应用PRPL串联启动子表达HIV-2 gag蛋白
作者：王秀清 金宁一 田梅 李体远 李钟洙 郭志儒 李萍 赵丽娟 殷震
单位：金宁一(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)；郭志儒(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)；李萍(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)；赵丽娟(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)
关键词：HIV-2；蛋白；表达
中国免疫学杂志000603 摘 要 目的：探讨HIV-2 gag 非融合蛋白的表达。方法：应用DNA重组技术，将HIV gag基因全序列(gag)和部分(gag’)cDNA片段克隆到pBV220载体PRPL串联启动子下游，构建成HIV-2 gag重组表达载体pBV-gag和pBV-gag’，在大肠杆菌中表达。结果：SDS-PAGE显示pBV-gag’在21 kD处可见一明显的额外蛋白带，经薄层扫描分析占菌体总蛋白的6.1%，蛋白印迹结果证明，表达出的特异蛋白分子量pBV-gag为57 kD和47 kD；pBV-gag’为47 kD和21 kD。经提取包涵体证明，表达的蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。结论：HIV-2 gag非融合蛋白可在大肠杆菌中获得表达并主要以包涵体形式存在。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R512.91
Expression of HIV-2 gag gene in E.coli with a plasmid containing PRPL promoter
WANG Xiu-Qing,JIN Ning-Yi,TIAN Mei et al
(The Military Institute,Changchun University of Agriculture and Animal Sciences ,Changchun 130062)
Abstract Objective:In order to study the expression of HIV-2 gag gene in E.coli.Methods:Construction of recombinant expression plasmid by digesting the plasmid vector pCRTMII containing HIV-2 gag gene with BgⅡ.And the fragments of gag containing full longth of HIV-2 gag gene and gag'containing HIV-2 gag gene truncated at C-terminus were obtained and inserted downstram of PRPL promoter on a plasmid pBV220,and then expressed in E.coli DH5α.Results: The molecular weight of expressed proteins were 57 kD and 47 kD (gag),47 kD and 21 kD(gag') respectively.Only gag'showed additional band at 21 kD on SDS-PAGE.Densitometric analysis showed that the content of 6.1%in total E.Coli proteins.Western blot result showed that however,all calculated molecular weight of gag and gag'proteins were specific reactions with positive sera of HIV-2 patients.The expression products of gag and gag' gene were presented in inclusion bodies.Conclusion:HIV-2 gag genes expressed in E.Coli DH5α and mainly presented in inclusion bodies.
, 百拇医药
Key words HIV-2 Protein Expression
HIV-2 gag前体蛋白分子量为57 kD，在病毒粒子成熟过程中，gag蛋白随之被病毒自身蛋白酶切割成4种蛋白，从氨基端到羧基端依次为基质蛋白(p16)，衣壳蛋白(p26)，核衣壳蛋白(p9)和可能与病毒辅助蛋白R(VPr)掺入病毒粒子有关的p6。gag蛋白比较保守，具有自我装配功能，并能刺激机体产生体液和细胞免疫[1，2]，是AIDS疫苗研究的重要组分之一。
目前，在大肠杆菌中表达HIV-2 gag蛋白特别是非融合蛋白的表达国内未见报道。本实验通过构建HIV-2 gag基因全长和去掉羧基端286 bp的部分gag cDNA重组表达载体，在大肠杆菌中高效表达HIV-2 gag非融合蛋白，为HIV疫苗和诊断试剂的研制提供有益资料，也为HIV-2 gag蛋白在真核细胞中表达奠定实验基础。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 质粒和菌株：E.coli DH5α和pCRTMII本室保存，pBV220质粒由张智清教授惠赠。工具酶：实验所用工具酶购自华美生物工程公司和Promega公司。生化试剂：溴化己锭(EB)和过硫酸铵等购自华美生物工程公司；异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，β-巯基乙醇，N，N，N’，N’四甲基乙二铵(TEMED)，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)等为Sigma产品。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌感受态细胞制备、质粒提取、转化和酶切鉴定 参照文献[3]操作。
1.2.2 目的DNA片段的回收 将含HIV-2 gag的pCRTMII质粒经内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，冻融法回收DNA片段[4]。
