FK-506抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的研究
作者:吕岚 张文华 孙旭光
单位:吕岚(100730 首都医科大学附属北京同仁医院眼科);张文华 孙旭光(北京市眼科研究所)
关键词:大鼠;角膜移植;穿透性;移植物抗宿主反应;FK-506
中华眼科杂志990108 【摘要】 目的 建立近交系大鼠穿透性角膜移植动物模型,观察结膜下注射FK-506对角膜移植免疫排斥反应的抑制作用。方法 将近交系Lou大鼠28只作受体,14只F344大鼠作供体,分为3组,术后结膜下分别按每公斤体重注射0.1 mg FK-506、3 mg CsA及生理盐水,共2周。对角膜植片进行临床观察,以混浊、水肿和新生血管3项指标作为临床评估标准。结果 3组角膜植片的存活时间分别为(22.1±5.17)、(18.4±1.4)及(12.1±2.13)天,三者间差异有显著性(P<0.01)。结论 FK-506能显著延长大鼠角膜植片的存活时间,是一种有效的新型免疫抑制剂。
, 百拇医药
Experimental studies on the effect of the immunosuppressant FK-506
on penetrating keratoplasty rejection model in rats
L Lan*, ZHANG Wenhua, SUN Xuguang.
*Department of Ophthalmology, Affiliated Tong Ren Hospital,Capital Medical University, Beijing 100730
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the immunosuppressive effects of FK-506 on allogeneic transplantation in a rat model. Methods Inbred strain Lou rats were used as recipients, and F344 rats were used as donors. Subconjunctival injection of FK-506 0.1 mg/kg and cyclosporine A (CsA) 3 mg/kg were administered respectively for 2 weeks, and the grafts were inspected by clinical evaluation. Results The group receiving FK-506 had a significant delay in allograft rejection with mean survival time (22.1±5.17) days vs. (18.4±1.4) days for the CsA group and (12.1±2.13) days for the control group (P<0.01). Conclusion It is indicated that FK-506 would be a useful drug to suppress corneal graft rejection.
, http://www.100md.com
【Key words】 Rats Keratoplasty, penetrating Graft vs host reaction FK-506
免疫排斥反应是导致角膜移植手术失败的首要原因[1],应用免疫抑制剂是其主要的治疗方法,皮质类固醇是较常用的药物[2],但其治疗效果却不尽如人意,对于高危患者,激素治疗常常无效。近年来应用环胞霉素A(cyclosporine A,CsA)使角膜移植的预后有所改观,但排斥反应仍有发生[3]。因此,新型高效免疫抑制剂的研究具有重要意义。
FK-506是一种新型免疫抑制剂,其免疫抑制作用强于CsA[4,5]。我们应用大鼠建立穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty,PKP)动物模型,研究FK-506对角膜移植免疫排斥反应的抑制作用。
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材料和方法
一、实验动物
选用近交系大鼠(Lou,RT1U)28只作受体,与其主要组织相容性系统完全不同的另一近交系大鼠(F344,RT1V)14只作供体。供、受体均为雌性,体重150~200 g,年龄2~3个月。受体动物右眼接受角膜移植,供体双眼取材后处死。实验动物购自中国医学科学院动物研究所。
二、手术方法
参照Williams等[6]方法,术前15分钟以1%阿托品滴眼液和美多丽-P(0.5%托品酰胺,0.5%盐酸新福林)散瞳,腹腔内注射2.5%硫贲妥钠10~15 mg/kg麻醉。手术在显微镜下进行。首先于供体角膜钻取直径3.5 mm植片,于受体右眼行PKP,用直径3.0 mm环钻钻除中央区角膜,将植片置于植床,以10-0尼龙线间断缝合8针,线结不埋藏。术毕散瞳,结膜下注射庆大霉素2 000 U,睑缘缝合。
