恶性疟原虫对蒿甲醚等抗疟药敏感性体外测定
作者：杨品芳 杨恒林 杨沧江
单位：云南省疟疾防治研究所 思茅 665000
关键词：恶性疟原虫；蒿甲醚；咯萘啶；氯喹；体外敏感性测定
实用寄生虫病杂志990105 提要 作者等1997年8-10月，参照Rieckmann体外微量测定法原理，制作了蒿甲醚测定板，并在云南南部测定了恶性疟原虫对该药及咯萘啶、氯喹的敏感性。测定成功率分别为76.19%(32/42)、72.50%(29/40)和73.81%(31/42)；ID50依次为180、72及128nmol/L；ID95为1600、416及640nmol/L。蒿甲醚板与氯喹板相比，测定成功率相同，疟原虫在各浓度药井中的抑制率亦同氯喹板一样，随药物浓度的增高而依次上升，而裂殖体形成例数依次减少。提示本文制作的蒿甲醚测定板药性稳定，测定结果可靠，可用于现场监测。咯萘啶与以往测定结果相比，敏感性又有所下降。
, 百拇医药
IN VITRO SENSITIVITY OF PLASMODIUM FALCIPARUM TO ARTEMETHER
Yang Pinfang,Yang Henglin,Yang Cangjiang
Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000
ABSTRACT
In 1997, Rieckmann's microtechnic method has been applied to explore the sensitivity of P.falciparum to artemether, pyronaridine and chloroquine in vitro. The successful rates were 76.19%(32/42), 72.50%(29/40), and 73.81%(31/41); ID50 were 180, 72, and 128 nmol/L; and ID95 were 1600, 416 and 640 nmol/L respectively. In comparison of chloroquine-tested plate with artemether one，similar results i.e. the more drug concentration the more schizont inhibited rate and the less number of schizont formed were obtained. The results showed that the function of the artemether-tested plate was stable, reliable and it could be used for the in vitro susceptibility test in the field. Besides, to compare the results in the past, the sensitivity of P.falciparum was decreased in 1997 to pyronaridine.
, 百拇医药
Key words: Plasmodium falciparum,in vitro,artemether, chloroquine, pyronaridine
为提供简便易行的制板方法和现场体外监测方法，提供敏感性数据，指导药物敏感性监测及合理使用抗疟药，作者等进行了本项研究。
1 材料与方法
1.1 测定板及培养基的制备 蒿甲醚粉剂由中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供，含量为100%，分子量为298.388。取蒿甲醚4.8mg，溶于1ml氯仿中，用无水乙醇稀释至所需浓度(最高浓度为160pmol/井，其氯仿与乙醇比例为1∶4000。载药板采用上海第三塑料厂生产的细胞毒反应板，每板4行，每行10井。1及10井为无药对照井，仅加20μl 1∶4000氯仿乙醇溶液。2-9井依次加入20μl分别含有1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0及160.0pmol蒿甲醚溶液。38℃恒温干燥2h，透明胶带密封井口，紫外线(照距50cm)照射消毒1h。4℃冰箱保存备用，部分测定板室温保存，以比较室温条件下存放的有效期。氯喹测定板及咯萘啶测定板按以往介绍方法[1，2]制备。1及10号井为无药对照，2-8号井氯喹含量分别为1、2、4、8、16、32及64pmol。咯萘啶含量依次为0.25、0.5、1、2、4、8、16及32pmol。培养基按刘德全等介绍方法[3]制备，每支2ml无菌安瓿中含RPMI 1640完全培养基1.8ml,4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
1.2 血样采集 选择单一感染恶性疟患者，肝素抗凝采静脉血1-2ml待测，取血后病人给予青蒿素类药正规治疗。
1.3 测定方法与结果判断 在每支培养基中加入0.2ml含虫血，混匀后用定量吸管每井依次加入50μl含虫血培养基。参照Rieckmann体外微量法[4]在37℃±1℃恒温箱中孵育24-36h。对照井裂殖体率在20%以上为测定成功，反之为测定失败。测定成功病例计数200个无性体中的裂殖体数，以对照井裂殖体为基数计算出各井裂殖体抑制率，在半对数表格中查算出半数抑制量(ID50)及完全抑制量(ID95)。用几何均数计算平均完全抑制裂殖体形成的平均浓度(CIMC)。
