流式细胞术检测血小板相关IgG的临床应用
作者：施纪文 王兆钺 张威 朱明清 韩悦 程大卫 阮长耿
单位：苏州大学附属第一医院血液研究所，江苏省血液研究所 江苏苏州，215006
关键词：流式细胞术；特发性血小板减少性紫癜；血小板相关免疫球蛋白G
临床血液学杂志000606 摘要 目的：研究流式细胞术(FCM)检测血小板相关免疫球蛋白G(PAIgG)的特点及在特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断中的意义。方法：用FCM检测了47例ITP、13例非免疫性血小板减少、10例自身免疫溶血性贫血、18例其它免疫系统疾病患者以及31例健康志愿者的PAIgG，并与ELISA竞争法检测结果比较。结果：FCM 检测ITP患者PAIgG的平均荧光强度和阳性血小板百分率均明显高于正常对照组(P<0.01)，11例有峰形异常。ITP患者FCM 检测的阳性率(87.2%)比ELISA法(83.0%)稍高，两种方法的符合率为85.1%。但两种方法都存在特异性不高的问题。结论：FCM检测PAIgG具有快速、简便和灵敏等特点，可作为免疫性血小板减少实验诊断的新方法。
, 百拇医药
Clinical application of flow cytometry for measurement
of platelet-associated IgG
SHI Ji-wen WANG Zhao-yue ZHANG Wei ZHU Ming-qing
HAN Yue CHENG Da-wei RUAN Chang-geng
(Jiangsu Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Suzhou University， Suzhou 215006)
Abstract Objective:To investigate the characteristics of measurement of platelet-associated IgG (PAIgG) by flow cytometry (FCM) and its significance in the diagnosis of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).Method:PAIgG was measured by using FCM in 47 patients with ITP, 13 cases with non-immune thrombocytopenia, 10 cases with AIHA, 18 cases with other immune system diseases and 31 healthy volunteers, in comparison with ELISA. Result:With FCM measurement, the level of mean fluorescence intensity (MFI) and percentage positive platelets in patients with ITP was significantly higher than that in control subjects (P<0.01) and an apparent peak shape abnormality was observed in histogram of fluorescence intensity (log) in 11 out of 47 cases of ITP. The positive percentage of PAIgG by FCM in ITP (87.2%) was slightly higher than that by ELISA (83.0%). The rate of accordance of these two methods was 85.1%. However,these two methods showed low specificity. Conclusion:FCM analysis is a rapid, simple and sensitive method for the measurement of PAIgG in patients with immune thrombocytopenia. It may be suitable to clinical diagnostic application.
, 百拇医药
Key words Flow cytometry Idiopathic thrombocytopenic purpura Platelet-associated IgG
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是最常见的一种出血性疾病，主要是由于患者产生了抗血小板自身抗体而引起血小板破坏。临床上ITP尚无特异的诊断方法，主要靠排除其它血小板减少性疾病作出诊断，容易造成误诊。自1975年Dixon等〔1〕首次用定量方法检测血小板表面免疫球蛋白以来，人们已建立了各种血小板相关免疫球蛋白(PAIg)的检测方法并已成为ITP常用的一项实验诊断指标。常规ELISA仍是目前最常用的方法〔2，3〕。流式细胞术(FCM)是一种能检测大量单个细胞的新技术，具有快速、灵敏、客观和重复性好等特点，已广泛用于血液病的基础研究和临床诊断。近10年来，国外也开始将FCM用于ITP PAIg的研究〔3～5〕。我们使用FCM检测了ITP及其他一些疾病患者PAIgG，观察其改变的特点，并与ELISA法进行比较，以评价FCM检测PAIgG的意义。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 临床资料
