动态浊度法定量检测血塞通注射液中细菌内毒素
作者：张秀萍 赵海山 苑庆华 唐元泰 蔡彤 王思理▲
单位：张秀萍 赵海山 苑庆华(天津市药品检验所 300070)；唐元泰 蔡彤 王思理(中国药品生物制品检定所 100050)
关键词：
药物分析杂志000424 血塞通注射液是从中药三七中提取主要成分三七总皂苷，用于治疗脑血栓等症的中药注射制剂，本文通过采用检测细菌内毒素的动态浊度法，对血塞通注射液进行添加内毒素回收试验及与热原检查的对比试验分析，以建立血塞通注射液中内毒素定量分析方法。
1 材料
血塞通注射液，规格：2 mL∶100mg,批号：990206，990311，990301，990415，980954，云南昆明兴中制药厂。鲎试剂K4981L，规格：每瓶5.2 mL，美国ENDOSAFE。细胞内毒素国家标准品，批号981(每支9 000 EU)，中国药品生物制品检定所。细菌内毒素检查用水7L95S ，5 00mL，天津大冢制药有限公司。BET-32C型细菌内毒素测定仪，天津大学无线电厂生产。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 细菌内度素限值的确立[1] 按公式L=K·M-1,K为最小致热阈值(5.0 EU·kg-1)，M为家兔给药剂量(0.5 mL·kg-1)。计算得血塞通注射液内毒素限值为10 EU·mL-1。
2.2 标准曲线制作及可靠性 用检查用水将内毒素国家标准品 981进行10及2倍稀释，使其最终内毒素浓度分别为0.25，0.125，0.062 5，0.031 3，0.01 5 6 ，0.007 8EU·mL-1稀释系列，各取0.2 mL分别加到预先加有0.1 mL鲎试剂反应 管内，混合均匀，插入BET-32C细胞内毒素测定仪内进行检测，其中每个浓度重复3管。结果见表1。标准 曲线：
, 百拇医药
logT=2.793-0.282 0 logC r=-0.998 0
最低浓度λ1=0.007 8EU·mL-1，且空白对照管在检测时间外，故标准曲线 成立。
表1 标准曲线的可靠性 内毒素浓度/
EU·mL-1
平均反应时间/s
RSD/%
阴性对照
>5400
0.0078
, 百拇医药 2490
1.14
0.0156
1980
15.70
0.0313
1665
2.12
0.0625
1315
1.61
0.125
1100
, 百拇医药
5.14
0.25
945
3.74
2.3 干扰试验
2.3.1 样品稀释倍数计算 按公式MVD=L·λ-11，其中λ1为标准曲线的 最低浓度0.007 8 EU·mL-1，计算得样品试验时最大有效稀释倍数为1280倍。
2.3.2 样品溶液配制及预干扰试验[2] 将血塞通注射液用内毒素检查用水依次稀释为20，40，80，160，320倍。记为Ai液，同时另取5管，进行同样倍数稀释，并在稀释液中添加内毒素浓度λm为0.062 5 EU·mL-1的细菌内毒素标准液，作为样品阳性对照管，记为 Bi液，分别取上述各液0.2 mL加入预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混匀后插入细菌内毒素测定仪内进行检测，其中每个浓度重复2管，计算平均回收率，回收率(%)=(Bi液内毒素值-Ai液内毒素值)·λ-1m·100%。结果见表2。标准曲线：
, 百拇医药
logT=2.793-0.282 0logC r=-0.998 0
根据EP 1999Supplement规定，样品的添加内毒素平均回收率在50%～200%范围内，表明样品溶液对鲎试剂反应无干扰影响，表2结果表明：血塞通注射液在80倍时已无干扰，80倍以下样品溶液对鲎试验法存在很强的抑制作用，而在160倍时样品溶液有更好的回收率，同时160倍也正好是添加内毒素浓度λm时的试验稀释倍数，因此根据上述结果，正式干扰试验时选用160倍液。
表2 注射液(批号990311)预干扰试验(EU·mL-1 ) 稀释倍数
Ai液
Bi液
回收率/%
, 百拇医药
20
<0.0078
0.0029
4.64
40
<0.0078
0.0117
18.72
80
<0.0078
0.033
52.8
160
, 百拇医药
<0.0078
0.0758
121.3
