α-SMA在金地鼠颊囊癌变过程中的动态观察
作者：华丽 周曾同 张水龙 钟文静
单位：200011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院
关键词：金地鼠颊囊；α-SMA；癌前病变
临床口腔医学杂志990416 提 要 目的 动态观察金地鼠颊癌变过程中α-SMA表达规律，并分析其表达和癌变间的相关性。方法 采用免疫组化技术检测金地鼠颊囊白斑癌变模型标本的α-SMA表达情况。结果 在轻、中、重度异常增生及癌各组间，α-SMA 表达减少有显著差异。随病变恶性程度增加，α-SMA的表达量减少。结论 α-SMA是一种良好的癌前病变辅助诊断指标。
Dynamic Observation on expression of α-SMA during the evolution of Golden Hamster Cheek Pouch Carcinogenesis.
, 百拇医药
Hua li, Zhou Zengtong, Zhand Shulong et al.
Oral medicine of the Ninth people's Hospital, Shanghai Second Medical University 200011
Abstract Objectives To observe the expressing of α-SMA dynamically and to analyse the correlativity between the expression and the carcinogenesis during the evolution of golden hamster cheek pouch carcinogenesis. Materials and Methods Immunohistochemistry with anti α-SMA was applied to detect the expression of α-SMA in leukoplakia model and carcinogenesis.Results There was significant decrease in expression of α-SMA in mild, moderate, severe displasia and carcinoma. The quantity of α-SMA protein decreased with the malignant degree of pathological changes ascending.Conclusions α-SMA was a good auxiliary diagnostic marker for detecting precarcinoma.
, 百拇医药
Key words golden hamster cheek α-SMA precarcinoma
材料和方法
材料
1. 实验动物：叙利亚品系金地鼠48只，由上海西普尔-BK公司提供。
2. 缓冲液配置(TRIS—HCL液，0.5M，pH7.6)：TRIS 61g,加入340ml Hcl,用800ml蒸馏水充分混匀后，再以蒸馏水定容至1000ml。
3. 免疫组化试剂：ABC试剂盒由DAKO公司提供。
方法
1. 实验动物分组
空白对照组：6只，常规饲养，左侧颊囊涂布0.9%NaCl液，分别于4～9周后处死，取左侧涂药区颊囊组织共6例。
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模型组：42只，常规饲养，左侧颊囊涂布0.5%DMBA丙酮液，分别于4～9周后处死，取左侧涂药区颊囊组织共42例。
2. α-SMA检测
取下的组织块常规石蜡包埋，连续切片2份各约5μm厚，一份HE染色光镜下病理分级;一份60℃烘箱内放置40分钟后，恒温箱中保持24～48小时，准备作α-SMA免疫组化染色。
免疫组化染色步骤如下
2.1 脱蜡水化：恒温箱中取出切片，二甲苯中15分钟×3次→100%、95%、90%、80%、70%梯度乙醇液中，每次均为5分钟→蒸馏水冲洗干净。
2.2 微波处理修理丢失的抗原决定簇：脱蜡水化后切片置缓冲液洗5min×3次，再置0.1M柠檬酸缓冲液中微波处理10min。
, 百拇医药
2.3 α-SMA染色前处理：缓冲液洗涤5min×3次→0.2% Triton-X 100中10min→清水冲洗5min×3次→0.3%H2O2中浸泡5min→5%牛奶中孵育30min。
2.4 α-SMA染色：常规ABC法。
3. 光镜下病理分级：标准参照1978年WHO口腔癌前病变协作中心诊断标准。
观察与计数
每侧高倍镜下计算相邻3个视野内α-SMA连续性染色血管密度值(连续性染色血管数/视野内血管总数×100%)，取平均值。
统计学处理
采用单因素方差分析，Duncan法组间两两比较和相关分析。
, 百拇医药
结 果
1. 光镜下病理分级结果
正常粘膜6例，炎症7例，轻、中和重度异常增生分别为12例、11例和9例，癌3例。
2. 免疫组化检测结果
涂DMBA不同周数组间α-SMA检测结果(表1)。
表1 涂DMBA不同周数组间α-SMA连续性染色血管密度(%) 涂DMBA周数