ITP患者47例(包括Evans综合征11例)，男16例，女31例；年龄18～49岁，平均31岁。非免疫性血小板减少13例，男6例，女7例；年龄12～55岁，平均30岁。其中阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH) 6例，再生障碍性贫血7例。自身免疫溶血性贫血(AIHA)患者(血小板数>100×109/L)10例，男2例，女8例；年龄13～72岁，平均33岁。其它免疫系统疾病：系统性红斑狼疮(SLE)14例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)3例，多发性骨髓瘤(MM)1例。以上病例的诊断符合《血液病诊断及疗效标准》(第2版)〔6〕。正常对照组为31例健康志愿者，年龄、性别与患者组匹配。
1.2 检测方法
EDTA-Na2抗凝血，离心制备富血小板血浆(PRP)，用TEN(Tris-EDTA, pH7.4)洗涤3次。
, 百拇医药
FCM检测血小板表面PAIgG：按Macchi等〔5〕方法稍加改进，调整血小板浓度至100×109/L ，在测定管内加入100 μl血小板悬液和20 μl异硫氰酸荧光素(FITC)-羊抗人IgG(华美生物工程公司)稀释液；在对照管内加入100 μl血小板悬液和20 μl FITC-羊抗鼠IgG(华美生物工程公司)稀释液；在室温下避光温育30 min，洗涤2次，以PBS悬浮。在流式细胞仪(Coulter公司，Epics-XL型)上测定5 000到10 000个血小板的平均荧光强度(MFI)和阳性血小板百分率。
ELISA竞争法检测血小板表面PAIgG：用人IgG(Sigma公司)包被、封闭，调整血小板浓度至20×109/L，加入血小板悬液或人IgG标准品，立即加入HRP-羊抗人IgG稀释液(Immunotech公司)，孵育，显色，测OD490值，计算。以超过正常对照组
+2s判为阳性值。
, 百拇医药
1.3 统计学处理
采用SPSS统计软件包。结果以±s表示，组间比较行t检验。
2 结果
用FCM检测PAIgG，ITP患者的MFI和阳性血小板百分率均明显高于非免疫性血小板减少、AIHA 与正常对照组(表1)。如以测定值超过正常对照组的+2s定为阳性，在47例ITP患者中，33例(70.2%)表现为MFI增高，31例(66.0%)阳性血小板百分率增高。11例(23.4%)患者的细胞数对荧光强度(log值)的图中出现明显峰形异常，如峰拖尾或双峰宽峰，这种情况可与MFI和(或)阳性血小板百分率增高同时出现或单独出现，其中7例(14.9%)仅出现峰形异常而无MFI和阳性血小板百分率改变。在34例正常人中没有这种情况。将MFI、阳性荧光细胞百分率与峰形异常综合统计，FCM检测ITP患者PAIgG阳性率为87.2%，非免疫性血小板减少患者的阳性率为15.4%，AIHA患者全部阴性，但SLE等其它免疫系统疾病的阳性率为63.2%(表1)。
, 百拇医药
用ELISA法检测每个血小板结合的IgG量，结果见表1。FCM检测的阳性率比ELISA稍高，但两种方法阳性率的差别无统计学意义。有5例ITP患者FCM法PAIgG为阳性，而ELISA法为阴性；有2例ELISA法为阳性而FCM法则为阴性。两种方法符合率为85.1%。
表1 FCM及ELISA两种检测方法的PAIgG测值 组别
例数
FCM
ELISA
PAIgG
阳性率(%)
MFI
阳性血小板
, 百拇医药
百分率(%)
PAIgG
阳性率(%)
fg/血小板
ITP(包括Evans综合征)
47
87.2
2.26±2.291)
44.1±29.01)
83.0
6.02±8.901)
, 百拇医药
非免疫性血小板减少
13
15.4
0.33±0.39
17.5±9.4
7.7
1.18±1.60
其它免疫系统疾病
18
63.2
0.95±1.08
33.7±21.9
, http://www.100md.com
47.4
4.06±3.12
AIHA
10
0
0.16±0.07
10.7±7.5
0
0.42±0.28
正常对照组
31
/
0.24±0.15
, 百拇医药
16.6±8.4
/
0.82±0.66
与正常对照组比较，1) P<0.01
3 讨论
ITP的发病机制是机体免疫系统失常，产生抗血小板自身抗体使血小板过度破坏，临床上尚无特异的诊断方法。PAIg是ITP实验诊断的一项敏感指标，在各种检测方法中以ELISA应用最广〔2，3〕。近10年来，国外将FCM用于PAIgG的研究，发现FCM检测的灵敏度较高〔3〕。我们用FCM检测47例ITP患者PAIgG，也发现大多数患者的MFI增高以及阳性血小板百分率增高。人们已发现ITP等免疫性血小板减少症患者外周血血小板大小和形态可有改变，大血小板可为年轻的血小板或由8倍体巨核细胞所产生〔7〕，表明存在大小和形态不同的血小板群体。ITP患者FCM检测PAIgG的荧光强度(log值)图中出现峰形改变，提示存在结合了不同量IgG的血小板群体。国外资料尚未提及有关峰形的问题，但我们认为峰形异常同样具有诊断价值。
