科(熊 辉)；中国医学科学院基础医学研究所(周 严、强伯勤)
关键词：动脉；心脏；基因文库；表达序列标签；DNA，互补
中国循环杂志990624 摘要
目的：构建成人动脉和心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库，克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs)。
方法：应用成人动脉和心脏组织，采用Stratagene的建库试剂盒构建cDNA文库。将随机克隆5'端表达序列标签序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较，新的全长cDNAs采用步移法完成全序列测定获得。
, http://www.100md.com
结果：所建动脉cDNA文库包含2.4×106个独立重组克隆，插入片段平均长度为2.0 kb；心脏cDNA文库包含1.0×106个独立重组克隆，平均长度为1.8 kb。首批得到了8条新的全长cDNAs，已在GenBank登记注册。
结论：构建符合要求的cDNA文库是克隆新的全长cDNAs的一条快速有效的途径。
中图分类号：Q343 文献标识码：A 文章编号：1000-3614(1999)06-0369-03
Construction of Human Adult Artery and Heart cDNA Libraries and
Cloning of Novel Full-Length cDNAs
, 百拇医药 Wei Yingjie,Ding Jinfeng,Zhao Yong,et al.
Molecular Medicine Center,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract
Objective:Construction of human adult artery and heart complementary deoxyribornucleic acid (cDNA)libraries and cloning of novel full-length cDNAs from the cDNA libraries.
Methods:Construct cDNA libraries using Stratagene Kit,human adult artery and heart samples.5'partial sequnces (namely expressed sequence tags,ESTs)of randomly picked clones were sequenced and compared to all known sequences in the GenBank/EMBL/DDBJ databases.Novel full-length cDNAs with putative important functions were obtained by walk sequencing.
, http://www.100md.com
Results:The human adult artery cDNA library consists of 2.4×106 clones with the average length of 2.0 kb and the heart cDNA library consists of 1×106 clones with the average length of 1.8 kb).Eight novel full-length cDNAs with putative important functions were registered in GenBank database.
Conclusion:The availability of high quality cDNA libraries is a rapid and efficient approach to find novel full-length cDNAs.
, 百拇医药
Key words Arteries;Heart;Gene library;Expressed sequence tags;DNA,comple mentary
(Chinese Circulation Journal,1999，14：369.)
人体不同细胞表达基因的不同决定了其组织和器官表现型的差异。在心血管系统中，有哪些基因参与了生长、分化和功能调节乃至心血管疾病的发生?这些都是亟待解决的问题。在这方面的研究中，互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库是克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs)或疾病相关基因的有用工具。本研究应用成人动脉和心脏组织，构建了符合要求的cDNA文库。并克隆得到了8条新全长cDNAs。现已开始其表达谱及功能的研究。
1 材料和方法
cDNA文库的构建 总核糖核酸(RNA)的提取和信使核糖核酸(mRNA)的分离：采用Promega公司(美国)的“RNAgents Total RNA Isolation System”试剂盒提取总RNA。再用Pharmacia公司(瑞典)的“mRNA Purification Kit”分离mRNA。
, 百拇医药