2.4 干扰试验与热原检查 取4批血塞通注射液分别稀释到160 倍，并同时制备样品阳性对照和标准曲线各浓度系列，用细菌内毒素测定仪进行检测，每个浓度点重复2管，并设空白对照，另外4批样品同时进行热原检查，结果见表3。标准曲线：
logT=2.678-0.3402 logC r=-0.986 8
结果发现：4批血塞通注射液的回收率均在50%～200%范围内，表明无干扰影响，因此作为日常检验选用160倍即可。
表3 干扰试验与热原检查结果对比(EU·mL-1) 样品批号
, 百拇医药
Ai液
Bi液
回收率/%
热原检查
980954
<0.0078
0.077
123.2
合格
990206
<0.0078
0.0811
129.8
, 百拇医药
合格
990301
<0.0078
0.0535
85.60
合格
990415
<0.0078
0.0511
81.76
合格
3 讨论
3.1 由血塞通注射液的干扰试验结果发现：样品溶液在80倍以下存在很强的抑制作用，从80倍开始已无干扰，而在160倍时能得到更好的回收率，同时160倍也正好是添加内毒素浓度λm时的试验稀释倍数，因此日常检查时取160倍稀释液进行。
, http://www.100md.com
3.2 由表3结果发现：4批血塞通注射液的160倍稀释液进行干 扰定量检测，结果样品的内毒素含量均在1.25 EU·mL-1(0.0078×160=1.25)以下，小于内 毒素限值10EU·mL-1，且样品回收率均在50%～200%范围内。
3.3 对于中草药注射剂，用传统的家兔法检测污染内毒素，由于操作复杂，影响因素多，对试验结果影响很大。利用鲎试剂检测，往往要排除其他成分对凝胶产生的影响，最简单有效的方法就是稀释，根据欧洲药典和日本药典等对于凝胶法和动态浊度法的操作方法的规定，可以发现，对于相同鲎试剂，动态浊度法比凝胶法可以检测到更低的检测下限，用动态浊度仪进行定量检测，结果准确，在电脑屏幕上还可以观察到更多的反应曲线细节。因此对于这类注射剂，用动态浊度法检查更为合适。 ■
参考文献
1.夏振民.药品细菌内毒素检查的限值.药物分析杂志，1995，15(3) ：54
2.EP Supplement 1999.41
(本文于1999年10月12日收到), 百拇医药
单位：张秀萍 赵海山 苑庆华(天津市药品检验所 300070)；唐元泰 蔡彤 王思理(中国药品生物制品检定所 100050)
关键词：
药物分析杂志000424 血塞通注射液是从中药三七中提取主要成分三七总皂苷，用于治疗脑血栓等症的中药注射制剂，本文通过采用检测细菌内毒素的动态浊度法，对血塞通注射液进行添加内毒素回收试验及与热原检查的对比试验分析，以建立血塞通注射液中内毒素定量分析方法。
1 材料
血塞通注射液，规格：2 mL∶100mg,批号：990206，990311，990301，990415，980954，云南昆明兴中制药厂。鲎试剂K4981L，规格：每瓶5.2 mL，美国ENDOSAFE。细胞内毒素国家标准品，批号981(每支9 000 EU)，中国药品生物制品检定所。细菌内毒素检查用水7L95S ，5 00mL，天津大冢制药有限公司。BET-32C型细菌内毒素测定仪，天津大学无线电厂生产。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 细菌内度素限值的确立[1] 按公式L=K·M-1,K为最小致热阈值(5.0 EU·kg-1)，M为家兔给药剂量(0.5 mL·kg-1)。计算得血塞通注射液内毒素限值为10 EU·mL-1。
2.2 标准曲线制作及可靠性 用检查用水将内毒素国家标准品 981进行10及2倍稀释，使其最终内毒素浓度分别为0.25，0.125，0.062 5，0.031 3，0.01 5 6 ，0.007 8EU·mL-1稀释系列，各取0.2 mL分别加到预先加有0.1 mL鲎试剂反应 管内，混合均匀，插入BET-32C细胞内毒素测定仪内进行检测，其中每个浓度重复3管。结果见表1。标准 曲线：
, 百拇医药
logT=2.793-0.282 0 logC r=-0.998 0
最低浓度λ1=0.007 8EU·mL-1，且空白对照管在检测时间外，故标准曲线 成立。
表1 标准曲线的可靠性 内毒素浓度/
EU·mL-1
平均反应时间/s
RSD/%
阴性对照
>5400
0.0078