, 百拇医药
FCM检测PAIgG的阳性率大体与ELISA相同，而且两种方法符合率达85.1%。这说明FCM方法和ELISA一样，对PAIg检测具有很高的敏感性。但FCM的操作比ELISA简便、省时，需血量少，并且可随时测定单个标本，而不必像ELISA那样需等一批标本才能测定。因此，有条件的单位可用FCM代替ELISA测定PAIg。
PAIg检测的主要缺点是特异性差。FCM并不能克服这一缺点。60% SLE等免疫系统疾病的患者，FCM检测PAIg结果为阳性。这是由于这类疾病常可引起免疫性血小板减少。此外少数非免疫性血小板减少的患者也呈阳性。近年来，人们也研究了一些具有较高的特异性的方法，如血小板抗原单克隆抗体固相化法(MAIPA)〔8〕、改良抗原捕获ELISA法(MACE)和血小板相关IgG特性试验(PAICA)〔5〕等，这些方法应用了抗血小板膜糖蛋白的单克隆抗体，但阳性率低，方法较繁琐，难以在临床推广。有人认为，如将FCM与这些阳性率低但特异性高的方法联用，可提高PAIg检测的敏感性与特异性，从而进一步提高ITP免疫诊断的水平〔8〕。
, 百拇医药
江苏省卫生厅科研基金资助(H9910)
参考文献
1，Dixon R, Rosse W, Ebbert L. Quantitative deter-mination of antibody in idiopathic thrombocytopenic purpura. Correlation of serum and platelet-bound antibody with clinical response. N Engl J Med, 1975, 292: 230～236
2，Nel J D, Stevens K. A new method for the simulta-nious quantitation of platelet-bound immunoglobulin (IgG) and complement (C3) employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) procedure. Br J Haematol, 1980, 44: 281～290
, 百拇医药
3，Stockelberg D, Hou M, Jacobsson S, et al. Detection of platelet antibodies in chronic idiopathic thromb-coytopenic purpura (ITP). A comparative study using flow cytometry, a whole platelet ELISA, and an antigen capture ELISA. Eur J Haematol, 1996, 56: 72～77
4，Levin M D, Vries W, Veld J, et al. Platelet-bound immunoblotting before and after platelet transfusion: Measurement of in vivo binding. Br J Haematol, 1999, 104: 174～183
, http://www.100md.com 5，Macchi L, Clofent S G, Marit G, et al. PAICA: A method for characterizing platelet-associated anti-bodies：Its application to the study of idiopathic thrombocytopenic purpura and to the detection of platelet-bound c7E3. Thromb Haemost, 1996, 76: 1020～1029
6，张之南主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京: 科学出版社, 1998.33～34，88～89，111～112，279～280
7，王振义, 李家增, 阮长耿，主编. 血栓与止血——基础理论与临床. 第2版. 上海: 上海科学技术出版社, 1995. 227～237，615～630
8，Brighton T A, Evans S, Castaldi P A, et al. Prospective evaluation of the clinical usefulness of an antigen-specific assay (MAIPA) in idiopathic thrombo-cytopenic purpura and other immune thrombocy-topenics. Blood, 1996, 88: 194～201
(收稿 2000-03-18), 百拇医药
单位：苏州大学附属第一医院血液研究所，江苏省血液研究所 江苏苏州，215006