2 结果 在蒿甲醚测定板中共测定成功32例，成功率为76.19%(32/42)，咯萘啶、氯喹板测定成功率分别为72.50%(29/40)及73.81%(31/42)。完全抑制裂殖体形成的最低浓度，蒿甲醚为5pmol井，咯萘啶及氯喹分别为1及16pmol井，分别有1、5及19例疟原虫在最高浓度的蒿甲醚、咯萘啶及氯喹板中发育至裂殖体。在各药浓度井中发育至裂殖体的例数见表1。在各药井中的平均抑制率见表2，在最低浓度井的平均抑制率蒿甲醚为11.45%，咯萘啶、氯喹分别为0.68%及3.02%，最高浓度井抑制率依次为98.94%、98.70%及91.14%。ID50及ID95见表2。除1例疟原虫能在160pmol的蒿甲醚药中发育至裂殖体外，其他各例均受到抑制，CIMI为560.1 nmol/L。疟原虫在蒿甲醚、咯萘啶、氯喹测定板对照井中发育至裂殖体的平均数分别为118、104及108个。
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表1.恶性疟原虫在各药井中发育到裂殖体的例数
Table 1.Number of cases with falciparum schizont formation in each well 药物
Drug
各井发育至裂殖体例数
No.case with schizont in different well
1
2
3
4
5
, 百拇医药
6
7
8
9
蒿甲醚
Artemether
32
32
32
30
27
21
11
5
, http://www.100md.com
1
咯萘啶
Pyronaridine
29
29
28
27
21
13
10
5
5
氯 喹
, http://www.100md.com Chloroquine
31
31
31
31
31
30
29
19
-
*：1号为对照井，2号井中蒿甲醚、咯萘啶、氯喹含量分别为1.25、0.25和1 pmol，3-9号井依次倍增。
Well No.1 was control.Well No.2 contained artemether,pyronaridine and chloroquine concentration of 1.25,0.25 and 1 pmol,respectively.The concentration in well No.3-9 was doubled in order.
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表2.云南南部恶性疟原虫对蒿甲醚、咯萘啶、氯喹体外测定结果
Table 2.In vitro sensitivity of P.falciparum from south Yunnan to artemether,pyronaridine and chloroquine. 药物
Drug
例数
No.
case
恶性疟原虫在各药井的抑制率(%)
Inhibition rate in different well
ID50
, 百拇医药
(nmol/L)
ID95
(nmol/L)
2
3
4
5
6
7
8
9
蒿甲醚
Artemether
, http://www.100md.com
32
11.5
18.4
30.8
51.7
71.7
80.1
91.9
98.9
180
1600
咯萘啶
Pyronaridine
, http://www.100md.com
29
0.7
5.3
24.2
41.6
70.0
84.0
90.9
98.8
72
416
氯 喹
Chloroquine
, 百拇医药
31
3.0
9.4
12.9
19.0
24.1
46.5
91.1
-
128
640
3 讨论 为了解恶性疟原虫对抗疟药的敏感性，指导合理使用抗疟药，杨恒林等[5，6]曾在云南边境地区测定了恶性疟原虫对氯喹、阿莫地喹、甲氟喹、奎宁、磺胺多辛/乙胺嘧啶、青蒿琥酯、还原青蒿素、蒿乙醚、咯萘啶等药的敏感性，而对蒿甲醚由于制板困难，仅做过一些有限的试验性测定。为摸索制板方法，进行了反复的实验研究。曾用苯乙醇作溶剂制作的测定板测得的CIMC、ID50、ID95明显低于同类药中的蒿乙醚[6]，估计与药物溶解不充分有关。用氯仿溶药制作的测定板测得的结果与蒿乙醚相似，在4℃恒温中保存有效期达8个月以上。本研究现场测定成功率与氯喹、咯萘啶相同，疟原虫抑制率亦同氯喹板一样随药物浓度的增加而依次上升，而裂殖体形成数则依次减少，提示本方法制作的测定板药性稳定，测定成功率高，结果可靠，简便易行，可推广应用。
, 百拇医药
蒿甲醚测定板对照井平均裂殖体数与其他两种测定板相同，测定成功率亦然，提示本文所采用的氯仿乙醇溶剂对疟原虫生长无影响。恶性疟原虫在最低蒿甲醚井中的抑制率为11.5%，最高药物浓度井为98.9%，提示本文设置的剂量组是恰当的。恶性疟原虫氯喹敏感性体内观察法与体外微量测定法对比研究结果[8]显示在抗性程度较高地区两种方法测定结果相一致，而抗性较低地区则体外法较体内法灵敏，更能反映敏感性的客观情况，且较简便易行，省时省力。本文提供的制板方法及数据为该药的敏感性纵向监测奠定了基础。
咯萘啶在云南仅做过一些药物临床研究和敏感性体外测定[6，7]，本文所测结果与1988年[2]及1995[6]年相比，ID50、ID95依次上升，比1988年分别上升4.5倍(72/13)和7.6倍(416/48)，比1995年上升1.3倍(72/32)和2.9倍(416/108)。本研究29例中有10例原虫显示抗性，其5例在最高药物浓度井中仍能形成裂殖体，提示当地恶性疟原虫对该药敏感性继续下降，该药目前似不宜单独用于治疗当地恶性疟。
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基金项目：联合国计划开发署/世界银行/世界卫生组织热带病研究培训特别规划处资助项目(900098).