1.2.3 外源蛋白的诱导表达 按文献[4]操作。
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1.2.4 SDS-PAGE 以含质粒pBV220的对照菌体和标准蛋白作对照，分别取适量样品加等量2倍上样缓冲液，用微量移液器加入加样槽内，以8 V/cm电压电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，以15 V/cm电泳，当溴酚蓝泳至分离胶底部后，取出凝胶进行染色或蛋白印迹。
1.2.5 Western blot 参照文献[5]操作。
2 结果
2.1 重组表达质粒的构建 质粒pCRTMII中HIV-2 gag基因两侧为BgⅡ位点，而pBV220质粒中含有BamHI等多克隆位点，故用BgⅡ内切酶调出gag全部(nt546～nt2114)及gag部分序列(nt546～nt1 828)，分别插入pBV220的BamHI位点，构建了2个重组表达质粒，分别命名为pBV-gag(5 234 bp)和pBV-gag’(4 948 bp)。
, 百拇医药
2.2 重组质粒的酶切鉴定 用EcoRI和EcoRV分别消化重组质粒pBV-gag和pBV-gag'，分别得到0.54 kb+4.686 kb和0.54 kb+4.408 kb(正向插入)的酶切溶液，进行琼脂糖凝胶电泳后照相。
2.3 gag蛋白的诱导表达及检测 蛋白印迹结果表明，在21、47和57 kD处均可见一特异的与HIV-2患者血清反应的显色条带。而SDS-PAGE经考马斯亮蓝染色及脱色后，只在pBV-gag’的21 kD处有一明显的额外蛋白带，经薄层扫描表达量占菌体总蛋白的6.1%，经提取包涵体证明，表达的蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中(图1)。
图1 pBV-gag'和pBV-gag在DH5α中的表达结果
Fig.1 Expression result of pBV-gag’ and pBV-gag in DH5α(Western blot)
, 百拇医药
Note:1.supernatant of DH5α with pBV-gag';2.supernatant of DH5α with pBV-gag;3.control of DH5α with pBV220;4.pellet of DH5α with pBV-gag；
5.pellet of DH5α with pBV-gag’
3 讨论
λ噬菌体的PRPL启动子是原核表达系统常用的启动子，并受λ噬菌体CI基因的负调控，CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在28℃～32℃培养时，CI产生抑制作用，在温度升至42℃时，CI被破坏，解除对启动子的封闭，使PRPL开始转录。应用PR和PL串联启动子的原核高效表达载体已成功地表达了人白细胞介素2、乙肝病毒PerS2单链抗体、乙肝病毒e抗原、人λ干扰素和人ωI型干扰素等，表达量分别占菌体总蛋白的4%～20%[7-10]。
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本文也应用了含PRPL的pBV220表达载体成功地表达了HIV-2 gag全部和部分蛋白，表达量为6.1%。李伍举等运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了在pBV220载体中32个外源基因表达水平为0～71%不等[11]。上述结果表明，外源基因在大肠杆菌中的表达水平除与启动子、SD序列及SD序列与ATG之间的距离等有关外，还受目的基因自身结构、长度和目的基因对宿主菌的毒性作用等因素的影响。本实验结果显示，HIV-2 gag蛋白基因在大肠杆菌中表达的分子量大小与推算的分子量大小一致，且在47 kD(gag)和21 kD(gag')处也出现了特异的蛋白带，说明有翻译的提前终止或是表达产物的部分降解所致，这可能与HIV-2 gag基因的自身结构有关[12]。
本课题为国家自然科学基金资助(批准号：39770661)
作者简介：王秀清，女，39岁，肿瘤学专业博士后研究人员；
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金宁一，男，43岁，教授，主要研究分子病毒学
殷震(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)
王秀清(暨南大学医学院附二院(深圳市人民医院)肿瘤研究所研究室，深圳市东门北路3号，深圳 518020)
田梅(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)
李体远(暨南大学医学院附二院(深圳市人民医院)中心实验室，深圳 518020)
李钟洙(白求恩医科大学第二临床学院皮肤科，长春 130041)
参考文献
1，Luo L,Li Y,Dales S et al.Mapping of functional domains for HIV-2 gag assembly into virus-like particles.Virology,1994;205(2)：496
, 百拇医药
2，Griffiths J C,Harris S J,Layton et al.Hybrid human immunodeficiency virus gag particles as an antigen carrier system:lnduction of cytotoxic T-cell and humoral responses by a gag:V3 fusion.Journal of Virology,1993;67(6):3191
3，Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆操作指南.第2版.北京：科学出版社，1992:16-50
4，张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990；6(2)：111
5，王秀清，金宁一，田 梅 et al.HIV-2 env 基因在大肠杆菌和重组痘苗中的表达.中国兽医学报，1998；18(3)：216
, http://www.100md.com
6，张智清，徐大模，侯云德 et al.人白细胞介素-2 cDNA在大肠杆菌中的高效表达及纯化.病毒学报，1988；4(2)：165