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三、药品
FK-506结晶系日本Fujisawa医药公司惠赠,使用前溶入生理盐水中制成混悬液。CsA系瑞士Sandoz药厂产品,使用前用生理盐水稀释。
四、治疗方案
FK-506组10只大鼠,自手术当天开始连续右眼结膜下注射0.1 mg/kg FK-506,共2周;CsA组8只大鼠作为阳性对照,结膜下注射3 mg/kg CsA,用法同前;阴性对照组10只大鼠,结膜下注射生理盐水。所有动物术后均连续结膜下注射庆大霉素2天,0.25%氯霉素及美多丽-P滴眼,每天1次,共1周。
五、临床观察
自术后第1天开始,Lou大鼠每天经乙醚麻醉后在裂隙灯下观察直至排斥反应发生。以后每周观察2或3次,连续观察2~4周。同时观察其角膜植片,并对角膜混浊、水肿及新生血管3项指标进行评分,评分参照Holland等[7]方法,3项评分之和为当日排斥反应指数(rejection index,RI),当RI≥6时,视为排斥反应发生。术后有严重前房出血、虹膜广泛前粘连、伤口裂开及植片感染的大鼠均在本研究之外。
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六、实验结果的统计学方法
本文数据采用计算机Systat统计软件进行方差分析,对方差不齐者先用以10为底的对数进行转换后再行方差分析。
结果
一、植片存活时间
FK-506、CsA和对照组大鼠角膜植片存活时间分别为(22.1±5.17)、(18.4±1.41)和(12.1±2.13)天。统计结果表明,FK-506和CsA均能明显延长角膜植片的存活时间,与对照组相比差异有显著性(P<0.01),且FK-506的作用优于CsA(P<0.01)。
二、植片各参数的改变
3组大鼠角膜植片在用药期间RI、混浊、水肿及新生血管指数的改变见表1。结果表明,对照组RI、混浊、水肿3项指标均明显高于FK-506和CsA组(P<0.05),但FK-506、CsA 2组间差异无显著性;3组间新生血管指数差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
表1 各组大鼠角膜植片在术后用药期间
植片情况的比较 组别
鼠数
RI
(±s)
混浊
(±s)
水肿
, http://www.100md.com
(±s)
新生血管
(±s)
FK-506
10
2.043±1.265
0.479±0.267
0.629±0.19
, http://www.100md.com
1.057±0.849
CsA
8
2.43 ±1.299
0.646±0.332
0.680±0.208
1.081±0.847
对照
10
3.579±1.91
1.057±0.625
1.421±0.444
, 百拇医药
1.171±0.902
P值
<0.05
<0.05
<0.05
>0.05
3组大鼠角膜植片的RI及其中每项指标评分的动态改变见图1~4。对照组所有指标评分均呈持续上升,而两用药组的RI、混浊及水肿3项指标评分在用药期间均明显低于对照组,且FK-506组低于CsA组,二者间差异无显著性。停药后各项指标评分逐渐上升,3组动物植片新生血管的发生发展趋势基本一致。新生血管一般于术后4~6天出现,约10~12天达角膜伤口,并很快进入植片周边,有些大鼠的新生血管最终可达角膜中央,而另一部分大鼠的新生血管则表现出退行性变的趋势。
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图1 术后鼠角膜植片排斥指数的动态变化
图2 术后鼠角膜植片混浊指数的动态变化
图3 术后鼠角膜植片水肿指数的动态变化
图4 术后鼠角膜植片新生血管指数的动态变化
, 百拇医药
讨论
一、大鼠是角膜移植免疫学研究的理想动物模型
角膜移植免疫学研究中,大鼠已逐渐取代传统的兔模型。因为兔的免疫系统背景不清,供、受体间的组织相容性程度不能控制,同时也缺乏免疫学研究中必需的抗兔细胞的单克隆抗体;而近交系大鼠的免疫学背景、组织相容性系统明确,供、受体间的组织相容性程度可根据需要进行选择,抗大鼠细胞及免疫分子的单克隆抗体丰富,且角膜组织上的主要组织相容性抗原的表达与人类角膜一致[8],是角膜移植免疫学研究的理想动物模型。本研究在供、受体间主要组织相容性抗原完全不同[8]的大鼠中建立PKP动物模型,对照组术后平均12天100%发生排斥反应,表明此动物模型利于角膜移植的免疫学研究和免疫抑制剂治疗的研究。
二、FK-506可抑制角膜移植免疫排斥反应
, 百拇医药
FK-506是从Tsukubaensis链霉菌发酵产物中提取的大环内酯类抗生素,具有显著的免疫抑制功能,可抑制机体的细胞和体液免疫过程,在抑制多种器官同种异体移植术后排斥反应方面,也显示了高度的免疫抑制作用,并明显强于CsA[4,5]。本研究中FK-506的用量为CsA的1/30,但其作用却较CsA强。