第一链cDNA的合成：在无RNA酶的0.5 ml离心管中依次加入：5 μl 10×第一链缓冲液，3 μl甲基化的三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)混合物，2 μl Xho I-adaptor oligo(dT)18引物(1.4 μg/μl)；32.5 μl DEPC水，1 μl RNA酶抑制剂(40 U/μl)，混匀，加入5 μg mRNA，混匀，室温置10 min，加入1.5 μl莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(50 U/μl)，终体积为50 μl，混匀，从中取出5 μl转入另一管，并加入0.5 μl [α-32P]三磷酸脱氧腺苷(dATP)(800 Ci/mmol)，以鉴定第一链合成质量。上述两管均在37℃孵育1 h。
第二链cDNA的合成和EcoR I-adaptor的连接：在灭菌的0.5 ml离心管中依次加入：45 μl第一链cDNA；20 μl 10×第二链缓冲液，6 μl dNTP混合物；114 μl蒸馏水，2 μl [α-32P]dATP(800 Ci/mmol)，2 μl RNA酶H(1.5 U/μl)，11 μl脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶I(9.0 U/μl)，混匀后16℃孵育2.5 h。反应结束后加入23 μl dNTP混合物和2 μl Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μl)，72℃孵育30 min，以补平cDNA末端。反应结束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法，得到第二链cDNA沉淀，加入9 μl EcoR I-adaptor溶解沉淀，并取出1 μl与第一链cDNA一起进行碱变性胶电泳，以鉴定第一和第二链合成质量。在剩余的8 μl第二链cDNA中依次加入：1 μl 10×连接酶缓冲液，1 μl 10 mmol/L γ-三磷酸腺苷(γ-ATP)；1 μl T4DNA连接酶(4 U/μl)，8℃孵育过夜后，70℃孵育30 min。冷却后依次加入：1 μl 10×连接酶缓冲液，2 μl 10 mmol/L γ-ATP；6 μl蒸馏水，1 μl T4多核苷酸激酶(10 U/μl)，37℃孵育30 min，70℃孵育30 min。
, http://www.100md.com
Xho I酶切和分级分离：在前步反应混合液中加入28 μl Xho I缓冲液和3 μl Xho I内切酶(40 U/μl)，37℃孵育1.5 h。为了提高全长cDNA克隆在cDNA文库所占的比例，应用Sepharose CL-2B树脂填柱，进行过柱分级分离，以去除小于400～500 bp的核苷酸。
将cDNA克隆入ZAP噬菌体表达载体：在1.5 ml离心管中依次加入：100 ng cDNA，0.5 μl 10×连接酶缓冲液，0.5 μl 10 mmol/L γ-ATP(pH7.5),1.0 μl ZAP噬菌体表达载体(1 μg/μl)，加水至4.5 μl，再加入0.5 μl T4DNA连接酶(4 U/μl)，12℃孵育过夜。
ZAP的包装：取1 μl连接反应混合物加入已在冰上溶解的25 μl包装蛋白溶液中，混匀，22℃包装2 h。加入500 μl的SM缓冲液和20 μl的氯仿，混匀，此包装的噬菌体即为原始的cDNA文库。
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库容量的测定：取5 μl原始的cDNA文库，用45 μl SM缓冲液稀释，取10 μl稀释液加入200 μl感受态XL1-Blue MRF'宿主菌(OD600=0.5)，37℃保温20 min。加入3 ml熔化(48℃)的NZY培养基上层琼脂，混匀后立即铺于LB平板上，凝固后倒置37℃培养过夜。计算平板上清晰的克隆数。
cDNA文库的扩增和保存：由于原始的cDNA文库不稳定，非野生型的噬菌体容易失活，因此，为保持cDNA文库一定的滴度，需对原始库进行一次扩增。根据原始库的库容量，将原始库分为若干份。每份含约5×104个克隆。将每份分别加入600 μl感受态XL1-Blue MRF'宿主菌(OD600=0.5)中，37℃保温20 min。加入6.5 ml熔化(48℃)的NZY培养基上层琼脂，混匀后立即铺于150 mm LB平板上，凝固37℃倒置培养6～8 h。然后每盘加入8 ml的SM缓冲液，于4℃轻摇过夜后收集上清液，即得到扩增后的cDNA文库。加入0.3%氯仿和7%二甲基亚砜(DMSO)，在-70℃长期保存。
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新全长cDNAs的克隆 随机克隆的表达序列标签序列测定：cDNA文库铺盘(200～500个克隆/150 mm盘)，挑取单个噬菌斑转入含有500 μl SM缓冲液和20 μl氯仿的灭菌离心管中。室温置2 h后振摇，短暂离心后，取5 μl上清液，应用插入片段两端的载体引物进行多聚酶链反应(PCR)。反应总体积为50 μl，扩增参数为：94℃ 3 min，再94℃ 5 min，57℃ 30 s，72℃ 3 min,共进行30个循环后，再72℃ 3 min。每个PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定质量后，取2 μl的PCR 产物，用荧光素标记的cDNA 5'端载体引物进行测序PCR扩增反应。反应总体积为8 μl，扩增参数为：94℃ 2 min，94℃ 30 s，50℃ 15 s，72℃ 1 min，进行20个循环，再94℃ 30 s，72℃ 1 min，15个循环，最后72℃ 5 min。PCR反应结束，取6 μ1 PCR产物，用自动测序仪(Pharmacia ALF DNA Sequencer)进行表达序列标签序列测定。