关键词：流式细胞术；特发性血小板减少性紫癜；血小板相关免疫球蛋白G
临床血液学杂志000606 摘要 目的：研究流式细胞术(FCM)检测血小板相关免疫球蛋白G(PAIgG)的特点及在特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断中的意义。方法：用FCM检测了47例ITP、13例非免疫性血小板减少、10例自身免疫溶血性贫血、18例其它免疫系统疾病患者以及31例健康志愿者的PAIgG，并与ELISA竞争法检测结果比较。结果：FCM 检测ITP患者PAIgG的平均荧光强度和阳性血小板百分率均明显高于正常对照组(P<0.01)，11例有峰形异常。ITP患者FCM 检测的阳性率(87.2%)比ELISA法(83.0%)稍高，两种方法的符合率为85.1%。但两种方法都存在特异性不高的问题。结论：FCM检测PAIgG具有快速、简便和灵敏等特点，可作为免疫性血小板减少实验诊断的新方法。
, 百拇医药
Clinical application of flow cytometry for measurement
of platelet-associated IgG
SHI Ji-wen WANG Zhao-yue ZHANG Wei ZHU Ming-qing
HAN Yue CHENG Da-wei RUAN Chang-geng
(Jiangsu Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Suzhou University， Suzhou 215006)
Abstract Objective:To investigate the characteristics of measurement of platelet-associated IgG (PAIgG) by flow cytometry (FCM) and its significance in the diagnosis of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).Method:PAIgG was measured by using FCM in 47 patients with ITP, 13 cases with non-immune thrombocytopenia, 10 cases with AIHA, 18 cases with other immune system diseases and 31 healthy volunteers, in comparison with ELISA. Result:With FCM measurement, the level of mean fluorescence intensity (MFI) and percentage positive platelets in patients with ITP was significantly higher than that in control subjects (P<0.01) and an apparent peak shape abnormality was observed in histogram of fluorescence intensity (log) in 11 out of 47 cases of ITP. The positive percentage of PAIgG by FCM in ITP (87.2%) was slightly higher than that by ELISA (83.0%). The rate of accordance of these two methods was 85.1%. However,these two methods showed low specificity. Conclusion:FCM analysis is a rapid, simple and sensitive method for the measurement of PAIgG in patients with immune thrombocytopenia. It may be suitable to clinical diagnostic application.
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Key words Flow cytometry Idiopathic thrombocytopenic purpura Platelet-associated IgG
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是最常见的一种出血性疾病，主要是由于患者产生了抗血小板自身抗体而引起血小板破坏。临床上ITP尚无特异的诊断方法，主要靠排除其它血小板减少性疾病作出诊断，容易造成误诊。自1975年Dixon等〔1〕首次用定量方法检测血小板表面免疫球蛋白以来，人们已建立了各种血小板相关免疫球蛋白(PAIg)的检测方法并已成为ITP常用的一项实验诊断指标。常规ELISA仍是目前最常用的方法〔2，3〕。流式细胞术(FCM)是一种能检测大量单个细胞的新技术，具有快速、灵敏、客观和重复性好等特点，已广泛用于血液病的基础研究和临床诊断。近10年来，国外也开始将FCM用于ITP PAIg的研究〔3～5〕。我们使用FCM检测了ITP及其他一些疾病患者PAIgG，观察其改变的特点，并与ELISA法进行比较，以评价FCM检测PAIgG的意义。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 临床资料