FK-506与CsA的免疫抑制机制相似,主要是通过与T细胞表面相应的结合蛋白(FK-506结合蛋白和环亲合素)结合,作用于细胞内的钙和钙调蛋白依赖性的蛋白磷酯酶,使T细胞活化核因子的核内转移受到抑制,从而抑制转录IL-2、IL-2R的基因表达,使T细胞的增殖和免疫活性受到抑制[4]。IL-2是由活性T细胞合成分泌、具有T细胞生长因子特点的细胞因子,活性T细胞分泌IL-2,同时表达IL-2R,IL-2与IL-2R的结合进一步促进了T细胞的增殖分化,所以IL-2和IL-2R是移植排斥免疫抑制疗法的重要靶分子[4]。
, 百拇医药
我们应用大鼠模型研究FK-506对角膜移植排斥反应的抑制作用。FK-506和CsA组在用药期间均无排斥反应发生,植片的混浊和水肿程度明显低于对照组,术后第2周末的植片存活率均为100%。但停药后两组角膜植片的混浊、水肿逐渐加重,并分别于停药后4~21天(平均存活22.1天)和2~6天(平均存活18.4天)发生排斥反应。而术后对照组角膜植片的各项评分均持续上升,角膜植片的混浊、水肿逐渐加重,术后第2周末的植片存活率仅为10%。作者在动物模型临床观察的基础上,应用免疫组化的方法,对角膜移植排斥反应进行免疫病理学研究,发现FK-506可抑制PKP术后多种免疫细胞的浸润和免疫分子的表达[9]。
本实验结果显示,FK-506可明显延长大鼠角膜植片的存活时间,且作用优于CsA。但FK-506并不能使机体产生免疫耐受,停药后排斥反应仍可发生。此外,无论是FK-506或CsA,均不能抑制新生血管的发生和发展,这可能与新生血管的生成因子有关,对于这些因子的作用机制还有待于进一步研究。本实验结果与文献报道相似[10,11],Nishi等[10]采用F344大鼠对Lewis大鼠PKP模型,术后腹腔内分别注射0.3、1.0及3.0 mg/kg FK-506,共2周,对照组动物植片于3周内全部排斥,而FK-506组角膜植片则可存活4~8周。
, 百拇医药
参考文献
[1] Williams KA, Muehlberg SM, Lewis RF, et al. How successful is corneal transplantation? a report from the Australian corneal graft register. Eye,1995,9:219-227.
[2] Rinne JR, Stulting RD. Current practices in the prevention and treatment of corneal graft rejection.Cornea,1992,11:326-328.
[3] Hill JC. The use of cyclosporine in high-risk keratoplasty. Am J Ophthalmol, 1989,107:506-510.
, 百拇医药
[4] Morris R. Modes of action of FK506, cyclosporine A, and rapamycin. Transplant Proc, 1994,26:3272-3275.
[5] Fung JJ, Starzl TE. FK-506 in solid organ transplantation. Transplant Proc, 1994,26:3017-3020.
[6] Williams KA, Coster DJ. Penetrating corneal transplantation in the inbred rat: a new model. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1985,26:23-30.
[7] Holland EJ, Chan CC,Wetzig RP, et al. Clinical and immunohistologic studies of corneal rejection in the rat penetrating keratoplasty model. Cornea,1991,10:374-380.
, http://www.100md.com
[8] Katami M. Corneal transplantation-immunologically privileged status. Eye, 1991,5:528-548.
[9] 吕岚, 张文华. FK-506抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的免疫病理学研究. 中华眼科杂志, 1998, 34:21-24.
[10] Nishi M, Herbort CP, Matsubara M, et al. Effects of the immunosuppressant FK506 on a penetrating keratoplasty rejection model in the rat.Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:2477-2486.
[11] Dickey JB, Cassidy EM, Bouchard CS. Periocular FK-506 delays allograft rejection in rat penetrating keratoplasty. Cornea, 1993,12:204-207.
