宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达
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山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：栾怡 卞继峰 宋长芹 贾继辉 周亚滨 权衡
单位：栾怡 卞继峰 贾继辉 周亚滨 权衡(山东医科大学微生物学与免疫学教研室)；宋长芹(山东医科大学附属医院检验科)
关键词：子宫颈肿瘤；乳头瘤病毒；人；克隆；分子；大肠杆菌
山东医科大学学报000203摘 要：目的：进行人乳头瘤病毒16型相关肿瘤的E6血清学研究。方法：采用聚合酶链反应(PCR)从宫颈癌组织DNA中扩增出HPV16E6基因片段，克隆至测序质粒pGEM-T中，并用限制性内切酶将HPV16E6基因切下，克隆至表达质粒pGEMEX-1中，经IPTG诱导表达为融合蛋白，分子量约45KD。结果：融合蛋白占菌体总蛋白的25%，免疫印迹检测表明HPV16E6融合蛋白能被抗HPV16E6抗体识别。结论：大肠杆菌表达HPV16E6蛋白的获得可为HPV相关性肿瘤的血清学诊断和流行病学研究打下基础。
, 百拇医药
分类号：R737.3；Q785；R378.2+1 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0120-03
GENE CLONING AND EXPRESSING IN PROKARYOTIC CELL OF HPV16 E6 FROM THE CERVICALCANCER
LUAN Yi ,BIAN Ji-feng ,SONG Chang-qin
(Dept.ofMicroblologyandlrrmmnology，ShandongMeJicalUnlversity)
Abstract：Objective: To deepen serological study of E6 in tumors associated with human papillomavirus 16 type (HPV16).Methods: PCR technique was used to amplify the HPV16E6 gene fragment from the DNA of cervical cancer tissue. The fragment was then cloned into the pGEM-T. After being digested with SalI and NotI, the HPV16E6 was cloned into the expression vector pGEMEX-1. The recombinant vector was induced by IPTG to express the fusion protein with molecular weight of 45KD.Results:The fusion protein accounted for 25% of the whole protein and the expression protein was recognized by the anti-E6 antibody in the Western Blot. Conclusion:This protein can be used as a basic antigen in the serological diagnosis of HPV-associated tumors.
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Keywords：Cervical carcinoma; Papillomavirus human; Cloning,molecular;Escherichia coil 人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是重要的DNA致瘤病毒，高危型HPV16型与宫颈癌的发生密切相关。HPV16编码的早期蛋白E6具有转化活性、DNA结合活性和转录调节活性等。各国学者均以标准株HPV16E6序列进行了原核细胞和真核细胞表达[1]。我们从宫颈癌组织地方株HPV16基因中PCR扩增并构建了HPV16E6重组质粒，并在原核细胞中表达。拟以表达的HPV16E6融合蛋白作为抗原，检测HPV相关肿瘤的HPV16E6抗体水平。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒、酶类与抗体克隆质粒pGEM-T、表达质粒pGEMEX-1、大肠杆菌JM109(DE3)、限制性内切酶、T4DNA连接酶和TaqDNA聚合酶均购自Promega公司。兔抗HPV16E6抗体ZY96A由美国华盛顿大学Galloway教授惠赠。
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1.1.2标本来源宫颈癌组织取自山东医科大学附属医院妇产科，经病理学诊断为宫颈鳞状上皮癌，经蛋白酶K消化，取DNA做模板，用型特异性HPV16引物，PCR鉴定含HPV16DNA的宫颈癌组织标本。
1.2方法
