放射辐照对异体神经移植组织学改变的影响
作者：李建兵 姚建民 宋建良 杨向东 吴守成 沈向前 宋春轶 孙豪
单位：杭州整形医院，浙江 杭州 310014
关键词：异体神经；移植；放射辐照；组织学
实用美容整形外科杂志000623 摘要：目的 探索放射辐照对异体神经移植组织学改变的影响。方法 将18只SD大白鼠随机均分为三组：自体对照组、异体对照组、辐照处理组。应用放射辐照方法处理异体神经后进行移植。术后12周移植神经和胫前肌HE染色，移植神经S-100蛋白及波形蛋白免疫组化和甲苯胺蓝染色，观察其组织学变化和计数单位面积内阳性轴突数和再生的有髓神经纤维数量。结果 放射辐照处理后的移植神经，纤维组织增生和炎性细胞浸润较少，胫前肌生长良好，再生有髓神经纤维增多(与异体对照组比较，P<0.05)，单位面积内的阳性轴突数明显增多(P<0.05)。结论 放射辐照处理可降低异体神经的抗原性。
, 百拇医药
中图分类号：R622.3 文献标识码：A
文章编号：1004-6526(2000)06-0328-03
The influence of radiation on histology of nerve homograft
LI Jian-bing,YAO Jian-min,SONG Jian-liang,et al.
(Hangzhou Plastic Surgery Hospital,Hangzhou310014,China)
Abstract:Objective To study the influence of radiation on histology of homografted nerve.Methods:18 SD rats were randomly divided into autogenous nerve graft,homogenous nerve graft control and radiation treatment groups.12 weeks later,transplanted nerves were stained with HE and methylamine blue,and studied by immunohistochemistry of S-100 protein and vimentine protein,anterior tibial muscle was stained with HE,in order to observe histological changes and the amount of axons and myelinated nerve fibers.Results Fibrous tissue proliferation and inflammatory cell infiltration were less within radiated nerve compared with homografted nerve,anterior tibial muscle grew well,regenerated myelinated nerve fibers and axons in treated nerve were much more in number than those in homogenous control group(P<0.05).Conclusion Radiation can decrease antigenicity of homogenous nerve graft.
, 百拇医药
Key words:Homogenous nerve graft;Transplant;Radiation;Histology
周围神经缺损的修复，目前仍以自体神经移植较为常用而有效。异体神经来源广、简单易得，其临床应用有着广阔的前景，但异体排斥反应使其应用受到限制，降低其抗原性成为许多学者研究的焦点。本研究应用放射辐照处理异体神经进行移植。通过对神经移植组织学检查，探索放射辐照对异体神经抗原性的影响，为临床更合理、更有效地应用异体神经移植提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 SD大白鼠24只，6只用于辐照处理神经的制备，18只作为实验对象。
