成釉细胞瘤中bmp2基因突变的发现
作者：岳文 杨连甲 朱峰 晏伟
单位：岳文 杨连甲(第四军医大学口腔医学院 病理科 710032)；朱峰(生化教研室)；晏伟(病理教研室)
关键词：成釉细胞瘤；骨形成蛋白；基因；突变
实用口腔医学杂志000505
〔摘要〕 目的：分析成釉细胞瘤组织中bmp2成熟肽基因片段的序列，探讨bmp2基因突变存在的可能性以明确其病理机制。方法：提取肿瘤组织中的RNA，用RT-PCR方法得到bmp2成熟肽基因片段，克隆后进行序列测定和分析。结果：首次发现成釉细胞瘤组织中有bmp2基因突变：AAG→AAA，GAG→AAG，并引起相应多肽的结构改变。结论：成釉细胞瘤中存在bmp2基因突变，并有可能在病理机制中起重要作用。
中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0348-03
, 百拇医药
Gene mutation of bmp2 in ameloblastoma
Yue Wen Yang Lianjia Zhu Feng
(Department of Oral Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an,710032)
〔Abstract〕Objective:To analyse the gene coding bmp2 mature region and to study the bmp's gene mutation in ameloblastma.Methods:The cDNA fragement of bmp2 mature region was cloned from RNA with RT-PCR method.After ligased to T vetor,the fragement was sequenced and anlysised.Results:bmp's gene mutation was demonstrated in ameloblastoma:AAG→AAA,GAG→AAG.Genetic changes lead to the alterations of the encoded protein.Conclusion:bmp2 gene mutation may take an important role in pathogenesis of ameloblastoma.
, 百拇医药
Key word Ameloblastoma;Bone morphogenetic proteins;Gene;Mutation
在成釉细胞瘤组织中可以检测到骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,简称BMPs)的表达和bmp2基因的扩增〔1〕。然而在成釉器中参与牙釉质和牙本质形成并具有诱导异位骨形成特性的BMP在成釉细胞瘤中并未引起硬组织的形成，其中很可能的一个原因就是BMP本身的诱骨活性发生了改变。本实验作者提取有BMP表达和bmp2基因扩增的成釉细胞瘤组织中的RNA，通过RT-PCR方法得到bmp2的成熟肽基因片段，对其进行序列分析，以探讨成釉细胞瘤组织中bmp2基因突变的可能性，为明确其病理机制打下基础。
1 材料和方法
1.1 标本来源
所有标本来源于第四军医大学口腔医院。取手术切除标本，标本离体后立即放入液氮中储存，用于RNA的提取。相应标本的另一部分常规石蜡包埋，连续组织切片，用于HE染色、原位杂交和免疫组化的检测。挑取3例常规病理诊断为成釉细胞瘤并且免疫组化检测到BMP蛋白的表达、原位杂交可检测到bmp2 cDNA扩增的病例作为研究对象，2例骨肉瘤标本作为阳性对照。
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1.2 组织中RNA的提取
用异硫氰酸胍方法提取组织中的RNA：用高速均浆器搅匀冰冻变性液中的组织后(每100 mg组织加入1 ml变性液)，每毫升变性液中加入0.1 ml的醋酸钠(2 mol/L,pH4)，颠倒充分混匀。等体积加入酚、氯仿和异戊醇，充分混匀，冰水冷却10 min，离心后吸取上清，加入相同体积的异丙醇抽提。DEPC处理过的水重悬RNA，测定A260/A280比值，以检验RNA的提取质量。
1.3 RT-PCR反应
1.3.1 针对BMP2的成熟肽片段设计两条引物
primer l:GGAAAAGGGCATCCTCTCCACA;
primer 2:CCTCCCAACACCCACAGCGA.
