L-精氨酸在重症胰腺炎并发急性肺损伤中的作用
作者：陈哲京 陈祥建 陈必成 张启瑜
单位：作者单位：浙江温州医学院附属一院普外科(325000)
关键词：胰腺炎；肺损伤；L-精氯酸
990212 摘 要 目的 探讨L-精氨酸在重症胰腺炎并发急性肺损伤中的作用。方法：经大鼠胰管注射牛磺胆酸钠制备实验性胰腺炎并发急性肺损伤模型，分别注射L-精氨酸、山莨菪碱、生理盐水。测定肺湿重，血清淀粉酶、丙二醛、肿瘤坏死因子及观察胰、肺病理变化。结果 L-精氨酸、山莨菪碱对急性胰腺炎并发肺损伤均有一定的治疗效果(血淀粉酶下降、肺湿重减轻、胰腺和肺的病理变化减轻)，L-精氨酸的作用明显强于山莨菪碱。结论 L-精氨酸及其生成物NO生物活性广泛，在急性胰腺炎并发肺损伤实验鼠中应用时，能明显减轻胰、肺的病变，对急性胰腺炎并发肺损伤具有一定的治疗作用。
重症急性胰腺炎临床上常并发多器官损伤，其中并发急性肺损伤者病死率高于50%。因此寻找一种新的治疗药物和方法已成为医学界关注的课题。近年来不少学者通过实验研究发现以L-精氨酸(L-Arg)为底物合成的一氧化氮(NO)是体内一种强大的血管舒张因子，具有改善胰腺炎微循环障碍的作用，并能清除氧自由基，对胰腺炎及其并发症有一定的治疗作用[1,2,3]。我们给大鼠胰管注射牛磺胆酸钠制备实验性胰腺炎并发急性肺损伤模型，早期静脉输入L-Arg以增加内源性NO浓度从而改善胰腺炎微循环障碍及减少氧自由基对机体内脏的损伤，并与静脉输入东莨菪碱的大鼠进行比较，以期进一步了解L-Arg对急性胰腺炎及其并发肺损伤的防治效果。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物分组 Sprague-Dawley大鼠49只，体重260～300g(280±20g)，雌雄不拘，随机分为四组：A，假手术组(n=10)；B，胰腺炎组(n=16)；C，精氨酸组(n=10)；D，山莨菪碱组(n=13)。
1.2 主要试剂 L-Arg(上海信谊药厂，批号980602-3)；牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)制成3.5%溶液，过滤法灭菌；戊巴比妥钠(广州化学试剂厂)，制成2%溶液，过滤法灭菌；山莨菪碱；生理盐水；亚甲兰溶液。
1.3 方法
1.3.1 模型制备：用2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取上腹正中切口，长约2cm，A组仅翻动胰腺，不做成急性出血性坏死性胰腺炎，尾静脉注射生理盐水。B、C、D组于胰腺中部找到胰胆管，在胰胆管近十二指肠降部端剪一小口，逆行插入连硬麻醉导管，深约1cm，于肝门处用静脉夹夹住胰胆管入肝处，从连硬导管内缓慢注入3.5%牛磺胆酸钠(52.5mg/kg)，约3～4分钟注完。期间即可见胰腺组织充血、水肿。注完后抽出连硬导管，捏住破口约3～4分钟。可见包膜下胰腺组织点状或小片状出血。然后用丝线缝扎破口。移去静脉夹，检查无出血后逐层关腹。关腹后于大鼠皮下分两处注入温生理盐水4ml。尾静脉穿刺，B组注入生理盐水2ml，C组注入L-Arg(1 000mg/kg)，D组注入山莨菪碱(5mg/kg)。观察24小时，取死亡动物(B组4只，D组2只)胰腺、肺脏浸泡于10%福尔马林固定，石蜡包埋。对未死亡动物行活杀，下腔静脉采血，量约5～6ml，迅速离心后(2 000r/min,4min)取上清液分置于3支离心管中，置于-20℃冰箱中内冷冻、保存。解剖动物尸体，取胰腺、肺脏如上法固定，石蜡包埋，HE染色，行病理检查。
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1.3.2 血清淀粉酶测定(碘比色法)：试剂盒由宁波磁城生化试剂厂生产。
1.3.3 肺脏湿重测定：用扭力天平(上海第二天平仪器厂)称肺脏湿重，以占体重百分比换算成肺指数表示。
1.3.4 血清肿瘤坏死因子(TNFα)测定(ELISA法)：试剂盒由深圳晶美生物技术公司生产。
1.3.5 血清丙二醛(MDA)测定(比色法)：试剂盒由福州迈新生物技术公司生产。
1.3.6 形态学观察：处死及死亡大鼠胰腺和肺标本进行光镜检查。
1.3.7 统计学分析：采用t检验。
2 结果
2.1 血清淀粉酶、肺指数、肿瘤坏死因子及丙二醛值见附表。
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附表 各组大鼠血清淀粉酶、肺指数、肿瘤坏死因子及丙二醛值比较 (x±s) 组别