新全长cDNAs的克隆和测序：用美国生物信息学中心的BLAST软件，将每个cDNA克隆的表达序列标签与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较分析[1]。根据分析结果，将相应的ZAP噬菌体克隆环化为pBK-CMV质粒，扩增后应用QIAGEN公司(德国)的“QIAprep Spin Miniprep Kit”提取质粒DNA，在ABI377自动测序仪上进行序列测定。cDNA全长序列通过设计引物采用步移法获得。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 互补脱氧核糖核酸文库构建的效率
将包装好的重组ZAP噬菌体颗粒与一定比例的宿主菌XL1-Blue MRF'混合，铺板后计算白色菌落(带有插入片段的转化子)。结果，动脉和心脏cDNA文库的白菌率分别为98%和96%。
2.2 互补脱氧核糖核酸文库的质量鉴定
据估计，人类基因mRNA的平均长度为2 kb。为估计所建文库插入片断的大小，从动脉和心脏cDNA文库中各随机挑选96个克隆，用载体克隆位点两端引物进行PCR扩增，电泳分析。结果见附表。
附表 96个随机克隆插入片断的长度及分布 cDNA
文库
, http://www.100md.com 无效
克隆数
插入片断范围
(kb)
60%～70%插入片断
长度分布(kb)
插入片断
平均长度(kb)
动脉
9
0.8～5.0
1.5～3.0
2.0
, 百拇医药
心脏
3
0.5～4.0
1.2～2.5
1.8
注：cDNA：互补脱氧核糖核酸
经计算，动脉和心脏cDNA文库分别含有2.4×106和1.0×106个独立克隆。
2.3 表达序列标签的结果分析及新全长cDNAs的获得
本实验从动脉和心脏cDNA文库中随机挑选克隆，测定了662个表达序列标签，应用BLAST软件与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较分析，发现其中有50%(327个表达序列标签)与已知基因同源；37%(246个表达序列标签)与已知表达序列标签同源；13%(89个表达序列标签)与已知基因和表达序列标签均无同源性，为新的表达序列标签。对其中60条可能有重要功能的新表达序列标签克隆进行了环化和全序列测定，首批得到了8条新的全长cDNAs，并在GenBank登记注册。
, 百拇医药
3 讨论
人类约有5～10万个基因，但在某一组织的特定阶段仅有10%～30%的基因得以表达。若稀有基因(<14个拷贝/细胞)在总mRNA中以30%计，根据Clarke-Carbon公式，要从文库中以99%的机率筛选到该稀有基因，则文库至少应包含1.7×105个独立克隆[2]。而本室所构建动脉和心脏cDNA文库的独立克隆数分别为2.4×106和1.0×106，符合库容量要求。因此，本室构建了符合要求的动脉和心脏cDNA文库。
进行与基因转录本相应的cDNA部分序列的测定，是克隆和研究心血管系统表达基因的一条快速而有效的途径[3，4]。应用对cDNA文库大规模表达序列标签序列测定的方法，本室克隆了8条可能具重要功能的新的全长cDNA，有关这些新基因的组织学分布及其生物学功能研究正在进行之中。
, http://www.100md.com
注释：本研究由国家863重点项目编号：Z19-02-02-01
作者简介：魏英杰(1963-)男 副研究员 博士 硕士研究生导师 1998年赴加拿大研修，1999年赴美国研修 主要从事心血管病分子生物学研究
4 参考文献
1 Altschul SF,Madden TL,Schaffer A,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search program.Nucleic Acid Res,1997，25：3389—3402.
2 金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.399.
3 Liew CC,Hwang DM,Fung YW,et al.A catalog(ue) of genes in the cardiovascular system as identified by expressed sequence tags(ESTs).Proc Natl Acad Sci,1994,91：10645—10649.
4 Hwang DM,Hwang WS,Liew CC.Single pass sequencing of a undirectional human fetal heart cDNA library to discover novel genes of the cardiovascular system.J Mol Cell Cardiol,1994，26：1329—1333.