(收稿:1997-09-30 修回:1998-09-05), http://www.100md.com
单位:吕岚(100730 首都医科大学附属北京同仁医院眼科);张文华 孙旭光(北京市眼科研究所)
关键词:大鼠;角膜移植;穿透性;移植物抗宿主反应;FK-506
中华眼科杂志990108 【摘要】 目的 建立近交系大鼠穿透性角膜移植动物模型,观察结膜下注射FK-506对角膜移植免疫排斥反应的抑制作用。方法 将近交系Lou大鼠28只作受体,14只F344大鼠作供体,分为3组,术后结膜下分别按每公斤体重注射0.1 mg FK-506、3 mg CsA及生理盐水,共2周。对角膜植片进行临床观察,以混浊、水肿和新生血管3项指标作为临床评估标准。结果 3组角膜植片的存活时间分别为(22.1±5.17)、(18.4±1.4)及(12.1±2.13)天,三者间差异有显著性(P<0.01)。结论 FK-506能显著延长大鼠角膜植片的存活时间,是一种有效的新型免疫抑制剂。
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Experimental studies on the effect of the immunosuppressant FK-506
on penetrating keratoplasty rejection model in rats
L Lan*, ZHANG Wenhua, SUN Xuguang.
*Department of Ophthalmology, Affiliated Tong Ren Hospital,Capital Medical University, Beijing 100730
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the immunosuppressive effects of FK-506 on allogeneic transplantation in a rat model. Methods Inbred strain Lou rats were used as recipients, and F344 rats were used as donors. Subconjunctival injection of FK-506 0.1 mg/kg and cyclosporine A (CsA) 3 mg/kg were administered respectively for 2 weeks, and the grafts were inspected by clinical evaluation. Results The group receiving FK-506 had a significant delay in allograft rejection with mean survival time (22.1±5.17) days vs. (18.4±1.4) days for the CsA group and (12.1±2.13) days for the control group (P<0.01). Conclusion It is indicated that FK-506 would be a useful drug to suppress corneal graft rejection.
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【Key words】 Rats Keratoplasty, penetrating Graft vs host reaction FK-506
免疫排斥反应是导致角膜移植手术失败的首要原因[1],应用免疫抑制剂是其主要的治疗方法,皮质类固醇是较常用的药物[2],但其治疗效果却不尽如人意,对于高危患者,激素治疗常常无效。近年来应用环胞霉素A(cyclosporine A,CsA)使角膜移植的预后有所改观,但排斥反应仍有发生[3]。因此,新型高效免疫抑制剂的研究具有重要意义。
FK-506是一种新型免疫抑制剂,其免疫抑制作用强于CsA[4,5]。我们应用大鼠建立穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty,PKP)动物模型,研究FK-506对角膜移植免疫排斥反应的抑制作用。
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材料和方法
一、实验动物
选用近交系大鼠(Lou,RT1U)28只作受体,与其主要组织相容性系统完全不同的另一近交系大鼠(F344,RT1V)14只作供体。供、受体均为雌性,体重150~200 g,年龄2~3个月。受体动物右眼接受角膜移植,供体双眼取材后处死。实验动物购自中国医学科学院动物研究所。
二、手术方法
参照Williams等[6]方法,术前15分钟以1%阿托品滴眼液和美多丽-P(0.5%托品酰胺,0.5%盐酸新福林)散瞳,腹腔内注射2.5%硫贲妥钠10~15 mg/kg麻醉。手术在显微镜下进行。首先于供体角膜钻取直径3.5 mm植片,于受体右眼行PKP,用直径3.0 mm环钻钻除中央区角膜,将植片置于植床,以10-0尼龙线间断缝合8针,线结不埋藏。术毕散瞳,结膜下注射庆大霉素2 000 U,睑缘缝合。
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三、药品