1.2.1设计引物，PCR扩增目的基因设计特异性引物P1、P2[2]，序列如下：P1：5’GGCTGGATCCGAACCGAAACCGG3’P2：5’CGCTGGATCCGTAGGTGTATCTCC3’以宫颈癌组织DNA为模板，加入引物P1、P2，dNTP及缓冲液，热启动100℃10min后，加入TaqDNA聚合酶，常规扩增条件，最后一次循环延伸72℃15min，以保证所有的扩增片段3’末端都带有A尾。扩增片段长约600bp。PCR产物经快速电洗脱方法回收。
1.2.2分子克隆与鉴定PCR产物直接连接于pGEM-T载体，转化JM109(DE3)，在含有Ampr、X-gal和IPTG的LB平板上，培养20h，筛选白色菌落。经BamHI酶切鉴定
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1.2.3表达质粒的构建pGEM-E6经SalI、NotI双酶后，用快速电洗脱方法回收600bp的E6片段，插入pGEMEX-1中，重组子经酶切鉴定。
1.2.4融合蛋白的诱导表达与测定含表达质粒的阳性菌落在37℃震荡培养，生长至OD600=0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度O.1mmol/L，继续震荡培养过夜。取1ml培养物离心5000r/min×10min，集菌，重悬于印SDS-PAGE电泳上样缓冲液中，100℃沸水煮10min。取出15μl上清液作15%印SDS-PAGE电泳，凝胶经考马斯亮蓝R250染色，脱色后观察，并在双薄层扫描仪(ShimadzaCS-930)上进行表达蛋白的含量测定。将凝胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜上，电压40V，6h。加入HPV16E6抗体ZY96A和羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，经DNA显色。
2结果
2.1宫颈癌组织中HPV16的检出提取宫颈癌组织中DNA，用HPV16型特异性引物PCR检测，筛选含HPV16的DNA标本，扩增片段490bp，见图1。
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图1PCR检测宫颈痼组织中HPV16的序列
1：分子量标记pBR332/HinfI2：pHPV16阳性对照3，4：含HPV16的宫颈癌组织
Fig.1PCRdetectivepattetnsofHPV16sequencefromcervicalcancer
1:molecularmarkerpBR322/HinfI2:positivecontrolofpoasmidpHPV163,4:cervicalCancerwithHPV16
2.2宫颈癌组织中HPV16E6基因的扩增从含HPV16DNA的宫颈癌组织标本中，采用引物P1、P2扩增出HPV16E6片段，长约600bp，含HPV16E6完整的开放读码框，见图2。
图2PCR扩增HPV16E6基因的图谱
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1：分子量标记pBR322/HinfI2：pHPV16阳性对照3：阴性对照4：含HPV16E6的宫颈癌组织
Fig.2PCRamplificationpatternsofHPV16E6gene
1:molecularmarkerpBR322/HinfI2:positivecontrolofplasmidpHPV163:negativecontrol4:cervicalcancerwithHPV16E6
2.3HPV16融合蛋白在大肠杆菌中表达与测定HPV16E6基因克隆于表达质粒pGEMEX-1中，经BamHI酶切可见4000bp和600bp的两条带，分别为载体和外源基因，见图3。在T7启动子指导下经IPTG诱导表达为融合蛋白，同时以各种阴性大肠杆菌蛋白作对照。在电泳图谱及免疫印迹检测结果可见在分子量约45KD处有比对照多出一条特异性蛋白带，见图4。T7融合蛋白N末端长约26KD，加上C末端HPV16E619KD，推算该分子量为45KD的蛋白条带为T7-HPV16E6的融合蛋白。凝胶经双薄层扫描仪扫描，诱导的融合蛋白占总体蛋白的25%。
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图3重组质粒pGEMEX-E6的酶切图谱
1：分子量标DNA/BamHI2：载体pGEMEX-1/BamHI3：pGEMEX-E6/BamHI
Fig.3EnzymedigestionpatternsofrecombinantplasmidpGEMEX-E6
1:molecularmarkerDNA/BamHI2:VectorpGEMEX-1/BamHI3:pGEMEX-E6/BamHI
图4表达蛋白的SDS-PAGE分析
1：标准蛋白2，4，6：JM109(DE3)总蛋白3，5，7：含pG-16E6的JM109(DE3)总蛋白
Fig.4SDS-PAGEanalysisofexpressionproducts
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1:Markerprotean2,4,6:TotalproteinofJM109(DE3)3,5,7:TotalproteinofinducedJM109(DE3)withpG-16E6