, 百拇医药 2490
1.14
0.0156
1980
15.70
0.0313
1665
2.12
0.0625
1315
1.61
0.125
1100
, 百拇医药
5.14
0.25
945
3.74
2.3 干扰试验
2.3.1 样品稀释倍数计算 按公式MVD=L·λ-11，其中λ1为标准曲线的 最低浓度0.007 8 EU·mL-1，计算得样品试验时最大有效稀释倍数为1280倍。
2.3.2 样品溶液配制及预干扰试验[2] 将血塞通注射液用内毒素检查用水依次稀释为20，40，80，160，320倍。记为Ai液，同时另取5管，进行同样倍数稀释，并在稀释液中添加内毒素浓度λm为0.062 5 EU·mL-1的细菌内毒素标准液，作为样品阳性对照管，记为 Bi液，分别取上述各液0.2 mL加入预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混匀后插入细菌内毒素测定仪内进行检测，其中每个浓度重复2管，计算平均回收率，回收率(%)=(Bi液内毒素值-Ai液内毒素值)·λ-1m·100%。结果见表2。标准曲线：
, 百拇医药
logT=2.793-0.282 0logC r=-0.998 0
根据EP 1999Supplement规定，样品的添加内毒素平均回收率在50%～200%范围内，表明样品溶液对鲎试剂反应无干扰影响，表2结果表明：血塞通注射液在80倍时已无干扰，80倍以下样品溶液对鲎试验法存在很强的抑制作用，而在160倍时样品溶液有更好的回收率，同时160倍也正好是添加内毒素浓度λm时的试验稀释倍数，因此根据上述结果，正式干扰试验时选用160倍液。
表2 注射液(批号990311)预干扰试验(EU·mL-1 ) 稀释倍数
Ai液
Bi液
回收率/%
, 百拇医药
20
<0.0078
0.0029
4.64
40
<0.0078
0.0117
18.72
80
<0.0078
0.033
52.8
160
, 百拇医药
<0.0078
0.0758
121.3
2.4 干扰试验与热原检查 取4批血塞通注射液分别稀释到160 倍，并同时制备样品阳性对照和标准曲线各浓度系列，用细菌内毒素测定仪进行检测，每个浓度点重复2管，并设空白对照，另外4批样品同时进行热原检查，结果见表3。标准曲线：
logT=2.678-0.3402 logC r=-0.986 8
结果发现：4批血塞通注射液的回收率均在50%～200%范围内，表明无干扰影响，因此作为日常检验选用160倍即可。
表3 干扰试验与热原检查结果对比(EU·mL-1) 样品批号
, 百拇医药
Ai液
Bi液
回收率/%
热原检查
980954
<0.0078
0.077
123.2
合格
990206
<0.0078
0.0811
129.8
, 百拇医药
合格
990301
<0.0078
0.0535
85.60
合格
990415
<0.0078
0.0511
81.76
合格
3 讨论
3.1 由血塞通注射液的干扰试验结果发现：样品溶液在80倍以下存在很强的抑制作用，从80倍开始已无干扰，而在160倍时能得到更好的回收率，同时160倍也正好是添加内毒素浓度λm时的试验稀释倍数，因此日常检查时取160倍稀释液进行。
, http://www.100md.com
3.2 由表3结果发现：4批血塞通注射液的160倍稀释液进行干 扰定量检测，结果样品的内毒素含量均在1.25 EU·mL-1(0.0078×160=1.25)以下，小于内 毒素限值10EU·mL-1，且样品回收率均在50%～200%范围内。
3.3 对于中草药注射剂，用传统的家兔法检测污染内毒素，由于操作复杂，影响因素多，对试验结果影响很大。利用鲎试剂检测，往往要排除其他成分对凝胶产生的影响，最简单有效的方法就是稀释，根据欧洲药典和日本药典等对于凝胶法和动态浊度法的操作方法的规定，可以发现，对于相同鲎试剂，动态浊度法比凝胶法可以检测到更低的检测下限，用动态浊度仪进行定量检测，结果准确，在电脑屏幕上还可以观察到更多的反应曲线细节。因此对于这类注射剂，用动态浊度法检查更为合适。 ■
参考文献
1.夏振民.药品细菌内毒素检查的限值.药物分析杂志，1995，15(3) ：54
2.EP Supplement 1999.41
(本文于1999年10月12日收到), 百拇医药