例数
第4周
7
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54.02±30.61
第5周
7
36.79±24.26
第6周
7
35.95±22.89
第7周
7
27.52±18.32
第8周
7
19.28±17.50
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第9周
7
15.33±14.58
图1示：随涂DMBA周数的增加，α-SMA表达量呈渐进性下降。
图1 涂DMBA不同周数组间α-SMA连续性染色血管密度(%)
从表2可见，正常颊囊粘膜与炎症组间粘膜下α-SMA连续性染色血管密度无显著性差别(P>0.05)；鳞癌组较重度异常增生组粘膜下α-SMA连续性染色血管密度下降有显著性差别(P<0.05)；其余各组间粘膜下α-SMA连续性染色血管密度有高度显著性差别(P>0.01)。
表2 不同病理变化组间颊囊粘膜下α-SMA连续性染色血管密度(%) 病理分级
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例数
x±s
α=0.05
α=0.01
正常粘膜
6
100.00±0.00
A
A
炎 症
7
100.00±0.00
A
, 百拇医药
A
轻度异常增生
12
56.35±8.45
B
B
中度异常增生
11
20.86±5.50
C
C
重度异常增生
9
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9.22±2.02
D
D
癌
3
2.64±0.35
E
D
变量转换后，采用单因素方差分析，Duncan法作组间两两比较，字母相同为无显著差别。
图2 正常粘膜血管α-SMA染色(140倍)
, 百拇医药
图3 异常增生粘膜血管α-SMA染色(140倍)
3. 相关分析结果
α-SMA连续性染色血管密度与病理分级呈高度负相关，即随病变恶性程度增高，α-SMA表达量下降(P<0.01)。
讨 论
1. α-SMA在口腔癌前病变恶化诊断中意义
α-SMA是一种细胞骨架蛋白，与血管的收缩功能及渗透性有关，广泛分布于肠、睾丸、卵巢等多种器官、组织的平滑肌、肌上皮细胞、周细胞和一些基底细胞中。抗α-SMA单抗能特异性识别这些细胞〔1、2〕。本实验采用DMBA诱导的金地鼠颊囊癌变模型〔5、6〕，用抗α-SMA鼠抗进行免疫组化检测，动态观察癌变过程中α-SMA表达规律，结果发现：正常和炎症上皮中血管壁染色呈深棕色，连续袖套状紧密包绕血管腔。随病变恶性程度的上升，这种染色血管数量明显减少，出现不连续的棕黄片段，部分血管则无染色。这一结论与Emoto、张继增等〔3、4、7〕在卵巢、乳房良恶性肿瘤中的血管观察结果相似。提示病变发展至异常增生及鳞癌期，血管壁有不同程度的破坏，而新生毛细血管管壁多有缺损、畸形，引起管腔形态的改变和渗漏现象。可能与晚期肿瘤渗透性增加、易浸润和转移的病理学行为有关。
, 百拇医药
目前，对于口腔粘膜癌前病变的诊断主要依靠镜下12条病理改变，由于定性诊断方法的主观性较强，故难以满足早期诊断的要求。由表1、表2可知，随化学致癌物接触时间的延长，或随病变恶性程度的增加，α-SMA的表达量呈递减。轻、中、重度上皮异常增生及癌各病理分级组间α-SMA连续性染色血管值有显著差异。提示α-SMA作为一种癌前病变辅助诊断指标具有高度的敏感性和鉴别度，尤其是重度异常增生与癌之间的明显落差，对以往将重度上皮异常增生混同于原位癌的观点提出了质疑,并为两者的鉴别诊断提供了一种有较高区分度的方法。
2. α-SMA表达与病理分级的相关性探讨
一些血管收缩剂可通过细胞膜上的G蛋白激活C-Jun-NH2未端激酶，从而激活α-SMA启动子，促进α-SMA的表达。肿瘤血管平滑肌可能由于基因突变，基因序列的丢失、插入等分子水平的改变，影响这一过程的正常进行，从而改变α-SMA的表达〔8〕。本实验中，α-SMA表达量随病理分级的递增呈下降趋势(负相关)，提示血管在组织恶变而增生的同时，出现基底膜分解、内皮迁移、增生、腔形成及和其它血管吻合等一系列改变〔9〕。随着平滑肌、肌上皮、周细胞等的破坏，形成大量管壁结构不完整，功能不完善的新生血管，构成癌变血管的独特空间配布，进而促进了组织恶变。实验结果证实，癌前病变及癌变期大量异常新生血管生成，是癌变关键。提示阻断癌变过程中的血管生成可能对口腔癌的防治具有重大意义。
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参考文献
1 Drew Js, Murphy RA. Actin isoform expression cellular heterogenity, and contractile function in smooth muscle.Can. J Physiol.Pharmacol，1997;75(7):869-877
2 Hoyama M, Kurotaki H, Yagihashi N. Immunohistochemical assessment of proliferative activity in mammary adenomyoepithelioma. Histopathology, 1997;31(2):134～139
