鼻、鼻窦恶性肿瘤中EB病毒和人乳头状瘤病毒的检测
作者：高鹏飞 陈文弦 肖乐义 阎小君
单位：高鹏飞(第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科 西安，710038)；陈文弦(第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科 西安，710038)；肖乐义(第四军医大学全军基因诊断应用研究所)；阎小君(第四军医大学全军基因诊断应用研究所)
关键词：鼻肿瘤；爱泼斯坦-巴尔病毒；人乳头状瘤病毒；聚合酶链反应
临床耳鼻咽喉科杂志000804 摘要 目的：探讨EB病毒和人乳头状瘤病毒(HPV)与鼻、鼻窦恶性肿瘤的关系。方法：用聚合酶链反应(PCR)方法检测 32例鼻、鼻窦恶性肿瘤组织蜡块的EB病毒和HPV(HPV6、11、16、18、33型)基因，分析其与病理分型及TNM分期的关系。结果：32例中检出 EB病毒12例(37.5%)，HPV 21例(65.6%)，其中混合感染6例，5例均未检出。与之对照的10例鼻息肉中未检出EBV和HPV。TNM分期与 HPV和 EB病毒感染率无关，而6例EB病毒和HPV混合感染均为TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期无一例混合感染。结论：鼻、鼻窦恶性肿瘤不仅与HPV感染有关，与EB病毒感染也有一定关系。EBV和HPV混合感染与鼻、鼻窦恶性肿瘤TNM分期有关。
, 百拇医药
Detection of Epstein-Barr virus and human papillomavirus
in sinonasal malignant neoplasms
GAO Peng-fei CHEN Wen-xian XIAO Le-yi YAN Xiao-jun
(Department of Otolaryngology,Tangdu Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710038)
(Institute of PLA Gene Diagnosis,the Fourth Military Medical University)
Abstract Objective:To investigate the existance of Epstein-Barr virus (EBV) and papilloma virus(HPV) in sinonasal malignant neoplasms.Method:EBV and HPV (includingHPV6,11,16,18,33)gene were detected in paraffin-embedded tissues with polymerase chain reaction(PCR) from 32 cases of sinonasal malignant neoplasms.Result:EBV was detected in 12(37.5%),HPV in 21(65.6%);The coinfection of EBV and HPV was found in 6 cases with stage Ⅲ～Ⅳ by TNM;10 cases of nasal polyps contained neither EBV nor HPV.Conclusion:Like HPV,there may be relationship between EBV and sinonasal malignant neoplasms.The coinfection of EBV and HPV is related to stage Ⅲ～Ⅳ by TNM of sinonasal malignant neoplasms.
, 百拇医药
Key words Nasal neoplasm Epstein-Barr virus Human papilloma virus Polymerase chain reaction
鼻、鼻窦恶性肿瘤病因仍不十分清楚，近年来，有研究表明人乳头状瘤病毒(HPV)感染与其发病有关，但并非其唯一病因，因为肿瘤的发生是一个多因素、多阶段综合作用的结果。HPV的致癌作用也有赖于一些触发因素的协同作用(如吸烟、环境因素、慢性炎症的刺激和其他病毒感染等)。为探讨鼻、鼻窦恶性肿瘤的病因，我们用聚合酶链反应(PCR)对有随访记录的32例鼻、鼻窦恶性肿瘤组织蜡块中的EB病毒(EBV)和HPV基因进行了检测，并以10例鼻息肉组织作为对照。报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料来源