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计算机分析表明，引物设计符合要求。引物由美联生物工程公司合成，PAGE纯化，A=2。
1.3.2 对提取的RNA反转录 RNA 10 μl和olig(dt)1 μl混匀，70 ℃水浴10 min，加入5×AMV buffer(4 μl)、RNAasin(1 μl)、sodium pyropsphate(2.5 μl)、AMV(1.5 μl)。42 ℃水浴2 h，即时冰浴5 min。
1.3.3 PCR反应 50 μl反应体系中，依次加入DEPC水(29 μl)、5×AMV/Tfl buffer(10 μl)、MgSO4(3 μl)、primer l(2 μl)、primer 2(2 μl)、模板(2 μl)、dNTP(1 μl)、TflDNA polymrase(1 μl)。PCR反应条件为95 ℃、20 s、60 ℃、30 s、72 ℃、1 min，40个循环；72 ℃、30 min。电泳检测PCR反应结果。
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1.4 PCR产物的克隆、鉴定
PCR反应产物回收后与T vector连接，取PCR产物7 μl、T vector 1 μl、buffer 2 μl、T4 DNAligase 1 μl、去离子水9 μl，16 ℃，过夜。将连接产物转化感受态细胞后(加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选)，挑取白色克隆，提取质粒后进行PCR鉴定。
1.5 对阳性克隆的质粒提取、纯化，进行自动序列测定。
1.6 计算机分析序列测定结果。
2 结 果
2.1 提取的3例成釉细胞瘤和2例骨肉瘤标本的RNA的A260/A280，均位在1.7～2.0，说明提取的RNA符合要求。
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2.2 PCR结果如图1所示，3例成釉细胞瘤标本及2例对照的骨肉瘤标本均出现阳性条带，对照PCRmaker，产物片段为340 bp左右。初步判断克隆到bmp2 cDNA的成熟肽片段。
2.3 PCR克隆及其鉴定结果表明，PCR产物与载体连接后转化JM109的感受态细胞。次日在接种板上发现白色克隆。分别挑取2个克隆做PCR鉴定，3例标本的6个克隆除1例外均出现阳性条带。选择来源于不同病例的3个阳性克隆提取质粒后进行自动测序。
图1 PCR结果
A成釉细胞毒；0骨肉瘤
2.4 利用计算机网络对序列测定结果进行分析。结果表明1例成釉细胞瘤组织中的bmp2成熟肽片段出现两处基因变异(图2)：1389 bp处G→A，从而使密码子GAT→AAT，但此处突变未造成编码氨基酸I(异亮氨酸)的改变。另外一处为1450 bp处G→A，密码子CGA→CAA，所编码的氨基酸由E(谷氨酸)→K(赖氨酸)。进一步分析表明：基因变异导致所编码氨基酸发生改变，从而引起相应多肽结构发生变异，影响蛋白质的理化性质(图3)。
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图2 骨肉瘤(0)和成釉细胞瘤(A)bmp2成熟肽基因序列比较
骨肉瘤中突变bmp2成熟肽片段所编码的氨基酸
K Q R K R L K S S C K R H P L Y V D F S D V G W N D W I V A P P G Y H A F Y C
H G E C P F P L A D H L N S T N H A I V Q T L V N S V N S K I P K A C C V P T
E L S A I S M L Y L D E N E K V V L K N Y Q D M V V E G C G C
成釉细胞瘤中突变的bmp2成熟肽片段所编码的氨基酸
, 百拇医药
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图3 骨肉瘤和成釉细胞瘤突变的bmp2成熟肽片段编码的氨基酸比较
3 讨 论
作者在前一部分的研究中发现成釉细胞瘤组织中有丰富的BMP蛋白的表达和bmp2、4 mRNA的扩增，但瘤组织本身并无骨组织的形成。这是比较引人注意的问题，因为BMP在成釉器中可以起到诱导牙釉质和牙本质形成的作用，而BMP的最基本的特性就是可以引起异位骨组织的形成。骨肿瘤中的肿瘤性骨组织的形成正是BMP作用于肿瘤细胞的结果〔2〕。在一些上皮性的肿瘤组织中有时也可见到骨组织的产生，例如多形性腺瘤中可见到类软骨组织的存在，在这些肿瘤组织中也检测到了BMP的存在，推测这些上皮性肿瘤中的骨组织也是BMP作用于肌上皮细胞的结果〔3〕。这些都说明BMP与肿瘤中骨的生成有非常密切的关系。成釉细胞瘤中未见骨组织形成的原因可能有两方面：一是肿瘤细胞本身无成骨能力，二是成釉细胞瘤中虽有BMP的表达和基因的扩增，但是此时BMP已发生了某些性质的改变，丧失了其诱骨活性。高玉好〔4〕将成釉细胞瘤的肿瘤组织种植于实验用鼠，亦未见到骨组织的形成，而骨肉瘤组织在同样情况下可以诱导骨组织形成。提示成釉细胞瘤中BMP本身发生改变的可能性较大，而造成蛋白性质改变的最直接的原因之一就是其基因突变。