收稿：1999-04-27 修回：1999-07-05, 百拇医药
单位：100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心管病研究所 阜外心血管病医院 分子医学中心(魏英杰、丁金凤、赵勇、刘玉清、许有元、惠汝太)，心内科(王新日、高润霖)，心外科(熊 辉)；中国医学科学院基础医学研究所(周 严、强伯勤)
关键词：动脉；心脏；基因文库；表达序列标签；DNA，互补
中国循环杂志990624 摘要
目的：构建成人动脉和心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库，克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs)。
方法：应用成人动脉和心脏组织，采用Stratagene的建库试剂盒构建cDNA文库。将随机克隆5'端表达序列标签序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较，新的全长cDNAs采用步移法完成全序列测定获得。
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结果：所建动脉cDNA文库包含2.4×106个独立重组克隆，插入片段平均长度为2.0 kb；心脏cDNA文库包含1.0×106个独立重组克隆，平均长度为1.8 kb。首批得到了8条新的全长cDNAs，已在GenBank登记注册。
结论：构建符合要求的cDNA文库是克隆新的全长cDNAs的一条快速有效的途径。
中图分类号：Q343 文献标识码：A 文章编号：1000-3614(1999)06-0369-03
Construction of Human Adult Artery and Heart cDNA Libraries and
Cloning of Novel Full-Length cDNAs
, 百拇医药 Wei Yingjie,Ding Jinfeng,Zhao Yong,et al.
Molecular Medicine Center,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract
Objective:Construction of human adult artery and heart complementary deoxyribornucleic acid (cDNA)libraries and cloning of novel full-length cDNAs from the cDNA libraries.
Methods:Construct cDNA libraries using Stratagene Kit,human adult artery and heart samples.5'partial sequnces (namely expressed sequence tags,ESTs)of randomly picked clones were sequenced and compared to all known sequences in the GenBank/EMBL/DDBJ databases.Novel full-length cDNAs with putative important functions were obtained by walk sequencing.
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Results:The human adult artery cDNA library consists of 2.4×106 clones with the average length of 2.0 kb and the heart cDNA library consists of 1×106 clones with the average length of 1.8 kb).Eight novel full-length cDNAs with putative important functions were registered in GenBank database.
Conclusion:The availability of high quality cDNA libraries is a rapid and efficient approach to find novel full-length cDNAs.
, 百拇医药
Key words Arteries;Heart;Gene library;Expressed sequence tags;DNA,comple mentary
(Chinese Circulation Journal,1999，14：369.)
人体不同细胞表达基因的不同决定了其组织和器官表现型的差异。在心血管系统中，有哪些基因参与了生长、分化和功能调节乃至心血管疾病的发生?这些都是亟待解决的问题。在这方面的研究中，互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库是克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs)或疾病相关基因的有用工具。本研究应用成人动脉和心脏组织，构建了符合要求的cDNA文库。并克隆得到了8条新全长cDNAs。现已开始其表达谱及功能的研究。
1 材料和方法
cDNA文库的构建 总核糖核酸(RNA)的提取和信使核糖核酸(mRNA)的分离：采用Promega公司(美国)的“RNAgents Total RNA Isolation System”试剂盒提取总RNA。再用Pharmacia公司(瑞典)的“mRNA Purification Kit”分离mRNA。