1.1.2 实验仪器 Opton手术显微镜，JEM-1200EX透射电镜，MIAS图像处理系统等。
, 百拇医药
1.1.3 主要试剂 S-100蛋白、波形蛋白免疫组化试剂盒，美国ZYMED公司产品，由福州迈新生物试剂公司提供。
1.1.4 实验分组 将实验动物18只随机均分为三组，每组6只。①自体对照组(A组)：将坐骨神经左、右换位后缝合；②异体对照组(X)组：同种动物间坐骨神经互换后缝合；③辐照处理组(R组)：异体神经经放射辐照处理后移植。
1.1.5 辐照处理神经的制备 实验动物共6只，将切取的12段长1.5cm大鼠坐骨神经用4℃生理盐水漂洗后置入洁净的青霉素瓶内，冰块中冷藏，放射辐照12小时，总剂量为20KGy。
1.2 手术方法
用2%戊巴比妥钠大白鼠腹腔注射麻醉(30～40mg/kg)，俯卧固定，双侧后肢剪毛后8%硫化钠脱毛，PVP-I消毒，铺无菌洞巾。于股后外侧弧形切开皮肤，分离股二头肌与半腱肌、半膜肌间隙，牵开肌肉，显露坐骨神经。从犁状肌下约0.5cm切除1.2cm长坐骨神经，造成神经缺损。将各实验组神经用刀片修整成相应长度移植于神经缺损区。各吻合口在手术显微镜下用11-0丝线缝合神经外膜3～5针，由专人操作。术后每组分笼同等条件喂养。
, 百拇医药
1.3 检测指标及方法
1.3.1 组织检查 ①光镜组织学观察，神经移植12周后，切取各组移植神经中央段、远侧段及部分胫前肌，用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，以备HE染色和S-100蛋白及波形蛋白免疫组化染色[1](免疫组化染色操作步骤参照试剂盒说明书进行)。部分移植神经中央段标本用4%戊二醛固定，1%锇酸二次固定，树脂包埋，半薄切片(厚1μm)，甲苯胺蓝染色，观察再生的有髓神经纤维。②电镜观察，每组任取2段移植神经，4%戊二醛固定，1%锇酸二次固定，酒精逐级脱水，树脂包埋聚合，超薄切片(70nm)，醋酸铀柠檬酸铅染色，JEM-1200EX高压透射电镜观察移植神经的超微结构。
1.3.2 图像分析与定量学检测 ①胫前肌肌纤维截面积测量，应用MIAS图像处理系统在不同视野下任取100个胫前肌肌纤维截面，进行测量分析。②有髓神经纤维计数，甲苯胺蓝染色的半薄切片在20×10光镜下，运用MIAS图像处理系统，在不同视野任意摄取5幅图像，计数单位面积内的有髓神经纤维数量，并计算每组各12个标本的平均值。③单位面积内阳性轴突计数，各组移植神经S-100蛋白免疫组化染色切片在40×10光镜下，运用MIAS进行图像分析，计数单位面积内的阳性轴突数，并计算每组各12个标本的平均值。
, 百拇医药
1.3.3 统计学处理 应用Newman-Keuls多重比较法进行两两比较的q检验。
2 结果
2.1 移植神经的组织学变化 A组神经纤维排列规则，无明显神经变性，少量炎性细胞浸润和纤维组织增生，毛细血管增生不明显，髓鞘分布较均匀，厚薄一致，排列尚规则，髓鞘无明显肿胀。X组神经排列紊乱，伴空泡变性，大量的炎性细胞浸润和纤维组织增生，毛细血管增生活跃，大部分髓鞘正常结构消失，外形不规则，髓鞘和轴突水肿，有的髓鞘肿胀呈气球状，有的呈颗粒状，有的溶解呈空泡状，脱髓鞘改变较明显，尤以神经纤维中央区为甚。R组组织学改变介于A组与X组之间(图1)。
2.2 各处理组胫前肌HE染色的组织学变化 A组肌纤维粗大，大小均匀一致，排列紧密，肌间隙较小，结缔组织和毛细血管增生不明显，无明显肌肉变性和炎性细胞浸润；R组肌纤维较粗，肌间隙较明显，排列尚规则，生长良好，少量结缔组织增生及炎性细胞浸润；X组肌纤维明显萎缩、细小，肌间隙增宽、肿胀，结缔组织和毛细血管增生明显。
, 百拇医药
2.3 各处理组神经移植后胫前肌肌纤维截面积Newman-Keuls检验结果(表1)。
表1 胫前肌肌纤维截面积Newman-Keuls检验结果
异体移植组
辐照处理组
自体移植组
(
±s)
1014±303
1154±105
1677±411
自体移植组
, 百拇医药
※
※
-
辐照处理组
※
-
※
异体处理组
-
※
※