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关于肿瘤中BMP突变的问题，国内外尚未有人检测，也无资料提示BMP的哪些位点容易发生突变。作者选择bmp2开放读框中编码成熟肽的基因片段作为检测对象。因为BMP家族中与肿瘤关系最为密切的就是bmp2，选择成熟肽片段是因为从BMP的合成过程来看，首先在细胞内合成其前体蛋白(信号肽、前肽区、成熟肽)，前体蛋白在出胞浆的过程中，其他部分脱落而仅有成熟肽以其二聚体形式发挥作用，成熟肽是其生物学性状的决定因素〔5〕。测序结果发现：bmp2编码成熟肽片段的基因发生了个别碱基的改变，并造成了其编码氨基酸的改变，从而引起其多肽结构和蛋白理化性状的改变，这就有可能造成BMP蛋白功能的改变，例如使其诱骨活性丧失。
但并非所有的在成釉细胞瘤组织中的bmp2基因可检测到突变，这是因为造成蛋白质性能改变的原因非常之多，基因的错义突变仅是其可能性之一，此外还应有许多其他的因素产生影响〔6〕。另外成釉细胞瘤中可能有多种BMP家族成员，bmp2是其中重要的一种但并非全部，其他BMP家族成员的改变也可以造成肿瘤生物学特性的改变。
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分析肿瘤基因突变是一个非常复杂的问题和过程。本次实验作者首先发现成釉细胞瘤中bmp2基因突变的存在，为以后进一步的研究打下基础。若收集大量标本，克隆其bmp cDNA进行测序，得到突变率较高的位点，进行统计分析后将有可能得到更加完整可靠的结论，这也是作者下一步所致力解决的问题。
参考文献
1，岳文,杨连甲,金岩.骨形成蛋白及其mRNA基因在成釉细胞瘤中的表达.实用口腔医学杂志,1999,15(3):166
2，Jin Y,Yang LJ.The relationship between bone morphogenetic protein and neoplastic bone disease.Clin Orthop,1990,259:233
3，Hatakeyama S,Gao YH,Ohara-Nemoto Y,et al.Expression of bone morphogenetic protein in human neoplastic epithelial cells.Biochem Mol Biol Int,1997,42(3):497
, 百拇医药
4，Gao YH,Yang LJ,Yamaguchi A.Immunohistochemical demonstration of bone morphogenetic protein in odontogenic tumors.J Oral Pathol Med,1997,26(6):273
5，杨连甲,金岩,胡蕴玉,主编.口腔和骨科的生物活性材料.西安：陕西科学技术出版社,1993.246
6，Beroud C,Verdier F,Soussi T.p53 gene mutation:Sofeware and database.Nucleic Acids Res,1996,24(1):147
(收稿：1999-04-03修回：1999-11-05), 百拇医药
单位：岳文 杨连甲(第四军医大学口腔医学院 病理科 710032)；朱峰(生化教研室)；晏伟(病理教研室)
关键词：成釉细胞瘤；骨形成蛋白；基因；突变
实用口腔医学杂志000505
〔摘要〕 目的：分析成釉细胞瘤组织中bmp2成熟肽基因片段的序列，探讨bmp2基因突变存在的可能性以明确其病理机制。方法：提取肿瘤组织中的RNA，用RT-PCR方法得到bmp2成熟肽基因片段，克隆后进行序列测定和分析。结果：首次发现成釉细胞瘤组织中有bmp2基因突变：AAG→AAA，GAG→AAG，并引起相应多肽的结构改变。结论：成釉细胞瘤中存在bmp2基因突变，并有可能在病理机制中起重要作用。
中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0348-03
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Gene mutation of bmp2 in ameloblastoma
Yue Wen Yang Lianjia Zhu Feng
(Department of Oral Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an,710032)
〔Abstract〕Objective:To analyse the gene coding bmp2 mature region and to study the bmp's gene mutation in ameloblastma.Methods:The cDNA fragement of bmp2 mature region was cloned from RNA with RT-PCR method.After ligased to T vetor,the fragement was sequenced and anlysised.Results:bmp's gene mutation was demonstrated in ameloblastoma:AAG→AAA,GAG→AAG.Genetic changes lead to the alterations of the encoded protein.Conclusion:bmp2 gene mutation may take an important role in pathogenesis of ameloblastoma.