7，程 云，汪力亚，李伯安 et al.HBV PreS2单链抗体基因在大肠杆菌中的克隆及初步表达.中华微生物学和免疫学杂志，1996；16(4)：236
8，曾蔚蓝，刘崇柏.乙型肝炎病毒e抗原在大肠杆菌中的表达.病毒学报，1991；7(4)：232
9，张智清，侯云德，李玉英et al.应用PRPL串联启动子和Clts857调控基因高效表达人γ干扰素.病毒学报，1988；4(2)：97
10，黎孟枫，曾 庆，周 圆 et al.人ω I型干扰素基因在大肠杆菌中的表达.病毒学报，1992；8(2)：184
11，李伍举，吴加金.pBV220载体中外源基因二级结构与表达水平关系.生物技术通讯，1996；7(4)：149
12，隋广超，胡美浩.影响大肠杆菌中外源基因表达的因素.生物化学与生物物理进展，1994；21(2)：128
收稿1999-01-22 修回1999-11-01, 百拇医药
单位：金宁一(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)；郭志儒(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)；李萍(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)；赵丽娟(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)
关键词：HIV-2；蛋白；表达
中国免疫学杂志000603 摘 要 目的：探讨HIV-2 gag 非融合蛋白的表达。方法：应用DNA重组技术，将HIV gag基因全序列(gag)和部分(gag’)cDNA片段克隆到pBV220载体PRPL串联启动子下游，构建成HIV-2 gag重组表达载体pBV-gag和pBV-gag’，在大肠杆菌中表达。结果：SDS-PAGE显示pBV-gag’在21 kD处可见一明显的额外蛋白带，经薄层扫描分析占菌体总蛋白的6.1%，蛋白印迹结果证明，表达出的特异蛋白分子量pBV-gag为57 kD和47 kD；pBV-gag’为47 kD和21 kD。经提取包涵体证明，表达的蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。结论：HIV-2 gag非融合蛋白可在大肠杆菌中获得表达并主要以包涵体形式存在。
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中国图书分类号 R512.91
Expression of HIV-2 gag gene in E.coli with a plasmid containing PRPL promoter
WANG Xiu-Qing,JIN Ning-Yi,TIAN Mei et al
(The Military Institute,Changchun University of Agriculture and Animal Sciences ,Changchun 130062)
Abstract Objective:In order to study the expression of HIV-2 gag gene in E.coli.Methods:Construction of recombinant expression plasmid by digesting the plasmid vector pCRTMII containing HIV-2 gag gene with BgⅡ.And the fragments of gag containing full longth of HIV-2 gag gene and gag'containing HIV-2 gag gene truncated at C-terminus were obtained and inserted downstram of PRPL promoter on a plasmid pBV220,and then expressed in E.coli DH5α.Results: The molecular weight of expressed proteins were 57 kD and 47 kD (gag),47 kD and 21 kD(gag') respectively.Only gag'showed additional band at 21 kD on SDS-PAGE.Densitometric analysis showed that the content of 6.1%in total E.Coli proteins.Western blot result showed that however,all calculated molecular weight of gag and gag'proteins were specific reactions with positive sera of HIV-2 patients.The expression products of gag and gag' gene were presented in inclusion bodies.Conclusion:HIV-2 gag genes expressed in E.Coli DH5α and mainly presented in inclusion bodies.
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Key words HIV-2 Protein Expression
HIV-2 gag前体蛋白分子量为57 kD，在病毒粒子成熟过程中，gag蛋白随之被病毒自身蛋白酶切割成4种蛋白，从氨基端到羧基端依次为基质蛋白(p16)，衣壳蛋白(p26)，核衣壳蛋白(p9)和可能与病毒辅助蛋白R(VPr)掺入病毒粒子有关的p6。gag蛋白比较保守，具有自我装配功能，并能刺激机体产生体液和细胞免疫[1，2]，是AIDS疫苗研究的重要组分之一。
目前，在大肠杆菌中表达HIV-2 gag蛋白特别是非融合蛋白的表达国内未见报道。本实验通过构建HIV-2 gag基因全长和去掉羧基端286 bp的部分gag cDNA重组表达载体，在大肠杆菌中高效表达HIV-2 gag非融合蛋白，为HIV疫苗和诊断试剂的研制提供有益资料，也为HIV-2 gag蛋白在真核细胞中表达奠定实验基础。
1 材料与方法