FK-506结晶系日本Fujisawa医药公司惠赠,使用前溶入生理盐水中制成混悬液。CsA系瑞士Sandoz药厂产品,使用前用生理盐水稀释。
四、治疗方案
FK-506组10只大鼠,自手术当天开始连续右眼结膜下注射0.1 mg/kg FK-506,共2周;CsA组8只大鼠作为阳性对照,结膜下注射3 mg/kg CsA,用法同前;阴性对照组10只大鼠,结膜下注射生理盐水。所有动物术后均连续结膜下注射庆大霉素2天,0.25%氯霉素及美多丽-P滴眼,每天1次,共1周。
五、临床观察
自术后第1天开始,Lou大鼠每天经乙醚麻醉后在裂隙灯下观察直至排斥反应发生。以后每周观察2或3次,连续观察2~4周。同时观察其角膜植片,并对角膜混浊、水肿及新生血管3项指标进行评分,评分参照Holland等[7]方法,3项评分之和为当日排斥反应指数(rejection index,RI),当RI≥6时,视为排斥反应发生。术后有严重前房出血、虹膜广泛前粘连、伤口裂开及植片感染的大鼠均在本研究之外。
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六、实验结果的统计学方法
本文数据采用计算机Systat统计软件进行方差分析,对方差不齐者先用以10为底的对数进行转换后再行方差分析。
结果
一、植片存活时间
FK-506、CsA和对照组大鼠角膜植片存活时间分别为(22.1±5.17)、(18.4±1.41)和(12.1±2.13)天。统计结果表明,FK-506和CsA均能明显延长角膜植片的存活时间,与对照组相比差异有显著性(P<0.01),且FK-506的作用优于CsA(P<0.01)。
二、植片各参数的改变
3组大鼠角膜植片在用药期间RI、混浊、水肿及新生血管指数的改变见表1。结果表明,对照组RI、混浊、水肿3项指标均明显高于FK-506和CsA组(P<0.05),但FK-506、CsA 2组间差异无显著性;3组间新生血管指数差异无显著性(P>0.05)。
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表1 各组大鼠角膜植片在术后用药期间
植片情况的比较 组别
鼠数
RI
(±s)
混浊
(±s)
水肿
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(±s)
新生血管
(±s)
FK-506
10
2.043±1.265
0.479±0.267
0.629±0.19
, http://www.100md.com
1.057±0.849
CsA
8
2.43 ±1.299
0.646±0.332
0.680±0.208
1.081±0.847
对照
10
3.579±1.91
1.057±0.625
1.421±0.444
, 百拇医药
1.171±0.902
P值
<0.05
<0.05
<0.05
>0.05
3组大鼠角膜植片的RI及其中每项指标评分的动态改变见图1~4。对照组所有指标评分均呈持续上升,而两用药组的RI、混浊及水肿3项指标评分在用药期间均明显低于对照组,且FK-506组低于CsA组,二者间差异无显著性。停药后各项指标评分逐渐上升,3组动物植片新生血管的发生发展趋势基本一致。新生血管一般于术后4~6天出现,约10~12天达角膜伤口,并很快进入植片周边,有些大鼠的新生血管最终可达角膜中央,而另一部分大鼠的新生血管则表现出退行性变的趋势。
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图1 术后鼠角膜植片排斥指数的动态变化
图2 术后鼠角膜植片混浊指数的动态变化
图3 术后鼠角膜植片水肿指数的动态变化
图4 术后鼠角膜植片新生血管指数的动态变化
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讨论
一、大鼠是角膜移植免疫学研究的理想动物模型
角膜移植免疫学研究中,大鼠已逐渐取代传统的兔模型。因为兔的免疫系统背景不清,供、受体间的组织相容性程度不能控制,同时也缺乏免疫学研究中必需的抗兔细胞的单克隆抗体;而近交系大鼠的免疫学背景、组织相容性系统明确,供、受体间的组织相容性程度可根据需要进行选择,抗大鼠细胞及免疫分子的单克隆抗体丰富,且角膜组织上的主要组织相容性抗原的表达与人类角膜一致[8],是角膜移植免疫学研究的理想动物模型。本研究在供、受体间主要组织相容性抗原完全不同[8]的大鼠中建立PKP动物模型,对照组术后平均12天100%发生排斥反应,表明此动物模型利于角膜移植的免疫学研究和免疫抑制剂治疗的研究。
二、FK-506可抑制角膜移植免疫排斥反应
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FK-506是从Tsukubaensis链霉菌发酵产物中提取的大环内酯类抗生素,具有显著的免疫抑制功能,可抑制机体的细胞和体液免疫过程,在抑制多种器官同种异体移植术后排斥反应方面,也显示了高度的免疫抑制作用,并明显强于CsA[4,5]。本研究中FK-506的用量为CsA的1/30,但其作用却较CsA强。
FK-506与CsA的免疫抑制机制相似,主要是通过与T细胞表面相应的结合蛋白(FK-506结合蛋白和环亲合素)结合,作用于细胞内的钙和钙调蛋白依赖性的蛋白磷酯酶,使T细胞活化核因子的核内转移受到抑制,从而抑制转录IL-2、IL-2R的基因表达,使T细胞的增殖和免疫活性受到抑制[4]。IL-2是由活性T细胞合成分泌、具有T细胞生长因子特点的细胞因子,活性T细胞分泌IL-2,同时表达IL-2R,IL-2与IL-2R的结合进一步促进了T细胞的增殖分化,所以IL-2和IL-2R是移植排斥免疫抑制疗法的重要靶分子[4]。