注：每组样本n=100 ※表示P<0.05，差别有统计学意义 以上结果表明，用辐照处理的神经移植修复后，肌肉生长情况较好，但比自体神经修复效果较差，优于未经处理的异体神经移植。
, 百拇医药
2.4 各处理组单位面积内有髓神经纤维数量Newman-Keuls检验结果(表2)。
图1 不同处理组术后12周移植神经(HE染色，纵切，40×10)
图2 不同处理组术后12周移植神经的超微结构(×6000)
表2 各处理组有髓神经纤维数Newman-Keuls检验结果 异体移植组(±s) 55.3±5.5
辐照处理组
73.2±4.0
, 百拇医药
自体移植组
113.8±10.1
自体移植组 ※
※
-
辐照处理组 ※
-
※
异体处理组 -
※
※
注：每组样本n=60
※表示P<0.05，差别有统计学意义
, http://www.100md.com
从以上统计结果可以看出，自体神经移植后，再生的神经纤维数量最多，其次是辐照处理组，未经处理的异体移植神经再生情况最差。
2.5 S-100蛋白与波形蛋白免疫组化染色。各处理组单位面积内的S-100蛋白阳性轴突数Newman-Keuls检验结果(表3)。表3 单位面积内S-100蛋白阳性轴突数
Newman-Keuls检验结果 异体移植组(±s)
42.3±7.5
辐照处理组71.8±8.4
自体移植组92.7±10.1
自体移植组
, 百拇医药
※
※
-
辐照处理组
※
-
※
异体处理组
-
※
※
注：每组样本n=60
※表示P<0.05，差别有统计学意义
, 百拇医药
2.6 电镜观察A组和R组均可见神经轴突发育良好，呈规则椭圆形，髓鞘壁厚，板层致密，轴浆内富含神经微丝和微管，部分轴索内可见线粒体。X组髓鞘雪旺氏细胞基膜与轴突分离，髓鞘肿胀，厚薄不均，有的皱褶分裂，髓鞘板层松散，有的溶解消失呈空泡状，有的雪旺氏细胞膜水肿，线粒体空化坏死、崩解(图2)。
3 讨论
3.1 实验结果评价 术后12周，分别对移植神经和胫前肌HE染色，移植神经S-100蛋白及波形蛋白免疫组化和甲苯胺蓝染色后的组织学观察，单位面积内阳性轴突和再生的有髓神经纤维计数，结果表明：放射辐照处理的移植神经、纤维组织增生和炎性细胞浸润较少，胫前肌生长良好，再生有髓神经纤维增多(与异体对照组比较，P<0.05)，单位面积内的阳性轴突数明显增多(P<0.05)，因此推测：放射辐照处理可降低异体神经的抗原性。
3.2 放射辐照机理探讨 周围神经的长段缺损需要通过组织移植才能达到修复。自体神经移植修复的效果最好，但其来源有限[2～3]。同种异体神经移植，由于供体和受体间组织相容性的差异，引起程度不同的免疫排斥反应，导致移植神经崩解、吸收，淋巴细胞浸润损害神经内膜组织，包括基底膜管，因此阻碍了移植神经中轴突通过[4～5]。Marmor[6]应用放射辐照来降低异体神经的排斥反应，并取得了一定的效果。其作用机理可能是利用X射线杀死雪旺氏细胞，破坏其继续分泌抗原物质的功能，并通过保留的神经膜管结构支架，使周围神经得以再生。另外，液氮冷冻，戊二醛和酒精等处理异体神经降低其抗原性已有报道，孰优孰劣， 有待进一步研究。作者简介：李建兵(1967-)，男，湖南益阳人，主治医师
, 百拇医药
参考文献：
[1]胡韶楠,徐建光,袁 伟,等.臂丛神经节前损伤的大鼠动物模型[J].中华手外科杂志,1996,12(2):120.
[2]Sundland S.Nerves and nerve injuries[M].Churchill,Livingstone,Edingburg and New York,1978,108.
[3]Staniforth P,Fisher TR.The effects of sural nerve excision in autogenous nerve grafting[J].Hand,1978,10(2):187.
[4]Tajima K,Tohyama K,Ide C,et al.Regeneration through nerve allografts in the cynomolgus monkey(Macaca fascicularis)[J].J Bone Joint Surg Am,1991,73(2):172.