The project received the financial support from UNDP/World Bank/WHO/TDR(900098).
4 参考文献
1 刘德全，等.抗氯喹恶性疟原虫体外测定用冰冻培养基的制备及涂氯喹板的改进.寄生虫学与寄生虫病杂志 1983；1∶44.
2 杨恒林，等.恶性疟原虫对咯萘啶、青蒿琥酯敏感性现场体外测定.中国寄生虫病防治杂志 1988；2∶169.
3 刘德全，等.一种便于现场测定恶性疟原虫抗药性的培养基.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1989；7∶112.
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4 Rieckmann KH,et al.Drug sensitivity of Plasmodium falciparum.An in vitro microtechnique.Lancet 1978;1∶22.
5 Yang HL,et al.In vitro response of Plasmodium falciparum on the China-Vietnam border to nine antimalarials.Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth 1995;26∶397.
6 杨恒林，等.云南省恶性疟原虫对青蒿素类药物及咯萘啶与氯喹敏感性的体外测定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1997；15∶292.
7 杨恒林，等.恶性疟原虫对咯萘啶敏感性监测及临床研究现状.实用寄生虫病杂志 1997；5∶34.
8 车立刚，等.云南恶性疟抗氯喹株的地理分布调查.中华流行病学杂志 1986；7∶88., 百拇医药
单位：云南省疟疾防治研究所 思茅 665000
关键词：恶性疟原虫；蒿甲醚；咯萘啶；氯喹；体外敏感性测定
实用寄生虫病杂志990105 提要 作者等1997年8-10月，参照Rieckmann体外微量测定法原理，制作了蒿甲醚测定板，并在云南南部测定了恶性疟原虫对该药及咯萘啶、氯喹的敏感性。测定成功率分别为76.19%(32/42)、72.50%(29/40)和73.81%(31/42)；ID50依次为180、72及128nmol/L；ID95为1600、416及640nmol/L。蒿甲醚板与氯喹板相比，测定成功率相同，疟原虫在各浓度药井中的抑制率亦同氯喹板一样，随药物浓度的增高而依次上升，而裂殖体形成例数依次减少。提示本文制作的蒿甲醚测定板药性稳定，测定结果可靠，可用于现场监测。咯萘啶与以往测定结果相比，敏感性又有所下降。
, 百拇医药
IN VITRO SENSITIVITY OF PLASMODIUM FALCIPARUM TO ARTEMETHER
Yang Pinfang,Yang Henglin,Yang Cangjiang
Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000
ABSTRACT
In 1997, Rieckmann's microtechnic method has been applied to explore the sensitivity of P.falciparum to artemether, pyronaridine and chloroquine in vitro. The successful rates were 76.19%(32/42), 72.50%(29/40), and 73.81%(31/41); ID50 were 180, 72, and 128 nmol/L; and ID95 were 1600, 416 and 640 nmol/L respectively. In comparison of chloroquine-tested plate with artemether one，similar results i.e. the more drug concentration the more schizont inhibited rate and the less number of schizont formed were obtained. The results showed that the function of the artemether-tested plate was stable, reliable and it could be used for the in vitro susceptibility test in the field. Besides, to compare the results in the past, the sensitivity of P.falciparum was decreased in 1997 to pyronaridine.