只数
淀粉酶
肺指数
TNFα(ng/L)
MDA(μmol/L)
假手术组
10
3157.1±802.3
0.511±0.031
19.50±3.58
, 百拇医药
2.090±0.536
胰腺炎组
12
24419.3±7564.4**
0.686±0.025***
31.12±4.99***
10.010±2.114***
精氨酸组
10
19504.3±6824.8**▲
, 百拇医药
0.509±0.01▲▲▲△
25.70±2.97***▲▲△
5.945±1.372**▲▲▲△△
山莨菪碱组
11
14714.5±7991.7*▲
0.537±0.021*▲▲▲
29.16±4.43***
7.906±1.129***
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注：(1)与假手术组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(2)与胰腺炎组相比：▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001。(3)精氨酸组与东莨菪碱组相比：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。
2.2 形态学观察
在光镜下观察：(1)胰腺炎组：肺间质出血，弥漫性肺泡破裂。胰腺间质疏松水肿，大量出血，炎细胞浸润，小叶片状坏死。(2)精氨酸组：肺基本正常。胰腺间质疏松水肿，少量出血，炎细胞浸润，偶见小片状坏死。(3)山莨菪碱组：部分肺标本见间质疏松水肿，炎细胞浸润。胰腺间质疏松水肿，出血，炎细胞浸润，小叶小片状坏死。
3 讨论
急性出血性坏死性胰腺炎常并发多脏器损伤，当并发急性肺损伤时，表现为成人呼吸窘迫综合征(ARDS)或急性呼衰，其临床和病理过程与其它原因引起的ARDS无明显差别。目前认为急性胰腺炎并发肺损伤多为胰酶和细胞因子两大因素作用引起的肺循环障碍的结果。近年来，细胞因子在急性胰腺炎并发肺损伤中的作用受到了各方面的重视，其中(TNFα)被认为是最重要的一种细胞因子，其在急性胰腺炎细胞因子的瀑布式释放中起第一位因子的作用。TNFα对肺的损伤作用主要有：①刺激中性粒细胞(PMN)合成和释放TNFα，使炎性介质瀑布反应放大，增强其破坏作用[4]。②肺毛细血管通透性增加[5]。③激活凝血系统、抑制纤溶系统、激活补体系统。④TNFα及微血栓可刺激内皮细胞产生内皮素(ET)，引起肺动脉高压。⑤激活中性粒细胞脱颗粒和产生氧自由基。目前，临床上常采用药物抑制胰酶分泌，穿刺或手术引流胰液，以减轻胰酶对各器官的损伤。但如何在此基础上应用分子生物学原理，寻找新的药物拮抗细胞因子，达到保护胰腺和各重要脏器的目的，已成为国内外学者研究的新课题。
, 百拇医药
近来实验研究表明：L-Arg及其体内代谢活性产物NO能有效改善胰腺微循环、抑制白细胞—内皮细胞相互作用，增强机体免疫能力，对急性胰腺炎具有保护作用[6]。其改善微循环主要通过：①舒张血管平滑肌，②抑制血小板粘附和聚集，抗血栓形成，③NO携带一额外电子(不成对电子，具有“顺磁性”)而具有清除氧自由基的能力，④抑制细胞因子生成。
本实验发现经静脉注射L-Arg、山莨菪碱两治疗组均有一定的治疗效果(血淀粉酶下降、肺湿重减轻、胰腺和肺的病理变化减轻)，而L-Arg的作用明显强于山莨菪碱。可见L-Arg能显著降低胰腺炎实验鼠血中MDA(P<0.001)，再次说明NO具有消除氧自由基的作用。同时还发现L-Arg能明显降低胰腺炎实验鼠血中TNFα浓度(P<0.01)，其机制可能是：①NO减少胰酶释放[7]，②NO清除氧自由基，减轻其对机体的损伤，而减少TNFα的生成，③NO是否能直接减低TNFα水平尚难确定。
, 百拇医药
总之，L-Arg及其生成物NO生物活性广泛，在急性胰腺炎并发肺损伤实验鼠中应用时，能明显减轻胰、肺的病变，对急性胰腺炎并发肺损伤具有一定的治疗作用，但其临床应用价值有待进一步观察。
参考文献
1 Hoffman RA,Langrehr JM,Billiar TR,et al.Alloantigeninduced activation of rat splenocytes is regulated by the oxidative metabolism of L-arginine.J Immunol,1990,145(7)∶2220～2226