3 Emoto M, Iwasaki H, Mimura K, et al. Differences in the angiogenesis of benign and malignant ovarian tumors, demonstrated by analyses of color Doppler Ultrasoundimmunohistochemistry, and microvessel density. Cancer, 1997;80(5):889～907
, 百拇医药
4 翁瑜珍.α-平滑肌肌动蛋白在良恶性卵巢肿瘤中的表达。国外医学.分子生物学分册，1994；16(2)：95
5 Salley JJ. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian Hamster. J. Dent. Reserch,1954;33:253～262
6 宋宇峰，温玉明.二甲基苯丙蒽诱导金黄地鼠颊囊癌的模型建立及组织学研究.华西口腔医学杂志，1994；12(2)：111
7 张继珍，范顺才，张晨光.肌上皮细胞和基底膜有乳腺良恶性肿瘤病变中存在的意义.中国肿瘤临床，1994；21(9)：676～678
8 Higashita R, Li L, Van-Puttn V et al. Galpha 16 mimics Vasoconstrictor actin to induce smooth muscl e alpha-actin in vascular smooth muscle cells through a Jun-NH2-terminalkinase dependent pathway. J. Biol. Chem.,1997;2(41):25845～25850
9 Shima DT, Saunders KB, Gougos AD et al. Alterations in gene expression associated with changes in the state of endothelial differentiation. Differentiation, 1995;58:217～226, 百拇医药
单位：200011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院
关键词：金地鼠颊囊；α-SMA；癌前病变
临床口腔医学杂志990416 提 要 目的 动态观察金地鼠颊癌变过程中α-SMA表达规律，并分析其表达和癌变间的相关性。方法 采用免疫组化技术检测金地鼠颊囊白斑癌变模型标本的α-SMA表达情况。结果 在轻、中、重度异常增生及癌各组间，α-SMA 表达减少有显著差异。随病变恶性程度增加，α-SMA的表达量减少。结论 α-SMA是一种良好的癌前病变辅助诊断指标。
Dynamic Observation on expression of α-SMA during the evolution of Golden Hamster Cheek Pouch Carcinogenesis.
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Hua li, Zhou Zengtong, Zhand Shulong et al.
Oral medicine of the Ninth people's Hospital, Shanghai Second Medical University 200011
Abstract Objectives To observe the expressing of α-SMA dynamically and to analyse the correlativity between the expression and the carcinogenesis during the evolution of golden hamster cheek pouch carcinogenesis. Materials and Methods Immunohistochemistry with anti α-SMA was applied to detect the expression of α-SMA in leukoplakia model and carcinogenesis.Results There was significant decrease in expression of α-SMA in mild, moderate, severe displasia and carcinoma. The quantity of α-SMA protein decreased with the malignant degree of pathological changes ascending.Conclusions α-SMA was a good auxiliary diagnostic marker for detecting precarcinoma.