全部检测材料来源于本院及延安医学院第二附属医院，1985～1996年收治的鼻、鼻窦恶性肿瘤住院病例的肿瘤组织蜡块。复习病理切片，剔除变性严重的组织标本，共计32例。其中男20例，女12例，平均年龄60.4(33～73)岁。本组病例中籍贯为长江以北省份的28例,长江以南的4例。根据TNM分期法，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期13例。病理类型包括鳞状细胞癌12例，乳头状瘤恶变 10例，腺癌 3例，恶性肉芽肿2例，恶性黑色素瘤2例，恶性淋巴瘤 2例，未分化癌1例。10例鼻息肉标本作为对照。
, 百拇医药
1.2 模板DNA的制备
取5 μm厚石蜡切片2～4片，经二甲苯脱蜡，无水乙醇处理，蛋白酶K消化，酚：氯仿/异戊醇抽提，加入2倍体积无水乙醇及1/10体积5 mol/L氯化钠-20℃过夜，低温离心沉淀，TE溶解储4℃冰箱备用。HPV16质粒和EBV阳性的B 95-8细胞系DNA按常规方法提取。
1.3 聚合酶链反应(PCR)
检测EB病毒和HPV的引物、反应体系及结果判断见文献报告的方法〔1〕。
2 结果
32例鼻、鼻窦恶性肿瘤组织中检出EBV 12例(37.5%)，HPV 21例(65.6%)，其中混合感染6例，5例均未检出；10例鼻息肉中均未检出EBV和HPV。其病例分布见表1。
, 百拇医药
表1 鼻、鼻窦恶性肿瘤中HPV和EBV、PCR检测结果 肿瘤
例数
阳性例数
EBV
HPV
EBV+HPV
鳞状细胞癌
12
1
7
0
乳头状瘤恶变
10
, 百拇医药
2
5
3
腺癌
3
1
2
0
恶性肉芽肿
2
1
1
0
恶性黑色素瘤
, 百拇医药
2
1
0
0
恶性淋巴瘤
2
0
0
2
未分化癌
1
0
0
1
, 百拇医药
合计
32
6
15
6
Ⅰ～Ⅱ期组 EBV、HPV感染率分别为36.8%(7/19)和63.2%(12/19)，Ⅲ～Ⅳ期组分别为38.5%(5/13)和69.2%(9/13)。经统计学检验EBV、HPV感染率与TNM分期均无显著性差异(P>0.05)；6例EBV和HPV混合感染均为Ⅲ～Ⅳ期,而Ⅰ～Ⅱ期组无一例混合感染。10例鼻息肉组织HPV、EBV均阴性。
3 讨论
EBV和HPV都是具有潜在致癌性的DNA病毒，是肿瘤病因中病毒感染因素研究的重点和热点。Furuta等(1991)和Diken等(1992)认为EB病毒感染与鼻咽癌有关，HPV感染可能是鼻、鼻窦肿瘤的主要病因。然而近年来陆续有鼻咽癌组织中检出HPV的报道，并发现有HPV与EBV混合感染者，认为两者可能有协同作用〔2，3〕。本组32例标本中HPV和EB病毒感染率分别为65.6%和37.5%，两种肿瘤病毒的总感染率84.3(27/32)%。提示EB病毒与HPV一样，在鼻、鼻窦恶性肿瘤的发生、发展中有着某种作用。鼻、鼻窦恶性肿瘤中HPV的检出率有较大差异，其原因可能是HPV有众多的型别、地域差别及其它肿瘤病毒感染。鼻及鼻窦与鼻咽部在解剖学属相邻相接，均为呼吸上皮覆盖，因此与鼻咽癌一样，作为EB病毒的宿主是可能的。
, http://www.100md.com
图1 2%琼脂糖凝胶分析EB病毒PCR产物电泳结果 M：PCR Marker,1:B95-8细胞阳性对照，2：蒸馏水对照，3：鼻息肉标本，4～7：鼻、鼻窦肿瘤标本
图2 2%琼脂糖凝胶电泳分析HPV通用引物PCR产物 M：PCR marker，1：HPV16质粒阳性对照，2：蒸馏水阴性对照，3：鼻息肉标本，4～7：鼻、鼻窦恶性肿瘤
有研究认为 EBV感染率与鼻、鼻窦恶性肿瘤TNM分期有关〔4〕。本组病例鼻、鼻窦恶性肿瘤TNM分期与HPV和EB病毒分别感染率无关，但6例 EBV和 HPV混合感染均为Ⅲ～Ⅳ期组, 而Ⅰ～Ⅱ期组无一例混合感染，提示EBV和HPV具有协同作用。
Punwane等〔5〕研究发现，鼻咽癌中东方人高于西方人,认为EBV检出率存在地域差异。本组中鼻、鼻窦恶性肿瘤中EBV的检出率为37.5%，但鳞癌中检出率仅为8.3%,明显低于Tyan等(1993)报告的结果台湾地区100%及柴丽萍〔4〕广东地区33.3%的检出率。因本组病例中籍贯为长江以北地区者占87.5%(28/32)，提示EBV检出率是否存在地域差异，有待于进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Lie E S,Heyden A,Johannesen M K,et al.Detection of human papillomavirus in routinely processed biopsy specimens from laryngal papillomas:Evaluation of reproducibility of polymerase chain reaction and DNA in situ hybridization procetures.Acta Otolaryngol,1996，116:627～631
2，王德辉，步星耀，李延文，等.人乳头状瘤病毒与高分化鼻咽癌发病的关系.临床耳鼻咽喉科杂志，1997，11:73～74
3，Rassekh C H,Rady P L.Combined Epstein-Barr virus and human papillomavirus infection in nasopharyngeal carcinoma.Laryngoscope,1998,108:362～365