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第一链cDNA的合成：在无RNA酶的0.5 ml离心管中依次加入：5 μl 10×第一链缓冲液，3 μl甲基化的三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)混合物，2 μl Xho I-adaptor oligo(dT)18引物(1.4 μg/μl)；32.5 μl DEPC水，1 μl RNA酶抑制剂(40 U/μl)，混匀，加入5 μg mRNA，混匀，室温置10 min，加入1.5 μl莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(50 U/μl)，终体积为50 μl，混匀，从中取出5 μl转入另一管，并加入0.5 μl [α-32P]三磷酸脱氧腺苷(dATP)(800 Ci/mmol)，以鉴定第一链合成质量。上述两管均在37℃孵育1 h。
第二链cDNA的合成和EcoR I-adaptor的连接：在灭菌的0.5 ml离心管中依次加入：45 μl第一链cDNA；20 μl 10×第二链缓冲液，6 μl dNTP混合物；114 μl蒸馏水，2 μl [α-32P]dATP(800 Ci/mmol)，2 μl RNA酶H(1.5 U/μl)，11 μl脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶I(9.0 U/μl)，混匀后16℃孵育2.5 h。反应结束后加入23 μl dNTP混合物和2 μl Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μl)，72℃孵育30 min，以补平cDNA末端。反应结束后采用酚∶氯仿(1∶1)抽提和乙醇沉淀的方法，得到第二链cDNA沉淀，加入9 μl EcoR I-adaptor溶解沉淀，并取出1 μl与第一链cDNA一起进行碱变性胶电泳，以鉴定第一和第二链合成质量。在剩余的8 μl第二链cDNA中依次加入：1 μl 10×连接酶缓冲液，1 μl 10 mmol/L γ-三磷酸腺苷(γ-ATP)；1 μl T4DNA连接酶(4 U/μl)，8℃孵育过夜后，70℃孵育30 min。冷却后依次加入：1 μl 10×连接酶缓冲液，2 μl 10 mmol/L γ-ATP；6 μl蒸馏水，1 μl T4多核苷酸激酶(10 U/μl)，37℃孵育30 min，70℃孵育30 min。
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Xho I酶切和分级分离：在前步反应混合液中加入28 μl Xho I缓冲液和3 μl Xho I内切酶(40 U/μl)，37℃孵育1.5 h。为了提高全长cDNA克隆在cDNA文库所占的比例，应用Sepharose CL-2B树脂填柱，进行过柱分级分离，以去除小于400～500 bp的核苷酸。
将cDNA克隆入ZAP噬菌体表达载体：在1.5 ml离心管中依次加入：100 ng cDNA，0.5 μl 10×连接酶缓冲液，0.5 μl 10 mmol/L γ-ATP(pH7.5),1.0 μl ZAP噬菌体表达载体(1 μg/μl)，加水至4.5 μl，再加入0.5 μl T4DNA连接酶(4 U/μl)，12℃孵育过夜。
ZAP的包装：取1 μl连接反应混合物加入已在冰上溶解的25 μl包装蛋白溶液中，混匀，22℃包装2 h。加入500 μl的SM缓冲液和20 μl的氯仿，混匀，此包装的噬菌体即为原始的cDNA文库。
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库容量的测定：取5 μl原始的cDNA文库，用45 μl SM缓冲液稀释，取10 μl稀释液加入200 μl感受态XL1-Blue MRF'宿主菌(OD600=0.5)，37℃保温20 min。加入3 ml熔化(48℃)的NZY培养基上层琼脂，混匀后立即铺于LB平板上，凝固后倒置37℃培养过夜。计算平板上清晰的克隆数。
cDNA文库的扩增和保存：由于原始的cDNA文库不稳定，非野生型的噬菌体容易失活，因此，为保持cDNA文库一定的滴度，需对原始库进行一次扩增。根据原始库的库容量，将原始库分为若干份。每份含约5×104个克隆。将每份分别加入600 μl感受态XL1-Blue MRF'宿主菌(OD600=0.5)中，37℃保温20 min。加入6.5 ml熔化(48℃)的NZY培养基上层琼脂，混匀后立即铺于150 mm LB平板上，凝固37℃倒置培养6～8 h。然后每盘加入8 ml的SM缓冲液，于4℃轻摇过夜后收集上清液，即得到扩增后的cDNA文库。加入0.3%氯仿和7%二甲基亚砜(DMSO)，在-70℃长期保存。
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新全长cDNAs的克隆 随机克隆的表达序列标签序列测定：cDNA文库铺盘(200～500个克隆/150 mm盘)，挑取单个噬菌斑转入含有500 μl SM缓冲液和20 μl氯仿的灭菌离心管中。室温置2 h后振摇，短暂离心后，取5 μl上清液，应用插入片段两端的载体引物进行多聚酶链反应(PCR)。反应总体积为50 μl，扩增参数为：94℃ 3 min，再94℃ 5 min，57℃ 30 s，72℃ 3 min,共进行30个循环后，再72℃ 3 min。每个PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定质量后，取2 μl的PCR 产物，用荧光素标记的cDNA 5'端载体引物进行测序PCR扩增反应。反应总体积为8 μl，扩增参数为：94℃ 2 min，94℃ 30 s，50℃ 15 s，72℃ 1 min，进行20个循环，再94℃ 30 s，72℃ 1 min，15个循环，最后72℃ 5 min。PCR反应结束，取6 μ1 PCR产物，用自动测序仪(Pharmacia ALF DNA Sequencer)进行表达序列标签序列测定。