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Key words golden hamster cheek α-SMA precarcinoma
材料和方法
材料
1. 实验动物：叙利亚品系金地鼠48只，由上海西普尔-BK公司提供。
2. 缓冲液配置(TRIS—HCL液，0.5M，pH7.6)：TRIS 61g,加入340ml Hcl,用800ml蒸馏水充分混匀后，再以蒸馏水定容至1000ml。
3. 免疫组化试剂：ABC试剂盒由DAKO公司提供。
方法
1. 实验动物分组
空白对照组：6只，常规饲养，左侧颊囊涂布0.9%NaCl液，分别于4～9周后处死，取左侧涂药区颊囊组织共6例。
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模型组：42只，常规饲养，左侧颊囊涂布0.5%DMBA丙酮液，分别于4～9周后处死，取左侧涂药区颊囊组织共42例。
2. α-SMA检测
取下的组织块常规石蜡包埋，连续切片2份各约5μm厚，一份HE染色光镜下病理分级;一份60℃烘箱内放置40分钟后，恒温箱中保持24～48小时，准备作α-SMA免疫组化染色。
免疫组化染色步骤如下
2.1 脱蜡水化：恒温箱中取出切片，二甲苯中15分钟×3次→100%、95%、90%、80%、70%梯度乙醇液中，每次均为5分钟→蒸馏水冲洗干净。
2.2 微波处理修理丢失的抗原决定簇：脱蜡水化后切片置缓冲液洗5min×3次，再置0.1M柠檬酸缓冲液中微波处理10min。
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2.3 α-SMA染色前处理：缓冲液洗涤5min×3次→0.2% Triton-X 100中10min→清水冲洗5min×3次→0.3%H2O2中浸泡5min→5%牛奶中孵育30min。
2.4 α-SMA染色：常规ABC法。
3. 光镜下病理分级：标准参照1978年WHO口腔癌前病变协作中心诊断标准。
观察与计数
每侧高倍镜下计算相邻3个视野内α-SMA连续性染色血管密度值(连续性染色血管数/视野内血管总数×100%)，取平均值。
统计学处理
采用单因素方差分析，Duncan法组间两两比较和相关分析。
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结 果
1. 光镜下病理分级结果
正常粘膜6例，炎症7例，轻、中和重度异常增生分别为12例、11例和9例，癌3例。
2. 免疫组化检测结果
涂DMBA不同周数组间α-SMA检测结果(表1)。
表1 涂DMBA不同周数组间α-SMA连续性染色血管密度(%) 涂DMBA周数
例数
第4周
7
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54.02±30.61
第5周
7
36.79±24.26
第6周
7
35.95±22.89
第7周
7
27.52±18.32
第8周
7
19.28±17.50
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第9周
7
15.33±14.58
图1示：随涂DMBA周数的增加，α-SMA表达量呈渐进性下降。
图1 涂DMBA不同周数组间α-SMA连续性染色血管密度(%)
从表2可见，正常颊囊粘膜与炎症组间粘膜下α-SMA连续性染色血管密度无显著性差别(P>0.05)；鳞癌组较重度异常增生组粘膜下α-SMA连续性染色血管密度下降有显著性差别(P<0.05)；其余各组间粘膜下α-SMA连续性染色血管密度有高度显著性差别(P>0.01)。
表2 不同病理变化组间颊囊粘膜下α-SMA连续性染色血管密度(%) 病理分级
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例数
x±s
α=0.05
α=0.01
正常粘膜
6
100.00±0.00
A
A
炎 症
7
100.00±0.00
A
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A
轻度异常增生
12
56.35±8.45
B
B
中度异常增生
11
20.86±5.50
C
C
重度异常增生
9
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9.22±2.02
D
D
癌
3
2.64±0.35
E
D
变量转换后，采用单因素方差分析，Duncan法作组间两两比较，字母相同为无显著差别。
图2 正常粘膜血管α-SMA染色(140倍)
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图3 异常增生粘膜血管α-SMA染色(140倍)
3. 相关分析结果
α-SMA连续性染色血管密度与病理分级呈高度负相关，即随病变恶性程度增高，α-SMA表达量下降(P<0.01)。
讨 论
1. α-SMA在口腔癌前病变恶化诊断中意义