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Key word Ameloblastoma;Bone morphogenetic proteins;Gene;Mutation
在成釉细胞瘤组织中可以检测到骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,简称BMPs)的表达和bmp2基因的扩增〔1〕。然而在成釉器中参与牙釉质和牙本质形成并具有诱导异位骨形成特性的BMP在成釉细胞瘤中并未引起硬组织的形成，其中很可能的一个原因就是BMP本身的诱骨活性发生了改变。本实验作者提取有BMP表达和bmp2基因扩增的成釉细胞瘤组织中的RNA，通过RT-PCR方法得到bmp2的成熟肽基因片段，对其进行序列分析，以探讨成釉细胞瘤组织中bmp2基因突变的可能性，为明确其病理机制打下基础。
1 材料和方法
1.1 标本来源
所有标本来源于第四军医大学口腔医院。取手术切除标本，标本离体后立即放入液氮中储存，用于RNA的提取。相应标本的另一部分常规石蜡包埋，连续组织切片，用于HE染色、原位杂交和免疫组化的检测。挑取3例常规病理诊断为成釉细胞瘤并且免疫组化检测到BMP蛋白的表达、原位杂交可检测到bmp2 cDNA扩增的病例作为研究对象，2例骨肉瘤标本作为阳性对照。
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1.2 组织中RNA的提取
用异硫氰酸胍方法提取组织中的RNA：用高速均浆器搅匀冰冻变性液中的组织后(每100 mg组织加入1 ml变性液)，每毫升变性液中加入0.1 ml的醋酸钠(2 mol/L,pH4)，颠倒充分混匀。等体积加入酚、氯仿和异戊醇，充分混匀，冰水冷却10 min，离心后吸取上清，加入相同体积的异丙醇抽提。DEPC处理过的水重悬RNA，测定A260/A280比值，以检验RNA的提取质量。
1.3 RT-PCR反应
1.3.1 针对BMP2的成熟肽片段设计两条引物
primer l:GGAAAAGGGCATCCTCTCCACA;
primer 2:CCTCCCAACACCCACAGCGA.
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计算机分析表明，引物设计符合要求。引物由美联生物工程公司合成，PAGE纯化，A=2。
1.3.2 对提取的RNA反转录 RNA 10 μl和olig(dt)1 μl混匀，70 ℃水浴10 min，加入5×AMV buffer(4 μl)、RNAasin(1 μl)、sodium pyropsphate(2.5 μl)、AMV(1.5 μl)。42 ℃水浴2 h，即时冰浴5 min。
1.3.3 PCR反应 50 μl反应体系中，依次加入DEPC水(29 μl)、5×AMV/Tfl buffer(10 μl)、MgSO4(3 μl)、primer l(2 μl)、primer 2(2 μl)、模板(2 μl)、dNTP(1 μl)、TflDNA polymrase(1 μl)。PCR反应条件为95 ℃、20 s、60 ℃、30 s、72 ℃、1 min，40个循环；72 ℃、30 min。电泳检测PCR反应结果。
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1.4 PCR产物的克隆、鉴定
PCR反应产物回收后与T vector连接，取PCR产物7 μl、T vector 1 μl、buffer 2 μl、T4 DNAligase 1 μl、去离子水9 μl，16 ℃，过夜。将连接产物转化感受态细胞后(加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选)，挑取白色克隆，提取质粒后进行PCR鉴定。
1.5 对阳性克隆的质粒提取、纯化，进行自动序列测定。
1.6 计算机分析序列测定结果。
2 结 果
2.1 提取的3例成釉细胞瘤和2例骨肉瘤标本的RNA的A260/A280，均位在1.7～2.0，说明提取的RNA符合要求。
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2.2 PCR结果如图1所示，3例成釉细胞瘤标本及2例对照的骨肉瘤标本均出现阳性条带，对照PCRmaker，产物片段为340 bp左右。初步判断克隆到bmp2 cDNA的成熟肽片段。
2.3 PCR克隆及其鉴定结果表明，PCR产物与载体连接后转化JM109的感受态细胞。次日在接种板上发现白色克隆。分别挑取2个克隆做PCR鉴定，3例标本的6个克隆除1例外均出现阳性条带。选择来源于不同病例的3个阳性克隆提取质粒后进行自动测序。
图1 PCR结果
A成釉细胞毒；0骨肉瘤
2.4 利用计算机网络对序列测定结果进行分析。结果表明1例成釉细胞瘤组织中的bmp2成熟肽片段出现两处基因变异(图2)：1389 bp处G→A，从而使密码子GAT→AAT，但此处突变未造成编码氨基酸I(异亮氨酸)的改变。另外一处为1450 bp处G→A，密码子CGA→CAA，所编码的氨基酸由E(谷氨酸)→K(赖氨酸)。进一步分析表明：基因变异导致所编码氨基酸发生改变，从而引起相应多肽结构发生变异，影响蛋白质的理化性质(图3)。