, 百拇医药
Key words: Plasmodium falciparum,in vitro,artemether, chloroquine, pyronaridine
为提供简便易行的制板方法和现场体外监测方法，提供敏感性数据，指导药物敏感性监测及合理使用抗疟药，作者等进行了本项研究。
1 材料与方法
1.1 测定板及培养基的制备 蒿甲醚粉剂由中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供，含量为100%，分子量为298.388。取蒿甲醚4.8mg，溶于1ml氯仿中，用无水乙醇稀释至所需浓度(最高浓度为160pmol/井，其氯仿与乙醇比例为1∶4000。载药板采用上海第三塑料厂生产的细胞毒反应板，每板4行，每行10井。1及10井为无药对照井，仅加20μl 1∶4000氯仿乙醇溶液。2-9井依次加入20μl分别含有1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0及160.0pmol蒿甲醚溶液。38℃恒温干燥2h，透明胶带密封井口，紫外线(照距50cm)照射消毒1h。4℃冰箱保存备用，部分测定板室温保存，以比较室温条件下存放的有效期。氯喹测定板及咯萘啶测定板按以往介绍方法[1，2]制备。1及10号井为无药对照，2-8号井氯喹含量分别为1、2、4、8、16、32及64pmol。咯萘啶含量依次为0.25、0.5、1、2、4、8、16及32pmol。培养基按刘德全等介绍方法[3]制备，每支2ml无菌安瓿中含RPMI 1640完全培养基1.8ml,4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
1.2 血样采集 选择单一感染恶性疟患者，肝素抗凝采静脉血1-2ml待测，取血后病人给予青蒿素类药正规治疗。
1.3 测定方法与结果判断 在每支培养基中加入0.2ml含虫血，混匀后用定量吸管每井依次加入50μl含虫血培养基。参照Rieckmann体外微量法[4]在37℃±1℃恒温箱中孵育24-36h。对照井裂殖体率在20%以上为测定成功，反之为测定失败。测定成功病例计数200个无性体中的裂殖体数，以对照井裂殖体为基数计算出各井裂殖体抑制率，在半对数表格中查算出半数抑制量(ID50)及完全抑制量(ID95)。用几何均数计算平均完全抑制裂殖体形成的平均浓度(CIMC)。
2 结果 在蒿甲醚测定板中共测定成功32例，成功率为76.19%(32/42)，咯萘啶、氯喹板测定成功率分别为72.50%(29/40)及73.81%(31/42)。完全抑制裂殖体形成的最低浓度，蒿甲醚为5pmol井，咯萘啶及氯喹分别为1及16pmol井，分别有1、5及19例疟原虫在最高浓度的蒿甲醚、咯萘啶及氯喹板中发育至裂殖体。在各药浓度井中发育至裂殖体的例数见表1。在各药井中的平均抑制率见表2，在最低浓度井的平均抑制率蒿甲醚为11.45%，咯萘啶、氯喹分别为0.68%及3.02%，最高浓度井抑制率依次为98.94%、98.70%及91.14%。ID50及ID95见表2。除1例疟原虫能在160pmol的蒿甲醚药中发育至裂殖体外，其他各例均受到抑制，CIMI为560.1 nmol/L。疟原虫在蒿甲醚、咯萘啶、氯喹测定板对照井中发育至裂殖体的平均数分别为118、104及108个。
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表1.恶性疟原虫在各药井中发育到裂殖体的例数
Table 1.Number of cases with falciparum schizont formation in each well 药物
Drug
各井发育至裂殖体例数
No.case with schizont in different well
1
2
3
4
5
, 百拇医药
6
7
8
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蒿甲醚
Artemether
32
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5
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1
咯萘啶
Pyronaridine
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氯 喹
, http://www.100md.com Chloroquine
31
31
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*：1号为对照井，2号井中蒿甲醚、咯萘啶、氯喹含量分别为1.25、0.25和1 pmol，3-9号井依次倍增。
Well No.1 was control.Well No.2 contained artemether,pyronaridine and chloroquine concentration of 1.25,0.25 and 1 pmol,respectively.The concentration in well No.3-9 was doubled in order.