3讨论
目前，对HPV16E6的基因克隆多采用标准HPV16序列的质粒为模板，缺乏对野生株HPV16序列来源的E6抗原特性的研究。我们从宫颈癌组织DNA中扩增出HPV16E6片段，采用热启动方法，可有效地减少非特异性DNA条带的产生。
为了使HPV16E6基因高效表达，我们使外源基因以胞浆内融合蛋白的形式，即氨基端是原核序列，羧基端是外源HPV16E6序列行诱导表达，表达蛋白占总体蛋白的25%，比国内学者[3]所制备的HPV16E6非融合蛋白表达量(20%)稍高。本研究选用的pGEMEX-1载体，具有T7强启动子，清除了外源基因起始信号ATG周围核酸序列对其表达水平的影响，并且E6基因不含有大肠杆菌JM109(DE3)的稀有密码子，从而使E6获得了高效表达。同时该融合蛋白有可能减少表达蛋白对宿主细胞的毒性，这都有利于外源蛋白在大肠杆菌中的表达[4]。
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机体HPV16E6抗体阳性率与HPV16病毒感染的阳性率相关，是HPV16相关性宫颈痛发生的标记之一。研制HPV16E6表达蛋白，作为检测HPV相关肿瘤抗体的抗原，将为本地区HPV16感染的流行病学调查和血清学诊断提供实验基础。
基金项目：山东省卫生厅资助课题
参考文献：
[1]Seedorf K. Human papillomavirus type 16 DNA sequence [J].J Virol, 1985,145(2):181
[2]栾怡，于修平，赵蔚明，等.人乳头瘤病毒16型致癌基因的克隆及其鉴定[J].山东医科大学学报，1997，35(1)：15
[3]桂长云，宋国云，李昆，等.人乳头瘤病毒16型E6基因表产物单克隆抗体的制备研究[J].中国医学科学院学报，1994，16(4)：290
[4]龙建银，外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，1997，24(2)：126
收稿日期：1999-01-28, http://www.100md.com
单位：栾怡 卞继峰 贾继辉 周亚滨 权衡(山东医科大学微生物学与免疫学教研室)；宋长芹(山东医科大学附属医院检验科)
关键词：子宫颈肿瘤；乳头瘤病毒；人；克隆；分子；大肠杆菌
山东医科大学学报000203摘 要：目的：进行人乳头瘤病毒16型相关肿瘤的E6血清学研究。方法：采用聚合酶链反应(PCR)从宫颈癌组织DNA中扩增出HPV16E6基因片段，克隆至测序质粒pGEM-T中，并用限制性内切酶将HPV16E6基因切下，克隆至表达质粒pGEMEX-1中，经IPTG诱导表达为融合蛋白，分子量约45KD。结果：融合蛋白占菌体总蛋白的25%，免疫印迹检测表明HPV16E6融合蛋白能被抗HPV16E6抗体识别。结论：大肠杆菌表达HPV16E6蛋白的获得可为HPV相关性肿瘤的血清学诊断和流行病学研究打下基础。
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分类号：R737.3；Q785；R378.2+1 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0120-03
GENE CLONING AND EXPRESSING IN PROKARYOTIC CELL OF HPV16 E6 FROM THE CERVICALCANCER
LUAN Yi ,BIAN Ji-feng ,SONG Chang-qin
(Dept.ofMicroblologyandlrrmmnology，ShandongMeJicalUnlversity)
Abstract：Objective: To deepen serological study of E6 in tumors associated with human papillomavirus 16 type (HPV16).Methods: PCR technique was used to amplify the HPV16E6 gene fragment from the DNA of cervical cancer tissue. The fragment was then cloned into the pGEM-T. After being digested with SalI and NotI, the HPV16E6 was cloned into the expression vector pGEMEX-1. The recombinant vector was induced by IPTG to express the fusion protein with molecular weight of 45KD.Results:The fusion protein accounted for 25% of the whole protein and the expression protein was recognized by the anti-E6 antibody in the Western Blot. Conclusion:This protein can be used as a basic antigen in the serological diagnosis of HPV-associated tumors.