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我们应用大鼠模型研究FK-506对角膜移植排斥反应的抑制作用。FK-506和CsA组在用药期间均无排斥反应发生,植片的混浊和水肿程度明显低于对照组,术后第2周末的植片存活率均为100%。但停药后两组角膜植片的混浊、水肿逐渐加重,并分别于停药后4~21天(平均存活22.1天)和2~6天(平均存活18.4天)发生排斥反应。而术后对照组角膜植片的各项评分均持续上升,角膜植片的混浊、水肿逐渐加重,术后第2周末的植片存活率仅为10%。作者在动物模型临床观察的基础上,应用免疫组化的方法,对角膜移植排斥反应进行免疫病理学研究,发现FK-506可抑制PKP术后多种免疫细胞的浸润和免疫分子的表达[9]。
本实验结果显示,FK-506可明显延长大鼠角膜植片的存活时间,且作用优于CsA。但FK-506并不能使机体产生免疫耐受,停药后排斥反应仍可发生。此外,无论是FK-506或CsA,均不能抑制新生血管的发生和发展,这可能与新生血管的生成因子有关,对于这些因子的作用机制还有待于进一步研究。本实验结果与文献报道相似[10,11],Nishi等[10]采用F344大鼠对Lewis大鼠PKP模型,术后腹腔内分别注射0.3、1.0及3.0 mg/kg FK-506,共2周,对照组动物植片于3周内全部排斥,而FK-506组角膜植片则可存活4~8周。
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参考文献
[1] Williams KA, Muehlberg SM, Lewis RF, et al. How successful is corneal transplantation? a report from the Australian corneal graft register. Eye,1995,9:219-227.
[2] Rinne JR, Stulting RD. Current practices in the prevention and treatment of corneal graft rejection.Cornea,1992,11:326-328.
[3] Hill JC. The use of cyclosporine in high-risk keratoplasty. Am J Ophthalmol, 1989,107:506-510.
, 百拇医药
[4] Morris R. Modes of action of FK506, cyclosporine A, and rapamycin. Transplant Proc, 1994,26:3272-3275.
[5] Fung JJ, Starzl TE. FK-506 in solid organ transplantation. Transplant Proc, 1994,26:3017-3020.
[6] Williams KA, Coster DJ. Penetrating corneal transplantation in the inbred rat: a new model. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1985,26:23-30.
[7] Holland EJ, Chan CC,Wetzig RP, et al. Clinical and immunohistologic studies of corneal rejection in the rat penetrating keratoplasty model. Cornea,1991,10:374-380.
, http://www.100md.com
[8] Katami M. Corneal transplantation-immunologically privileged status. Eye, 1991,5:528-548.
[9] 吕岚, 张文华. FK-506抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的免疫病理学研究. 中华眼科杂志, 1998, 34:21-24.
[10] Nishi M, Herbort CP, Matsubara M, et al. Effects of the immunosuppressant FK506 on a penetrating keratoplasty rejection model in the rat.Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:2477-2486.
[11] Dickey JB, Cassidy EM, Bouchard CS. Periocular FK-506 delays allograft rejection in rat penetrating keratoplasty. Cornea, 1993,12:204-207.
(收稿:1997-09-30 修回:1998-09-05), http://www.100md.com