[5]朱家恺,刘军犀.周围神经外科的回顾与展望[J].中华显微外科杂志,1990,13(1):35.
[6]Marmor J.Regeneration of peripheral nerve by irradiated homografts[J].J Bone Joint Surg,1964,46(A):383.
收稿日期：1999-12-23, http://www.100md.com
单位：杭州整形医院，浙江 杭州 310014
关键词：异体神经；移植；放射辐照；组织学
实用美容整形外科杂志000623 摘要：目的 探索放射辐照对异体神经移植组织学改变的影响。方法 将18只SD大白鼠随机均分为三组：自体对照组、异体对照组、辐照处理组。应用放射辐照方法处理异体神经后进行移植。术后12周移植神经和胫前肌HE染色，移植神经S-100蛋白及波形蛋白免疫组化和甲苯胺蓝染色，观察其组织学变化和计数单位面积内阳性轴突数和再生的有髓神经纤维数量。结果 放射辐照处理后的移植神经，纤维组织增生和炎性细胞浸润较少，胫前肌生长良好，再生有髓神经纤维增多(与异体对照组比较，P<0.05)，单位面积内的阳性轴突数明显增多(P<0.05)。结论 放射辐照处理可降低异体神经的抗原性。
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中图分类号：R622.3 文献标识码：A
文章编号：1004-6526(2000)06-0328-03
The influence of radiation on histology of nerve homograft
LI Jian-bing,YAO Jian-min,SONG Jian-liang,et al.
(Hangzhou Plastic Surgery Hospital,Hangzhou310014,China)
Abstract:Objective To study the influence of radiation on histology of homografted nerve.Methods:18 SD rats were randomly divided into autogenous nerve graft,homogenous nerve graft control and radiation treatment groups.12 weeks later,transplanted nerves were stained with HE and methylamine blue,and studied by immunohistochemistry of S-100 protein and vimentine protein,anterior tibial muscle was stained with HE,in order to observe histological changes and the amount of axons and myelinated nerve fibers.Results Fibrous tissue proliferation and inflammatory cell infiltration were less within radiated nerve compared with homografted nerve,anterior tibial muscle grew well,regenerated myelinated nerve fibers and axons in treated nerve were much more in number than those in homogenous control group(P<0.05).Conclusion Radiation can decrease antigenicity of homogenous nerve graft.
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Key words:Homogenous nerve graft;Transplant;Radiation;Histology
周围神经缺损的修复，目前仍以自体神经移植较为常用而有效。异体神经来源广、简单易得，其临床应用有着广阔的前景，但异体排斥反应使其应用受到限制，降低其抗原性成为许多学者研究的焦点。本研究应用放射辐照处理异体神经进行移植。通过对神经移植组织学检查，探索放射辐照对异体神经抗原性的影响，为临床更合理、更有效地应用异体神经移植提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 SD大白鼠24只，6只用于辐照处理神经的制备，18只作为实验对象。
1.1.2 实验仪器 Opton手术显微镜，JEM-1200EX透射电镜，MIAS图像处理系统等。