新全长cDNAs的克隆和测序：用美国生物信息学中心的BLAST软件，将每个cDNA克隆的表达序列标签与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较分析[1]。根据分析结果，将相应的ZAP噬菌体克隆环化为pBK-CMV质粒，扩增后应用QIAGEN公司(德国)的“QIAprep Spin Miniprep Kit”提取质粒DNA，在ABI377自动测序仪上进行序列测定。cDNA全长序列通过设计引物采用步移法获得。
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2 结果
2.1 互补脱氧核糖核酸文库构建的效率
将包装好的重组ZAP噬菌体颗粒与一定比例的宿主菌XL1-Blue MRF'混合，铺板后计算白色菌落(带有插入片段的转化子)。结果，动脉和心脏cDNA文库的白菌率分别为98%和96%。
2.2 互补脱氧核糖核酸文库的质量鉴定
据估计，人类基因mRNA的平均长度为2 kb。为估计所建文库插入片断的大小，从动脉和心脏cDNA文库中各随机挑选96个克隆，用载体克隆位点两端引物进行PCR扩增，电泳分析。结果见附表。
附表 96个随机克隆插入片断的长度及分布 cDNA
文库
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克隆数
插入片断范围
(kb)
60%～70%插入片断
长度分布(kb)
插入片断
平均长度(kb)
动脉
9
0.8～5.0
1.5～3.0
2.0
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心脏
3
0.5～4.0
1.2～2.5
1.8
注：cDNA：互补脱氧核糖核酸
经计算，动脉和心脏cDNA文库分别含有2.4×106和1.0×106个独立克隆。
2.3 表达序列标签的结果分析及新全长cDNAs的获得
本实验从动脉和心脏cDNA文库中随机挑选克隆，测定了662个表达序列标签，应用BLAST软件与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较分析，发现其中有50%(327个表达序列标签)与已知基因同源；37%(246个表达序列标签)与已知表达序列标签同源；13%(89个表达序列标签)与已知基因和表达序列标签均无同源性，为新的表达序列标签。对其中60条可能有重要功能的新表达序列标签克隆进行了环化和全序列测定，首批得到了8条新的全长cDNAs，并在GenBank登记注册。
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3 讨论
人类约有5～10万个基因，但在某一组织的特定阶段仅有10%～30%的基因得以表达。若稀有基因(<14个拷贝/细胞)在总mRNA中以30%计，根据Clarke-Carbon公式，要从文库中以99%的机率筛选到该稀有基因，则文库至少应包含1.7×105个独立克隆[2]。而本室所构建动脉和心脏cDNA文库的独立克隆数分别为2.4×106和1.0×106，符合库容量要求。因此，本室构建了符合要求的动脉和心脏cDNA文库。
进行与基因转录本相应的cDNA部分序列的测定，是克隆和研究心血管系统表达基因的一条快速而有效的途径[3，4]。应用对cDNA文库大规模表达序列标签序列测定的方法，本室克隆了8条可能具重要功能的新的全长cDNA，有关这些新基因的组织学分布及其生物学功能研究正在进行之中。
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注释：本研究由国家863重点项目编号：Z19-02-02-01
作者简介：魏英杰(1963-)男 副研究员 博士 硕士研究生导师 1998年赴加拿大研修，1999年赴美国研修 主要从事心血管病分子生物学研究
4 参考文献
1 Altschul SF,Madden TL,Schaffer A,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search program.Nucleic Acid Res,1997，25：3389—3402.
2 金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.399.
3 Liew CC,Hwang DM,Fung YW,et al.A catalog(ue) of genes in the cardiovascular system as identified by expressed sequence tags(ESTs).Proc Natl Acad Sci,1994,91：10645—10649.
4 Hwang DM,Hwang WS,Liew CC.Single pass sequencing of a undirectional human fetal heart cDNA library to discover novel genes of the cardiovascular system.J Mol Cell Cardiol,1994，26：1329—1333.
收稿：1999-04-27 修回：1999-07-05, 百拇医药