2 Konturek SJ,Bilski J,Konturek PK,et al.Role of endogenous nitric oxide in the control of canine pancreatic secretion and blood flow.Gastroenterology,1993,104(3)∶896～902
, http://www.100md.com
3 Lopez Belmonte J,Whittle BJ,Moncada S.The actions of nitric oxide donors in the prevention or induction of injury to the rat gastric mucosa.Br J Pharmacol,1993,108(1)∶73～78
4 Ertel W,Morrison MH,Wang P,et al.The complex pattern of cytokines in sepsis.Association between prostaglandins,cachectin,and interleukins.Ann Surg,1991,214(2)∶141～148
5 Horton JW,Burnweit CA.Hemodynamic function in acute pancreatitis.Surgery,1988,103(5)∶538～546
6 吴云.精氨酸与急性胰腺炎.国外医学，1998，25(5)∶275～277
7 Galloway SW,Kingsnorth AN, Lung injury in the microembolic model of acute pancreatitis and amelioration by lexipafant(BB-882),a platelet-activating factor antagonist.Pancreas,1996,13(2)∶140～146
(收稿:1999-04-21), 百拇医药
单位：作者单位：浙江温州医学院附属一院普外科(325000)
关键词：胰腺炎；肺损伤；L-精氯酸
990212 摘 要 目的 探讨L-精氨酸在重症胰腺炎并发急性肺损伤中的作用。方法：经大鼠胰管注射牛磺胆酸钠制备实验性胰腺炎并发急性肺损伤模型，分别注射L-精氨酸、山莨菪碱、生理盐水。测定肺湿重，血清淀粉酶、丙二醛、肿瘤坏死因子及观察胰、肺病理变化。结果 L-精氨酸、山莨菪碱对急性胰腺炎并发肺损伤均有一定的治疗效果(血淀粉酶下降、肺湿重减轻、胰腺和肺的病理变化减轻)，L-精氨酸的作用明显强于山莨菪碱。结论 L-精氨酸及其生成物NO生物活性广泛，在急性胰腺炎并发肺损伤实验鼠中应用时，能明显减轻胰、肺的病变，对急性胰腺炎并发肺损伤具有一定的治疗作用。
重症急性胰腺炎临床上常并发多器官损伤，其中并发急性肺损伤者病死率高于50%。因此寻找一种新的治疗药物和方法已成为医学界关注的课题。近年来不少学者通过实验研究发现以L-精氨酸(L-Arg)为底物合成的一氧化氮(NO)是体内一种强大的血管舒张因子，具有改善胰腺炎微循环障碍的作用，并能清除氧自由基，对胰腺炎及其并发症有一定的治疗作用[1,2,3]。我们给大鼠胰管注射牛磺胆酸钠制备实验性胰腺炎并发急性肺损伤模型，早期静脉输入L-Arg以增加内源性NO浓度从而改善胰腺炎微循环障碍及减少氧自由基对机体内脏的损伤，并与静脉输入东莨菪碱的大鼠进行比较，以期进一步了解L-Arg对急性胰腺炎及其并发肺损伤的防治效果。
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1 材料和方法
1.1 动物分组 Sprague-Dawley大鼠49只，体重260～300g(280±20g)，雌雄不拘，随机分为四组：A，假手术组(n=10)；B，胰腺炎组(n=16)；C，精氨酸组(n=10)；D，山莨菪碱组(n=13)。
1.2 主要试剂 L-Arg(上海信谊药厂，批号980602-3)；牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)制成3.5%溶液，过滤法灭菌；戊巴比妥钠(广州化学试剂厂)，制成2%溶液，过滤法灭菌；山莨菪碱；生理盐水；亚甲兰溶液。
1.3 方法