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1.1.3 主要试剂 S-100蛋白、波形蛋白免疫组化试剂盒，美国ZYMED公司产品，由福州迈新生物试剂公司提供。
1.1.4 实验分组 将实验动物18只随机均分为三组，每组6只。①自体对照组(A组)：将坐骨神经左、右换位后缝合；②异体对照组(X)组：同种动物间坐骨神经互换后缝合；③辐照处理组(R组)：异体神经经放射辐照处理后移植。
1.1.5 辐照处理神经的制备 实验动物共6只，将切取的12段长1.5cm大鼠坐骨神经用4℃生理盐水漂洗后置入洁净的青霉素瓶内，冰块中冷藏，放射辐照12小时，总剂量为20KGy。
1.2 手术方法
用2%戊巴比妥钠大白鼠腹腔注射麻醉(30～40mg/kg)，俯卧固定，双侧后肢剪毛后8%硫化钠脱毛，PVP-I消毒，铺无菌洞巾。于股后外侧弧形切开皮肤，分离股二头肌与半腱肌、半膜肌间隙，牵开肌肉，显露坐骨神经。从犁状肌下约0.5cm切除1.2cm长坐骨神经，造成神经缺损。将各实验组神经用刀片修整成相应长度移植于神经缺损区。各吻合口在手术显微镜下用11-0丝线缝合神经外膜3～5针，由专人操作。术后每组分笼同等条件喂养。
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1.3 检测指标及方法
1.3.1 组织检查 ①光镜组织学观察，神经移植12周后，切取各组移植神经中央段、远侧段及部分胫前肌，用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，以备HE染色和S-100蛋白及波形蛋白免疫组化染色[1](免疫组化染色操作步骤参照试剂盒说明书进行)。部分移植神经中央段标本用4%戊二醛固定，1%锇酸二次固定，树脂包埋，半薄切片(厚1μm)，甲苯胺蓝染色，观察再生的有髓神经纤维。②电镜观察，每组任取2段移植神经，4%戊二醛固定，1%锇酸二次固定，酒精逐级脱水，树脂包埋聚合，超薄切片(70nm)，醋酸铀柠檬酸铅染色，JEM-1200EX高压透射电镜观察移植神经的超微结构。
1.3.2 图像分析与定量学检测 ①胫前肌肌纤维截面积测量，应用MIAS图像处理系统在不同视野下任取100个胫前肌肌纤维截面，进行测量分析。②有髓神经纤维计数，甲苯胺蓝染色的半薄切片在20×10光镜下，运用MIAS图像处理系统，在不同视野任意摄取5幅图像，计数单位面积内的有髓神经纤维数量，并计算每组各12个标本的平均值。③单位面积内阳性轴突计数，各组移植神经S-100蛋白免疫组化染色切片在40×10光镜下，运用MIAS进行图像分析，计数单位面积内的阳性轴突数，并计算每组各12个标本的平均值。
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1.3.3 统计学处理 应用Newman-Keuls多重比较法进行两两比较的q检验。
2 结果
2.1 移植神经的组织学变化 A组神经纤维排列规则，无明显神经变性，少量炎性细胞浸润和纤维组织增生，毛细血管增生不明显，髓鞘分布较均匀，厚薄一致，排列尚规则，髓鞘无明显肿胀。X组神经排列紊乱，伴空泡变性，大量的炎性细胞浸润和纤维组织增生，毛细血管增生活跃，大部分髓鞘正常结构消失，外形不规则，髓鞘和轴突水肿，有的髓鞘肿胀呈气球状，有的呈颗粒状，有的溶解呈空泡状，脱髓鞘改变较明显，尤以神经纤维中央区为甚。R组组织学改变介于A组与X组之间(图1)。
2.2 各处理组胫前肌HE染色的组织学变化 A组肌纤维粗大，大小均匀一致，排列紧密，肌间隙较小，结缔组织和毛细血管增生不明显，无明显肌肉变性和炎性细胞浸润；R组肌纤维较粗，肌间隙较明显，排列尚规则，生长良好，少量结缔组织增生及炎性细胞浸润；X组肌纤维明显萎缩、细小，肌间隙增宽、肿胀，结缔组织和毛细血管增生明显。
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2.3 各处理组神经移植后胫前肌肌纤维截面积Newman-Keuls检验结果(表1)。
表1 胫前肌肌纤维截面积Newman-Keuls检验结果
异体移植组
辐照处理组
自体移植组
(
±s)1014±303
1154±105
1677±411
自体移植组
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辐照处理组
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注：每组样本n=100 ※表示P<0.05，差别有统计学意义 以上结果表明，用辐照处理的神经移植修复后，肌肉生长情况较好，但比自体神经修复效果较差，优于未经处理的异体神经移植。
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2.4 各处理组单位面积内有髓神经纤维数量Newman-Keuls检验结果(表2)。