, http://www.100md.com
4，柴丽萍，苏振忠，邱前辉.EB病毒与鼻腔鼻窦鳞癌关系的初步研究.中山医科大学学报，1997，18：57～59
5，Punwaney R,Brandwein M S,Zhang D Y,et al.Human papillomavirus may be common within nasopharyneal carcinoma of cancasians:Investigation of Epstein-Barr virus and human papillomavirus in eastern and western nasopharyngeal carcinoma using ligation-dependent polymerase chain reaction.Head Neck,1999，21:21～25
(收稿 1999-10-07 修回 2000-04-12), 百拇医药
单位：高鹏飞(第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科 西安，710038)；陈文弦(第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科 西安，710038)；肖乐义(第四军医大学全军基因诊断应用研究所)；阎小君(第四军医大学全军基因诊断应用研究所)
关键词：鼻肿瘤；爱泼斯坦-巴尔病毒；人乳头状瘤病毒；聚合酶链反应
临床耳鼻咽喉科杂志000804 摘要 目的：探讨EB病毒和人乳头状瘤病毒(HPV)与鼻、鼻窦恶性肿瘤的关系。方法：用聚合酶链反应(PCR)方法检测 32例鼻、鼻窦恶性肿瘤组织蜡块的EB病毒和HPV(HPV6、11、16、18、33型)基因，分析其与病理分型及TNM分期的关系。结果：32例中检出 EB病毒12例(37.5%)，HPV 21例(65.6%)，其中混合感染6例，5例均未检出。与之对照的10例鼻息肉中未检出EBV和HPV。TNM分期与 HPV和 EB病毒感染率无关，而6例EB病毒和HPV混合感染均为TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期无一例混合感染。结论：鼻、鼻窦恶性肿瘤不仅与HPV感染有关，与EB病毒感染也有一定关系。EBV和HPV混合感染与鼻、鼻窦恶性肿瘤TNM分期有关。
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Detection of Epstein-Barr virus and human papillomavirus
in sinonasal malignant neoplasms
GAO Peng-fei CHEN Wen-xian XIAO Le-yi YAN Xiao-jun
(Department of Otolaryngology,Tangdu Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710038)
(Institute of PLA Gene Diagnosis,the Fourth Military Medical University)
Abstract Objective:To investigate the existance of Epstein-Barr virus (EBV) and papilloma virus(HPV) in sinonasal malignant neoplasms.Method:EBV and HPV (includingHPV6,11,16,18,33)gene were detected in paraffin-embedded tissues with polymerase chain reaction(PCR) from 32 cases of sinonasal malignant neoplasms.Result:EBV was detected in 12(37.5%),HPV in 21(65.6%);The coinfection of EBV and HPV was found in 6 cases with stage Ⅲ～Ⅳ by TNM;10 cases of nasal polyps contained neither EBV nor HPV.Conclusion:Like HPV,there may be relationship between EBV and sinonasal malignant neoplasms.The coinfection of EBV and HPV is related to stage Ⅲ～Ⅳ by TNM of sinonasal malignant neoplasms.