ITP患者47例(包括Evans综合征11例)，男16例，女31例；年龄18～49岁，平均31岁。非免疫性血小板减少13例，男6例，女7例；年龄12～55岁，平均30岁。其中阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH) 6例，再生障碍性贫血7例。自身免疫溶血性贫血(AIHA)患者(血小板数>100×109/L)10例，男2例，女8例；年龄13～72岁，平均33岁。其它免疫系统疾病：系统性红斑狼疮(SLE)14例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)3例，多发性骨髓瘤(MM)1例。以上病例的诊断符合《血液病诊断及疗效标准》(第2版)〔6〕。正常对照组为31例健康志愿者，年龄、性别与患者组匹配。
1.2 检测方法
EDTA-Na2抗凝血，离心制备富血小板血浆(PRP)，用TEN(Tris-EDTA, pH7.4)洗涤3次。
, 百拇医药
FCM检测血小板表面PAIgG：按Macchi等〔5〕方法稍加改进，调整血小板浓度至100×109/L ，在测定管内加入100 μl血小板悬液和20 μl异硫氰酸荧光素(FITC)-羊抗人IgG(华美生物工程公司)稀释液；在对照管内加入100 μl血小板悬液和20 μl FITC-羊抗鼠IgG(华美生物工程公司)稀释液；在室温下避光温育30 min，洗涤2次，以PBS悬浮。在流式细胞仪(Coulter公司，Epics-XL型)上测定5 000到10 000个血小板的平均荧光强度(MFI)和阳性血小板百分率。
ELISA竞争法检测血小板表面PAIgG：用人IgG(Sigma公司)包被、封闭，调整血小板浓度至20×109/L，加入血小板悬液或人IgG标准品，立即加入HRP-羊抗人IgG稀释液(Immunotech公司)，孵育，显色，测OD490值，计算。以超过正常对照组
+2s判为阳性值。, 百拇医药
1.3 统计学处理
采用SPSS统计软件包。结果以
±s表示，组间比较行t检验。2 结果
用FCM检测PAIgG，ITP患者的MFI和阳性血小板百分率均明显高于非免疫性血小板减少、AIHA 与正常对照组(表1)。如以测定值超过正常对照组的
+2s定为阳性，在47例ITP患者中，33例(70.2%)表现为MFI增高，31例(66.0%)阳性血小板百分率增高。11例(23.4%)患者的细胞数对荧光强度(log值)的图中出现明显峰形异常，如峰拖尾或双峰宽峰，这种情况可与MFI和(或)阳性血小板百分率增高同时出现或单独出现，其中7例(14.9%)仅出现峰形异常而无MFI和阳性血小板百分率改变。在34例正常人中没有这种情况。将MFI、阳性荧光细胞百分率与峰形异常综合统计，FCM检测ITP患者PAIgG阳性率为87.2%，非免疫性血小板减少患者的阳性率为15.4%，AIHA患者全部阴性，但SLE等其它免疫系统疾病的阳性率为63.2%(表1)。, 百拇医药
用ELISA法检测每个血小板结合的IgG量，结果见表1。FCM检测的阳性率比ELISA稍高，但两种方法阳性率的差别无统计学意义。有5例ITP患者FCM法PAIgG为阳性，而ELISA法为阴性；有2例ELISA法为阳性而FCM法则为阴性。两种方法符合率为85.1%。
表1 FCM及ELISA两种检测方法的PAIgG测值 组别
例数
FCM
ELISA
PAIgG
阳性率(%)
MFI
阳性血小板
, 百拇医药
百分率(%)
PAIgG
阳性率(%)
fg/血小板
ITP(包括Evans综合征)
47
87.2
2.26±2.291)
44.1±29.01)
83.0
6.02±8.901)
, 百拇医药
非免疫性血小板减少
13
15.4
0.33±0.39
17.5±9.4
7.7
1.18±1.60
其它免疫系统疾病
18
63.2
0.95±1.08
33.7±21.9
, http://www.100md.com
47.4
4.06±3.12
AIHA
10
0
0.16±0.07
10.7±7.5
0
0.42±0.28
正常对照组
31
/
0.24±0.15
, 百拇医药
16.6±8.4
/
0.82±0.66
与正常对照组比较，1) P<0.01
3 讨论
ITP的发病机制是机体免疫系统失常，产生抗血小板自身抗体使血小板过度破坏，临床上尚无特异的诊断方法。PAIg是ITP实验诊断的一项敏感指标，在各种检测方法中以ELISA应用最广〔2，3〕。近10年来，国外将FCM用于PAIgG的研究，发现FCM检测的灵敏度较高〔3〕。我们用FCM检测47例ITP患者PAIgG，也发现大多数患者的MFI增高以及阳性血小板百分率增高。人们已发现ITP等免疫性血小板减少症患者外周血血小板大小和形态可有改变，大血小板可为年轻的血小板或由8倍体巨核细胞所产生〔7〕，表明存在大小和形态不同的血小板群体。ITP患者FCM检测PAIgG的荧光强度(log值)图中出现峰形改变，提示存在结合了不同量IgG的血小板群体。国外资料尚未提及有关峰形的问题，但我们认为峰形异常同样具有诊断价值。