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图2 骨肉瘤(0)和成釉细胞瘤(A)bmp2成熟肽基因序列比较
骨肉瘤中突变bmp2成熟肽片段所编码的氨基酸
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成釉细胞瘤中突变的bmp2成熟肽片段所编码的氨基酸
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H G E C P F P L A D H L N S T N H A I V Q T L V N S V N S K I P K A C C V P T
E L S A I S M L Y L D K N E K V V L K N Y Q D M V V E G C G C
图3 骨肉瘤和成釉细胞瘤突变的bmp2成熟肽片段编码的氨基酸比较
3 讨 论
作者在前一部分的研究中发现成釉细胞瘤组织中有丰富的BMP蛋白的表达和bmp2、4 mRNA的扩增，但瘤组织本身并无骨组织的形成。这是比较引人注意的问题，因为BMP在成釉器中可以起到诱导牙釉质和牙本质形成的作用，而BMP的最基本的特性就是可以引起异位骨组织的形成。骨肿瘤中的肿瘤性骨组织的形成正是BMP作用于肿瘤细胞的结果〔2〕。在一些上皮性的肿瘤组织中有时也可见到骨组织的产生，例如多形性腺瘤中可见到类软骨组织的存在，在这些肿瘤组织中也检测到了BMP的存在，推测这些上皮性肿瘤中的骨组织也是BMP作用于肌上皮细胞的结果〔3〕。这些都说明BMP与肿瘤中骨的生成有非常密切的关系。成釉细胞瘤中未见骨组织形成的原因可能有两方面：一是肿瘤细胞本身无成骨能力，二是成釉细胞瘤中虽有BMP的表达和基因的扩增，但是此时BMP已发生了某些性质的改变，丧失了其诱骨活性。高玉好〔4〕将成釉细胞瘤的肿瘤组织种植于实验用鼠，亦未见到骨组织的形成，而骨肉瘤组织在同样情况下可以诱导骨组织形成。提示成釉细胞瘤中BMP本身发生改变的可能性较大，而造成蛋白性质改变的最直接的原因之一就是其基因突变。
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关于肿瘤中BMP突变的问题，国内外尚未有人检测，也无资料提示BMP的哪些位点容易发生突变。作者选择bmp2开放读框中编码成熟肽的基因片段作为检测对象。因为BMP家族中与肿瘤关系最为密切的就是bmp2，选择成熟肽片段是因为从BMP的合成过程来看，首先在细胞内合成其前体蛋白(信号肽、前肽区、成熟肽)，前体蛋白在出胞浆的过程中，其他部分脱落而仅有成熟肽以其二聚体形式发挥作用，成熟肽是其生物学性状的决定因素〔5〕。测序结果发现：bmp2编码成熟肽片段的基因发生了个别碱基的改变，并造成了其编码氨基酸的改变，从而引起其多肽结构和蛋白理化性状的改变，这就有可能造成BMP蛋白功能的改变，例如使其诱骨活性丧失。
但并非所有的在成釉细胞瘤组织中的bmp2基因可检测到突变，这是因为造成蛋白质性能改变的原因非常之多，基因的错义突变仅是其可能性之一，此外还应有许多其他的因素产生影响〔6〕。另外成釉细胞瘤中可能有多种BMP家族成员，bmp2是其中重要的一种但并非全部，其他BMP家族成员的改变也可以造成肿瘤生物学特性的改变。
, http://www.100md.com
分析肿瘤基因突变是一个非常复杂的问题和过程。本次实验作者首先发现成釉细胞瘤中bmp2基因突变的存在，为以后进一步的研究打下基础。若收集大量标本，克隆其bmp cDNA进行测序，得到突变率较高的位点，进行统计分析后将有可能得到更加完整可靠的结论，这也是作者下一步所致力解决的问题。
参考文献
1，岳文,杨连甲,金岩.骨形成蛋白及其mRNA基因在成釉细胞瘤中的表达.实用口腔医学杂志,1999,15(3):166
2，Jin Y,Yang LJ.The relationship between bone morphogenetic protein and neoplastic bone disease.Clin Orthop,1990,259:233
3，Hatakeyama S,Gao YH,Ohara-Nemoto Y,et al.Expression of bone morphogenetic protein in human neoplastic epithelial cells.Biochem Mol Biol Int,1997,42(3):497
, 百拇医药
4，Gao YH,Yang LJ,Yamaguchi A.Immunohistochemical demonstration of bone morphogenetic protein in odontogenic tumors.J Oral Pathol Med,1997,26(6):273
5，杨连甲,金岩,胡蕴玉,主编.口腔和骨科的生物活性材料.西安：陕西科学技术出版社,1993.246
6，Beroud C,Verdier F,Soussi T.p53 gene mutation:Sofeware and database.Nucleic Acids Res,1996,24(1):147
(收稿：1999-04-03修回：1999-11-05), 百拇医药