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Key words Nasal neoplasm Epstein-Barr virus Human papilloma virus Polymerase chain reaction
鼻、鼻窦恶性肿瘤病因仍不十分清楚，近年来，有研究表明人乳头状瘤病毒(HPV)感染与其发病有关，但并非其唯一病因，因为肿瘤的发生是一个多因素、多阶段综合作用的结果。HPV的致癌作用也有赖于一些触发因素的协同作用(如吸烟、环境因素、慢性炎症的刺激和其他病毒感染等)。为探讨鼻、鼻窦恶性肿瘤的病因，我们用聚合酶链反应(PCR)对有随访记录的32例鼻、鼻窦恶性肿瘤组织蜡块中的EB病毒(EBV)和HPV基因进行了检测，并以10例鼻息肉组织作为对照。报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料来源
全部检测材料来源于本院及延安医学院第二附属医院，1985～1996年收治的鼻、鼻窦恶性肿瘤住院病例的肿瘤组织蜡块。复习病理切片，剔除变性严重的组织标本，共计32例。其中男20例，女12例，平均年龄60.4(33～73)岁。本组病例中籍贯为长江以北省份的28例,长江以南的4例。根据TNM分期法，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期13例。病理类型包括鳞状细胞癌12例，乳头状瘤恶变 10例，腺癌 3例，恶性肉芽肿2例，恶性黑色素瘤2例，恶性淋巴瘤 2例，未分化癌1例。10例鼻息肉标本作为对照。
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1.2 模板DNA的制备
取5 μm厚石蜡切片2～4片，经二甲苯脱蜡，无水乙醇处理，蛋白酶K消化，酚：氯仿/异戊醇抽提，加入2倍体积无水乙醇及1/10体积5 mol/L氯化钠-20℃过夜，低温离心沉淀，TE溶解储4℃冰箱备用。HPV16质粒和EBV阳性的B 95-8细胞系DNA按常规方法提取。
1.3 聚合酶链反应(PCR)
检测EB病毒和HPV的引物、反应体系及结果判断见文献报告的方法〔1〕。
2 结果
32例鼻、鼻窦恶性肿瘤组织中检出EBV 12例(37.5%)，HPV 21例(65.6%)，其中混合感染6例，5例均未检出；10例鼻息肉中均未检出EBV和HPV。其病例分布见表1。
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表1 鼻、鼻窦恶性肿瘤中HPV和EBV、PCR检测结果 肿瘤
例数
阳性例数
EBV
HPV
EBV+HPV
鳞状细胞癌
12
1
7
0
乳头状瘤恶变
10
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2
5
3
腺癌
3
1
2
0
恶性肉芽肿
2
1
1
0
恶性黑色素瘤
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2
1
0
0
恶性淋巴瘤
2
0
0
2
未分化癌
1
0
0
1
, 百拇医药
合计
32
6
15
6
Ⅰ～Ⅱ期组 EBV、HPV感染率分别为36.8%(7/19)和63.2%(12/19)，Ⅲ～Ⅳ期组分别为38.5%(5/13)和69.2%(9/13)。经统计学检验EBV、HPV感染率与TNM分期均无显著性差异(P>0.05)；6例EBV和HPV混合感染均为Ⅲ～Ⅳ期,而Ⅰ～Ⅱ期组无一例混合感染。10例鼻息肉组织HPV、EBV均阴性。
3 讨论