1.3.1 模型制备：用2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取上腹正中切口，长约2cm，A组仅翻动胰腺，不做成急性出血性坏死性胰腺炎，尾静脉注射生理盐水。B、C、D组于胰腺中部找到胰胆管，在胰胆管近十二指肠降部端剪一小口，逆行插入连硬麻醉导管，深约1cm，于肝门处用静脉夹夹住胰胆管入肝处，从连硬导管内缓慢注入3.5%牛磺胆酸钠(52.5mg/kg)，约3～4分钟注完。期间即可见胰腺组织充血、水肿。注完后抽出连硬导管，捏住破口约3～4分钟。可见包膜下胰腺组织点状或小片状出血。然后用丝线缝扎破口。移去静脉夹，检查无出血后逐层关腹。关腹后于大鼠皮下分两处注入温生理盐水4ml。尾静脉穿刺，B组注入生理盐水2ml，C组注入L-Arg(1 000mg/kg)，D组注入山莨菪碱(5mg/kg)。观察24小时，取死亡动物(B组4只，D组2只)胰腺、肺脏浸泡于10%福尔马林固定，石蜡包埋。对未死亡动物行活杀，下腔静脉采血，量约5～6ml，迅速离心后(2 000r/min,4min)取上清液分置于3支离心管中，置于-20℃冰箱中内冷冻、保存。解剖动物尸体，取胰腺、肺脏如上法固定，石蜡包埋，HE染色，行病理检查。
, 百拇医药
1.3.2 血清淀粉酶测定(碘比色法)：试剂盒由宁波磁城生化试剂厂生产。
1.3.3 肺脏湿重测定：用扭力天平(上海第二天平仪器厂)称肺脏湿重，以占体重百分比换算成肺指数表示。
1.3.4 血清肿瘤坏死因子(TNFα)测定(ELISA法)：试剂盒由深圳晶美生物技术公司生产。
1.3.5 血清丙二醛(MDA)测定(比色法)：试剂盒由福州迈新生物技术公司生产。
1.3.6 形态学观察：处死及死亡大鼠胰腺和肺标本进行光镜检查。
1.3.7 统计学分析：采用t检验。
2 结果
2.1 血清淀粉酶、肺指数、肿瘤坏死因子及丙二醛值见附表。
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附表 各组大鼠血清淀粉酶、肺指数、肿瘤坏死因子及丙二醛值比较 (x±s) 组别
只数
淀粉酶
肺指数
TNFα(ng/L)
MDA(μmol/L)
假手术组
10
3157.1±802.3
0.511±0.031
19.50±3.58
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2.090±0.536
胰腺炎组
12
24419.3±7564.4**
0.686±0.025***
31.12±4.99***
10.010±2.114***
精氨酸组
10
19504.3±6824.8**▲
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0.509±0.01▲▲▲△
25.70±2.97***▲▲△
5.945±1.372**▲▲▲△△
山莨菪碱组
11
14714.5±7991.7*▲
0.537±0.021*▲▲▲
29.16±4.43***
7.906±1.129***
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注：(1)与假手术组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(2)与胰腺炎组相比：▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001。(3)精氨酸组与东莨菪碱组相比：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。
2.2 形态学观察
在光镜下观察：(1)胰腺炎组：肺间质出血，弥漫性肺泡破裂。胰腺间质疏松水肿，大量出血，炎细胞浸润，小叶片状坏死。(2)精氨酸组：肺基本正常。胰腺间质疏松水肿，少量出血，炎细胞浸润，偶见小片状坏死。(3)山莨菪碱组：部分肺标本见间质疏松水肿，炎细胞浸润。胰腺间质疏松水肿，出血，炎细胞浸润，小叶小片状坏死。
3 讨论