α-SMA是一种细胞骨架蛋白，与血管的收缩功能及渗透性有关，广泛分布于肠、睾丸、卵巢等多种器官、组织的平滑肌、肌上皮细胞、周细胞和一些基底细胞中。抗α-SMA单抗能特异性识别这些细胞〔1、2〕。本实验采用DMBA诱导的金地鼠颊囊癌变模型〔5、6〕，用抗α-SMA鼠抗进行免疫组化检测，动态观察癌变过程中α-SMA表达规律，结果发现：正常和炎症上皮中血管壁染色呈深棕色，连续袖套状紧密包绕血管腔。随病变恶性程度的上升，这种染色血管数量明显减少，出现不连续的棕黄片段，部分血管则无染色。这一结论与Emoto、张继增等〔3、4、7〕在卵巢、乳房良恶性肿瘤中的血管观察结果相似。提示病变发展至异常增生及鳞癌期，血管壁有不同程度的破坏，而新生毛细血管管壁多有缺损、畸形，引起管腔形态的改变和渗漏现象。可能与晚期肿瘤渗透性增加、易浸润和转移的病理学行为有关。
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目前，对于口腔粘膜癌前病变的诊断主要依靠镜下12条病理改变，由于定性诊断方法的主观性较强，故难以满足早期诊断的要求。由表1、表2可知，随化学致癌物接触时间的延长，或随病变恶性程度的增加，α-SMA的表达量呈递减。轻、中、重度上皮异常增生及癌各病理分级组间α-SMA连续性染色血管值有显著差异。提示α-SMA作为一种癌前病变辅助诊断指标具有高度的敏感性和鉴别度，尤其是重度异常增生与癌之间的明显落差，对以往将重度上皮异常增生混同于原位癌的观点提出了质疑,并为两者的鉴别诊断提供了一种有较高区分度的方法。
2. α-SMA表达与病理分级的相关性探讨
一些血管收缩剂可通过细胞膜上的G蛋白激活C-Jun-NH2未端激酶，从而激活α-SMA启动子，促进α-SMA的表达。肿瘤血管平滑肌可能由于基因突变，基因序列的丢失、插入等分子水平的改变，影响这一过程的正常进行，从而改变α-SMA的表达〔8〕。本实验中，α-SMA表达量随病理分级的递增呈下降趋势(负相关)，提示血管在组织恶变而增生的同时，出现基底膜分解、内皮迁移、增生、腔形成及和其它血管吻合等一系列改变〔9〕。随着平滑肌、肌上皮、周细胞等的破坏，形成大量管壁结构不完整，功能不完善的新生血管，构成癌变血管的独特空间配布，进而促进了组织恶变。实验结果证实，癌前病变及癌变期大量异常新生血管生成，是癌变关键。提示阻断癌变过程中的血管生成可能对口腔癌的防治具有重大意义。
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参考文献
1 Drew Js, Murphy RA. Actin isoform expression cellular heterogenity, and contractile function in smooth muscle.Can. J Physiol.Pharmacol，1997;75(7):869-877
2 Hoyama M, Kurotaki H, Yagihashi N. Immunohistochemical assessment of proliferative activity in mammary adenomyoepithelioma. Histopathology, 1997;31(2):134～139
3 Emoto M, Iwasaki H, Mimura K, et al. Differences in the angiogenesis of benign and malignant ovarian tumors, demonstrated by analyses of color Doppler Ultrasoundimmunohistochemistry, and microvessel density. Cancer, 1997;80(5):889～907
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4 翁瑜珍.α-平滑肌肌动蛋白在良恶性卵巢肿瘤中的表达。国外医学.分子生物学分册，1994；16(2)：95
5 Salley JJ. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian Hamster. J. Dent. Reserch,1954;33:253～262
6 宋宇峰，温玉明.二甲基苯丙蒽诱导金黄地鼠颊囊癌的模型建立及组织学研究.华西口腔医学杂志，1994；12(2)：111
7 张继珍，范顺才，张晨光.肌上皮细胞和基底膜有乳腺良恶性肿瘤病变中存在的意义.中国肿瘤临床，1994；21(9)：676～678
8 Higashita R, Li L, Van-Puttn V et al. Galpha 16 mimics Vasoconstrictor actin to induce smooth muscl e alpha-actin in vascular smooth muscle cells through a Jun-NH2-terminalkinase dependent pathway. J. Biol. Chem.,1997;2(41):25845～25850
9 Shima DT, Saunders KB, Gougos AD et al. Alterations in gene expression associated with changes in the state of endothelial differentiation. Differentiation, 1995;58:217～226, 百拇医药