图1 不同处理组术后12周移植神经(HE染色，纵切，40×10)
图2 不同处理组术后12周移植神经的超微结构(×6000)
表2 各处理组有髓神经纤维数Newman-Keuls检验结果 异体移植组(
±s) 55.3±5.5辐照处理组
73.2±4.0
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自体移植组
113.8±10.1
自体移植组 ※
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辐照处理组 ※
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注：每组样本n=60
※表示P<0.05，差别有统计学意义
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从以上统计结果可以看出，自体神经移植后，再生的神经纤维数量最多，其次是辐照处理组，未经处理的异体移植神经再生情况最差。
2.5 S-100蛋白与波形蛋白免疫组化染色。各处理组单位面积内的S-100蛋白阳性轴突数Newman-Keuls检验结果(表3)。表3 单位面积内S-100蛋白阳性轴突数
Newman-Keuls检验结果 异体移植组(
±s)42.3±7.5
辐照处理组71.8±8.4
自体移植组92.7±10.1
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注：每组样本n=60
※表示P<0.05，差别有统计学意义
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2.6 电镜观察A组和R组均可见神经轴突发育良好，呈规则椭圆形，髓鞘壁厚，板层致密，轴浆内富含神经微丝和微管，部分轴索内可见线粒体。X组髓鞘雪旺氏细胞基膜与轴突分离，髓鞘肿胀，厚薄不均，有的皱褶分裂，髓鞘板层松散，有的溶解消失呈空泡状，有的雪旺氏细胞膜水肿，线粒体空化坏死、崩解(图2)。
3 讨论
3.1 实验结果评价 术后12周，分别对移植神经和胫前肌HE染色，移植神经S-100蛋白及波形蛋白免疫组化和甲苯胺蓝染色后的组织学观察，单位面积内阳性轴突和再生的有髓神经纤维计数，结果表明：放射辐照处理的移植神经、纤维组织增生和炎性细胞浸润较少，胫前肌生长良好，再生有髓神经纤维增多(与异体对照组比较，P<0.05)，单位面积内的阳性轴突数明显增多(P<0.05)，因此推测：放射辐照处理可降低异体神经的抗原性。
3.2 放射辐照机理探讨 周围神经的长段缺损需要通过组织移植才能达到修复。自体神经移植修复的效果最好，但其来源有限[2～3]。同种异体神经移植，由于供体和受体间组织相容性的差异，引起程度不同的免疫排斥反应，导致移植神经崩解、吸收，淋巴细胞浸润损害神经内膜组织，包括基底膜管，因此阻碍了移植神经中轴突通过[4～5]。Marmor[6]应用放射辐照来降低异体神经的排斥反应，并取得了一定的效果。其作用机理可能是利用X射线杀死雪旺氏细胞，破坏其继续分泌抗原物质的功能，并通过保留的神经膜管结构支架，使周围神经得以再生。另外，液氮冷冻，戊二醛和酒精等处理异体神经降低其抗原性已有报道，孰优孰劣， 有待进一步研究。作者简介：李建兵(1967-)，男，湖南益阳人，主治医师
, 百拇医药
参考文献：
[1]胡韶楠,徐建光,袁 伟,等.臂丛神经节前损伤的大鼠动物模型[J].中华手外科杂志,1996,12(2):120.
[2]Sundland S.Nerves and nerve injuries[M].Churchill,Livingstone,Edingburg and New York,1978,108.
[3]Staniforth P,Fisher TR.The effects of sural nerve excision in autogenous nerve grafting[J].Hand,1978,10(2):187.
[4]Tajima K,Tohyama K,Ide C,et al.Regeneration through nerve allografts in the cynomolgus monkey(Macaca fascicularis)[J].J Bone Joint Surg Am,1991,73(2):172.
[5]朱家恺,刘军犀.周围神经外科的回顾与展望[J].中华显微外科杂志,1990,13(1):35.
[6]Marmor J.Regeneration of peripheral nerve by irradiated homografts[J].J Bone Joint Surg,1964,46(A):383.
收稿日期：1999-12-23, http://www.100md.com