, 百拇医药
FCM检测PAIgG的阳性率大体与ELISA相同，而且两种方法符合率达85.1%。这说明FCM方法和ELISA一样，对PAIg检测具有很高的敏感性。但FCM的操作比ELISA简便、省时，需血量少，并且可随时测定单个标本，而不必像ELISA那样需等一批标本才能测定。因此，有条件的单位可用FCM代替ELISA测定PAIg。
PAIg检测的主要缺点是特异性差。FCM并不能克服这一缺点。60% SLE等免疫系统疾病的患者，FCM检测PAIg结果为阳性。这是由于这类疾病常可引起免疫性血小板减少。此外少数非免疫性血小板减少的患者也呈阳性。近年来，人们也研究了一些具有较高的特异性的方法，如血小板抗原单克隆抗体固相化法(MAIPA)〔8〕、改良抗原捕获ELISA法(MACE)和血小板相关IgG特性试验(PAICA)〔5〕等，这些方法应用了抗血小板膜糖蛋白的单克隆抗体，但阳性率低，方法较繁琐，难以在临床推广。有人认为，如将FCM与这些阳性率低但特异性高的方法联用，可提高PAIg检测的敏感性与特异性，从而进一步提高ITP免疫诊断的水平〔8〕。
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江苏省卫生厅科研基金资助(H9910)
参考文献
1，Dixon R, Rosse W, Ebbert L. Quantitative deter-mination of antibody in idiopathic thrombocytopenic purpura. Correlation of serum and platelet-bound antibody with clinical response. N Engl J Med, 1975, 292: 230～236
2，Nel J D, Stevens K. A new method for the simulta-nious quantitation of platelet-bound immunoglobulin (IgG) and complement (C3) employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) procedure. Br J Haematol, 1980, 44: 281～290
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3，Stockelberg D, Hou M, Jacobsson S, et al. Detection of platelet antibodies in chronic idiopathic thromb-coytopenic purpura (ITP). A comparative study using flow cytometry, a whole platelet ELISA, and an antigen capture ELISA. Eur J Haematol, 1996, 56: 72～77
4，Levin M D, Vries W, Veld J, et al. Platelet-bound immunoblotting before and after platelet transfusion: Measurement of in vivo binding. Br J Haematol, 1999, 104: 174～183
, http://www.100md.com 5，Macchi L, Clofent S G, Marit G, et al. PAICA: A method for characterizing platelet-associated anti-bodies：Its application to the study of idiopathic thrombocytopenic purpura and to the detection of platelet-bound c7E3. Thromb Haemost, 1996, 76: 1020～1029
6，张之南主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京: 科学出版社, 1998.33～34，88～89，111～112，279～280
7，王振义, 李家增, 阮长耿，主编. 血栓与止血——基础理论与临床. 第2版. 上海: 上海科学技术出版社, 1995. 227～237，615～630
8，Brighton T A, Evans S, Castaldi P A, et al. Prospective evaluation of the clinical usefulness of an antigen-specific assay (MAIPA) in idiopathic thrombo-cytopenic purpura and other immune thrombocy-topenics. Blood, 1996, 88: 194～201
(收稿 2000-03-18), 百拇医药