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表2.云南南部恶性疟原虫对蒿甲醚、咯萘啶、氯喹体外测定结果
Table 2.In vitro sensitivity of P.falciparum from south Yunnan to artemether,pyronaridine and chloroquine. 药物
Drug
例数
No.
case
恶性疟原虫在各药井的抑制率(%)
Inhibition rate in different well
ID50
, 百拇医药
(nmol/L)
ID95
(nmol/L)
2
3
4
5
6
7
8
9
蒿甲醚
Artemether
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32
11.5
18.4
30.8
51.7
71.7
80.1
91.9
98.9
180
1600
咯萘啶
Pyronaridine
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5.3
24.2
41.6
70.0
84.0
90.9
98.8
72
416
氯 喹
Chloroquine
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31
3.0
9.4
12.9
19.0
24.1
46.5
91.1
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3 讨论 为了解恶性疟原虫对抗疟药的敏感性，指导合理使用抗疟药，杨恒林等[5，6]曾在云南边境地区测定了恶性疟原虫对氯喹、阿莫地喹、甲氟喹、奎宁、磺胺多辛/乙胺嘧啶、青蒿琥酯、还原青蒿素、蒿乙醚、咯萘啶等药的敏感性，而对蒿甲醚由于制板困难，仅做过一些有限的试验性测定。为摸索制板方法，进行了反复的实验研究。曾用苯乙醇作溶剂制作的测定板测得的CIMC、ID50、ID95明显低于同类药中的蒿乙醚[6]，估计与药物溶解不充分有关。用氯仿溶药制作的测定板测得的结果与蒿乙醚相似，在4℃恒温中保存有效期达8个月以上。本研究现场测定成功率与氯喹、咯萘啶相同，疟原虫抑制率亦同氯喹板一样随药物浓度的增加而依次上升，而裂殖体形成数则依次减少，提示本方法制作的测定板药性稳定，测定成功率高，结果可靠，简便易行，可推广应用。
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蒿甲醚测定板对照井平均裂殖体数与其他两种测定板相同，测定成功率亦然，提示本文所采用的氯仿乙醇溶剂对疟原虫生长无影响。恶性疟原虫在最低蒿甲醚井中的抑制率为11.5%，最高药物浓度井为98.9%，提示本文设置的剂量组是恰当的。恶性疟原虫氯喹敏感性体内观察法与体外微量测定法对比研究结果[8]显示在抗性程度较高地区两种方法测定结果相一致，而抗性较低地区则体外法较体内法灵敏，更能反映敏感性的客观情况，且较简便易行，省时省力。本文提供的制板方法及数据为该药的敏感性纵向监测奠定了基础。
咯萘啶在云南仅做过一些药物临床研究和敏感性体外测定[6，7]，本文所测结果与1988年[2]及1995[6]年相比，ID50、ID95依次上升，比1988年分别上升4.5倍(72/13)和7.6倍(416/48)，比1995年上升1.3倍(72/32)和2.9倍(416/108)。本研究29例中有10例原虫显示抗性，其5例在最高药物浓度井中仍能形成裂殖体，提示当地恶性疟原虫对该药敏感性继续下降，该药目前似不宜单独用于治疗当地恶性疟。
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基金项目：联合国计划开发署/世界银行/世界卫生组织热带病研究培训特别规划处资助项目(900098).
The project received the financial support from UNDP/World Bank/WHO/TDR(900098).
4 参考文献
1 刘德全，等.抗氯喹恶性疟原虫体外测定用冰冻培养基的制备及涂氯喹板的改进.寄生虫学与寄生虫病杂志 1983；1∶44.
2 杨恒林，等.恶性疟原虫对咯萘啶、青蒿琥酯敏感性现场体外测定.中国寄生虫病防治杂志 1988；2∶169.
3 刘德全，等.一种便于现场测定恶性疟原虫抗药性的培养基.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1989；7∶112.
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4 Rieckmann KH,et al.Drug sensitivity of Plasmodium falciparum.An in vitro microtechnique.Lancet 1978;1∶22.
5 Yang HL,et al.In vitro response of Plasmodium falciparum on the China-Vietnam border to nine antimalarials.Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth 1995;26∶397.
6 杨恒林，等.云南省恶性疟原虫对青蒿素类药物及咯萘啶与氯喹敏感性的体外测定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1997；15∶292.
7 杨恒林，等.恶性疟原虫对咯萘啶敏感性监测及临床研究现状.实用寄生虫病杂志 1997；5∶34.
8 车立刚，等.云南恶性疟抗氯喹株的地理分布调查.中华流行病学杂志 1986；7∶88., 百拇医药