急性出血性坏死性胰腺炎常并发多脏器损伤，当并发急性肺损伤时，表现为成人呼吸窘迫综合征(ARDS)或急性呼衰，其临床和病理过程与其它原因引起的ARDS无明显差别。目前认为急性胰腺炎并发肺损伤多为胰酶和细胞因子两大因素作用引起的肺循环障碍的结果。近年来，细胞因子在急性胰腺炎并发肺损伤中的作用受到了各方面的重视，其中(TNFα)被认为是最重要的一种细胞因子，其在急性胰腺炎细胞因子的瀑布式释放中起第一位因子的作用。TNFα对肺的损伤作用主要有：①刺激中性粒细胞(PMN)合成和释放TNFα，使炎性介质瀑布反应放大，增强其破坏作用[4]。②肺毛细血管通透性增加[5]。③激活凝血系统、抑制纤溶系统、激活补体系统。④TNFα及微血栓可刺激内皮细胞产生内皮素(ET)，引起肺动脉高压。⑤激活中性粒细胞脱颗粒和产生氧自由基。目前，临床上常采用药物抑制胰酶分泌，穿刺或手术引流胰液，以减轻胰酶对各器官的损伤。但如何在此基础上应用分子生物学原理，寻找新的药物拮抗细胞因子，达到保护胰腺和各重要脏器的目的，已成为国内外学者研究的新课题。
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近来实验研究表明：L-Arg及其体内代谢活性产物NO能有效改善胰腺微循环、抑制白细胞—内皮细胞相互作用，增强机体免疫能力，对急性胰腺炎具有保护作用[6]。其改善微循环主要通过：①舒张血管平滑肌，②抑制血小板粘附和聚集，抗血栓形成，③NO携带一额外电子(不成对电子，具有“顺磁性”)而具有清除氧自由基的能力，④抑制细胞因子生成。
本实验发现经静脉注射L-Arg、山莨菪碱两治疗组均有一定的治疗效果(血淀粉酶下降、肺湿重减轻、胰腺和肺的病理变化减轻)，而L-Arg的作用明显强于山莨菪碱。可见L-Arg能显著降低胰腺炎实验鼠血中MDA(P<0.001)，再次说明NO具有消除氧自由基的作用。同时还发现L-Arg能明显降低胰腺炎实验鼠血中TNFα浓度(P<0.01)，其机制可能是：①NO减少胰酶释放[7]，②NO清除氧自由基，减轻其对机体的损伤，而减少TNFα的生成，③NO是否能直接减低TNFα水平尚难确定。
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总之，L-Arg及其生成物NO生物活性广泛，在急性胰腺炎并发肺损伤实验鼠中应用时，能明显减轻胰、肺的病变，对急性胰腺炎并发肺损伤具有一定的治疗作用，但其临床应用价值有待进一步观察。
参考文献
1 Hoffman RA,Langrehr JM,Billiar TR,et al.Alloantigeninduced activation of rat splenocytes is regulated by the oxidative metabolism of L-arginine.J Immunol,1990,145(7)∶2220～2226
2 Konturek SJ,Bilski J,Konturek PK,et al.Role of endogenous nitric oxide in the control of canine pancreatic secretion and blood flow.Gastroenterology,1993,104(3)∶896～902
, http://www.100md.com
3 Lopez Belmonte J,Whittle BJ,Moncada S.The actions of nitric oxide donors in the prevention or induction of injury to the rat gastric mucosa.Br J Pharmacol,1993,108(1)∶73～78
4 Ertel W,Morrison MH,Wang P,et al.The complex pattern of cytokines in sepsis.Association between prostaglandins,cachectin,and interleukins.Ann Surg,1991,214(2)∶141～148
5 Horton JW,Burnweit CA.Hemodynamic function in acute pancreatitis.Surgery,1988,103(5)∶538～546
6 吴云.精氨酸与急性胰腺炎.国外医学，1998，25(5)∶275～277
7 Galloway SW,Kingsnorth AN, Lung injury in the microembolic model of acute pancreatitis and amelioration by lexipafant(BB-882),a platelet-activating factor antagonist.Pancreas,1996,13(2)∶140～146
(收稿:1999-04-21), 百拇医药