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Keywords：Cervical carcinoma; Papillomavirus human; Cloning,molecular;Escherichia coil 人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是重要的DNA致瘤病毒，高危型HPV16型与宫颈癌的发生密切相关。HPV16编码的早期蛋白E6具有转化活性、DNA结合活性和转录调节活性等。各国学者均以标准株HPV16E6序列进行了原核细胞和真核细胞表达[1]。我们从宫颈癌组织地方株HPV16基因中PCR扩增并构建了HPV16E6重组质粒，并在原核细胞中表达。拟以表达的HPV16E6融合蛋白作为抗原，检测HPV相关肿瘤的HPV16E6抗体水平。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒、酶类与抗体克隆质粒pGEM-T、表达质粒pGEMEX-1、大肠杆菌JM109(DE3)、限制性内切酶、T4DNA连接酶和TaqDNA聚合酶均购自Promega公司。兔抗HPV16E6抗体ZY96A由美国华盛顿大学Galloway教授惠赠。
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1.1.2标本来源宫颈癌组织取自山东医科大学附属医院妇产科，经病理学诊断为宫颈鳞状上皮癌，经蛋白酶K消化，取DNA做模板，用型特异性HPV16引物，PCR鉴定含HPV16DNA的宫颈癌组织标本。
1.2方法
1.2.1设计引物，PCR扩增目的基因设计特异性引物P1、P2[2]，序列如下：P1：5’GGCTGGATCCGAACCGAAACCGG3’P2：5’CGCTGGATCCGTAGGTGTATCTCC3’以宫颈癌组织DNA为模板，加入引物P1、P2，dNTP及缓冲液，热启动100℃10min后，加入TaqDNA聚合酶，常规扩增条件，最后一次循环延伸72℃15min，以保证所有的扩增片段3’末端都带有A尾。扩增片段长约600bp。PCR产物经快速电洗脱方法回收。
1.2.2分子克隆与鉴定PCR产物直接连接于pGEM-T载体，转化JM109(DE3)，在含有Ampr、X-gal和IPTG的LB平板上，培养20h，筛选白色菌落。经BamHI酶切鉴定
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1.2.3表达质粒的构建pGEM-E6经SalI、NotI双酶后，用快速电洗脱方法回收600bp的E6片段，插入pGEMEX-1中，重组子经酶切鉴定。
1.2.4融合蛋白的诱导表达与测定含表达质粒的阳性菌落在37℃震荡培养，生长至OD600=0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度O.1mmol/L，继续震荡培养过夜。取1ml培养物离心5000r/min×10min，集菌，重悬于印SDS-PAGE电泳上样缓冲液中，100℃沸水煮10min。取出15μl上清液作15%印SDS-PAGE电泳，凝胶经考马斯亮蓝R250染色，脱色后观察，并在双薄层扫描仪(ShimadzaCS-930)上进行表达蛋白的含量测定。将凝胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜上，电压40V，6h。加入HPV16E6抗体ZY96A和羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，经DNA显色。
2结果
2.1宫颈癌组织中HPV16的检出提取宫颈癌组织中DNA，用HPV16型特异性引物PCR检测，筛选含HPV16的DNA标本，扩增片段490bp，见图1。
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图1PCR检测宫颈痼组织中HPV16的序列
1：分子量标记pBR332/HinfI2：pHPV16阳性对照3，4：含HPV16的宫颈癌组织
Fig.1PCRdetectivepattetnsofHPV16sequencefromcervicalcancer
1:molecularmarkerpBR322/HinfI2:positivecontrolofpoasmidpHPV163,4:cervicalCancerwithHPV16
2.2宫颈癌组织中HPV16E6基因的扩增从含HPV16DNA的宫颈癌组织标本中，采用引物P1、P2扩增出HPV16E6片段，长约600bp，含HPV16E6完整的开放读码框，见图2。