EBV和HPV都是具有潜在致癌性的DNA病毒，是肿瘤病因中病毒感染因素研究的重点和热点。Furuta等(1991)和Diken等(1992)认为EB病毒感染与鼻咽癌有关，HPV感染可能是鼻、鼻窦肿瘤的主要病因。然而近年来陆续有鼻咽癌组织中检出HPV的报道，并发现有HPV与EBV混合感染者，认为两者可能有协同作用〔2，3〕。本组32例标本中HPV和EB病毒感染率分别为65.6%和37.5%，两种肿瘤病毒的总感染率84.3(27/32)%。提示EB病毒与HPV一样，在鼻、鼻窦恶性肿瘤的发生、发展中有着某种作用。鼻、鼻窦恶性肿瘤中HPV的检出率有较大差异，其原因可能是HPV有众多的型别、地域差别及其它肿瘤病毒感染。鼻及鼻窦与鼻咽部在解剖学属相邻相接，均为呼吸上皮覆盖，因此与鼻咽癌一样，作为EB病毒的宿主是可能的。
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图1 2%琼脂糖凝胶分析EB病毒PCR产物电泳结果 M：PCR Marker,1:B95-8细胞阳性对照，2：蒸馏水对照，3：鼻息肉标本，4～7：鼻、鼻窦肿瘤标本
图2 2%琼脂糖凝胶电泳分析HPV通用引物PCR产物 M：PCR marker，1：HPV16质粒阳性对照，2：蒸馏水阴性对照，3：鼻息肉标本，4～7：鼻、鼻窦恶性肿瘤
有研究认为 EBV感染率与鼻、鼻窦恶性肿瘤TNM分期有关〔4〕。本组病例鼻、鼻窦恶性肿瘤TNM分期与HPV和EB病毒分别感染率无关，但6例 EBV和 HPV混合感染均为Ⅲ～Ⅳ期组, 而Ⅰ～Ⅱ期组无一例混合感染，提示EBV和HPV具有协同作用。
Punwane等〔5〕研究发现，鼻咽癌中东方人高于西方人,认为EBV检出率存在地域差异。本组中鼻、鼻窦恶性肿瘤中EBV的检出率为37.5%，但鳞癌中检出率仅为8.3%,明显低于Tyan等(1993)报告的结果台湾地区100%及柴丽萍〔4〕广东地区33.3%的检出率。因本组病例中籍贯为长江以北地区者占87.5%(28/32)，提示EBV检出率是否存在地域差异，有待于进一步研究。
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参考文献
1，Lie E S,Heyden A,Johannesen M K,et al.Detection of human papillomavirus in routinely processed biopsy specimens from laryngal papillomas:Evaluation of reproducibility of polymerase chain reaction and DNA in situ hybridization procetures.Acta Otolaryngol,1996，116:627～631
2，王德辉，步星耀，李延文，等.人乳头状瘤病毒与高分化鼻咽癌发病的关系.临床耳鼻咽喉科杂志，1997，11:73～74
3，Rassekh C H,Rady P L.Combined Epstein-Barr virus and human papillomavirus infection in nasopharyngeal carcinoma.Laryngoscope,1998,108:362～365
, http://www.100md.com
4，柴丽萍，苏振忠，邱前辉.EB病毒与鼻腔鼻窦鳞癌关系的初步研究.中山医科大学学报，1997，18：57～59
5，Punwaney R,Brandwein M S,Zhang D Y,et al.Human papillomavirus may be common within nasopharyneal carcinoma of cancasians:Investigation of Epstein-Barr virus and human papillomavirus in eastern and western nasopharyngeal carcinoma using ligation-dependent polymerase chain reaction.Head Neck,1999，21:21～25
(收稿 1999-10-07 修回 2000-04-12), 百拇医药