图2PCR扩增HPV16E6基因的图谱
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1：分子量标记pBR322/HinfI2：pHPV16阳性对照3：阴性对照4：含HPV16E6的宫颈癌组织
Fig.2PCRamplificationpatternsofHPV16E6gene
1:molecularmarkerpBR322/HinfI2:positivecontrolofplasmidpHPV163:negativecontrol4:cervicalcancerwithHPV16E6
2.3HPV16融合蛋白在大肠杆菌中表达与测定HPV16E6基因克隆于表达质粒pGEMEX-1中，经BamHI酶切可见4000bp和600bp的两条带，分别为载体和外源基因，见图3。在T7启动子指导下经IPTG诱导表达为融合蛋白，同时以各种阴性大肠杆菌蛋白作对照。在电泳图谱及免疫印迹检测结果可见在分子量约45KD处有比对照多出一条特异性蛋白带，见图4。T7融合蛋白N末端长约26KD，加上C末端HPV16E619KD，推算该分子量为45KD的蛋白条带为T7-HPV16E6的融合蛋白。凝胶经双薄层扫描仪扫描，诱导的融合蛋白占总体蛋白的25%。
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图3重组质粒pGEMEX-E6的酶切图谱
1：分子量标DNA/BamHI2：载体pGEMEX-1/BamHI3：pGEMEX-E6/BamHI
Fig.3EnzymedigestionpatternsofrecombinantplasmidpGEMEX-E6
1:molecularmarkerDNA/BamHI2:VectorpGEMEX-1/BamHI3:pGEMEX-E6/BamHI
图4表达蛋白的SDS-PAGE分析
1：标准蛋白2，4，6：JM109(DE3)总蛋白3，5，7：含pG-16E6的JM109(DE3)总蛋白
Fig.4SDS-PAGEanalysisofexpressionproducts
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1:Markerprotean2,4,6:TotalproteinofJM109(DE3)3,5,7:TotalproteinofinducedJM109(DE3)withpG-16E6
3讨论
目前，对HPV16E6的基因克隆多采用标准HPV16序列的质粒为模板，缺乏对野生株HPV16序列来源的E6抗原特性的研究。我们从宫颈癌组织DNA中扩增出HPV16E6片段，采用热启动方法，可有效地减少非特异性DNA条带的产生。
为了使HPV16E6基因高效表达，我们使外源基因以胞浆内融合蛋白的形式，即氨基端是原核序列，羧基端是外源HPV16E6序列行诱导表达，表达蛋白占总体蛋白的25%，比国内学者[3]所制备的HPV16E6非融合蛋白表达量(20%)稍高。本研究选用的pGEMEX-1载体，具有T7强启动子，清除了外源基因起始信号ATG周围核酸序列对其表达水平的影响，并且E6基因不含有大肠杆菌JM109(DE3)的稀有密码子，从而使E6获得了高效表达。同时该融合蛋白有可能减少表达蛋白对宿主细胞的毒性，这都有利于外源蛋白在大肠杆菌中的表达[4]。
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机体HPV16E6抗体阳性率与HPV16病毒感染的阳性率相关，是HPV16相关性宫颈痛发生的标记之一。研制HPV16E6表达蛋白，作为检测HPV相关肿瘤抗体的抗原，将为本地区HPV16感染的流行病学调查和血清学诊断提供实验基础。
基金项目：山东省卫生厅资助课题
参考文献：
[1]Seedorf K. Human papillomavirus type 16 DNA sequence [J].J Virol, 1985,145(2):181
[2]栾怡，于修平，赵蔚明，等.人乳头瘤病毒16型致癌基因的克隆及其鉴定[J].山东医科大学学报，1997，35(1)：15
[3]桂长云，宋国云，李昆，等.人乳头瘤病毒16型E6基因表产物单克隆抗体的制备研究[J].中国医学科学院学报，1994，16(4)：290
[4]龙建银，外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，1997，24(2)：126
收稿日期：1999-01-28, http://www.100md.com