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1.1 材料 质粒和菌株：E.coli DH5α和pCRTMII本室保存，pBV220质粒由张智清教授惠赠。工具酶：实验所用工具酶购自华美生物工程公司和Promega公司。生化试剂：溴化己锭(EB)和过硫酸铵等购自华美生物工程公司；异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，β-巯基乙醇，N，N，N’，N’四甲基乙二铵(TEMED)，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)等为Sigma产品。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌感受态细胞制备、质粒提取、转化和酶切鉴定 参照文献[3]操作。
1.2.2 目的DNA片段的回收 将含HIV-2 gag的pCRTMII质粒经内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，冻融法回收DNA片段[4]。
1.2.3 外源蛋白的诱导表达 按文献[4]操作。
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1.2.4 SDS-PAGE 以含质粒pBV220的对照菌体和标准蛋白作对照，分别取适量样品加等量2倍上样缓冲液，用微量移液器加入加样槽内，以8 V/cm电压电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，以15 V/cm电泳，当溴酚蓝泳至分离胶底部后，取出凝胶进行染色或蛋白印迹。
1.2.5 Western blot 参照文献[5]操作。
2 结果
2.1 重组表达质粒的构建 质粒pCRTMII中HIV-2 gag基因两侧为BgⅡ位点，而pBV220质粒中含有BamHI等多克隆位点，故用BgⅡ内切酶调出gag全部(nt546～nt2114)及gag部分序列(nt546～nt1 828)，分别插入pBV220的BamHI位点，构建了2个重组表达质粒，分别命名为pBV-gag(5 234 bp)和pBV-gag’(4 948 bp)。
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2.2 重组质粒的酶切鉴定 用EcoRI和EcoRV分别消化重组质粒pBV-gag和pBV-gag'，分别得到0.54 kb+4.686 kb和0.54 kb+4.408 kb(正向插入)的酶切溶液，进行琼脂糖凝胶电泳后照相。
2.3 gag蛋白的诱导表达及检测 蛋白印迹结果表明，在21、47和57 kD处均可见一特异的与HIV-2患者血清反应的显色条带。而SDS-PAGE经考马斯亮蓝染色及脱色后，只在pBV-gag’的21 kD处有一明显的额外蛋白带，经薄层扫描表达量占菌体总蛋白的6.1%，经提取包涵体证明，表达的蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中(图1)。
图1 pBV-gag'和pBV-gag在DH5α中的表达结果
Fig.1 Expression result of pBV-gag’ and pBV-gag in DH5α(Western blot)
, 百拇医药
Note:1.supernatant of DH5α with pBV-gag';2.supernatant of DH5α with pBV-gag;3.control of DH5α with pBV220;4.pellet of DH5α with pBV-gag；
5.pellet of DH5α with pBV-gag’
3 讨论
λ噬菌体的PRPL启动子是原核表达系统常用的启动子，并受λ噬菌体CI基因的负调控，CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在28℃～32℃培养时，CI产生抑制作用，在温度升至42℃时，CI被破坏，解除对启动子的封闭，使PRPL开始转录。应用PR和PL串联启动子的原核高效表达载体已成功地表达了人白细胞介素2、乙肝病毒PerS2单链抗体、乙肝病毒e抗原、人λ干扰素和人ωI型干扰素等，表达量分别占菌体总蛋白的4%～20%[7-10]。
, http://www.100md.com
本文也应用了含PRPL的pBV220表达载体成功地表达了HIV-2 gag全部和部分蛋白，表达量为6.1%。李伍举等运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了在pBV220载体中32个外源基因表达水平为0～71%不等[11]。上述结果表明，外源基因在大肠杆菌中的表达水平除与启动子、SD序列及SD序列与ATG之间的距离等有关外，还受目的基因自身结构、长度和目的基因对宿主菌的毒性作用等因素的影响。本实验结果显示，HIV-2 gag蛋白基因在大肠杆菌中表达的分子量大小与推算的分子量大小一致，且在47 kD(gag)和21 kD(gag')处也出现了特异的蛋白带，说明有翻译的提前终止或是表达产物的部分降解所致，这可能与HIV-2 gag基因的自身结构有关[12]。
本课题为国家自然科学基金资助(批准号：39770661)
作者简介：王秀清，女，39岁，肿瘤学专业博士后研究人员；
, http://www.100md.com
金宁一，男，43岁，教授，主要研究分子病毒学
殷震(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春 130062)
王秀清(暨南大学医学院附二院(深圳市人民医院)肿瘤研究所研究室，深圳市东门北路3号，深圳 518020)
田梅(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)
李体远(暨南大学医学院附二院(深圳市人民医院)中心实验室，深圳 518020)
李钟洙(白求恩医科大学第二临床学院皮肤科，长春 130041)
参考文献
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, 百拇医药
2，Griffiths J C,Harris S J,Layton et al.Hybrid human immunodeficiency virus gag particles as an antigen carrier system:lnduction of cytotoxic T-cell and humoral responses by a gag:V3 fusion.Journal of Virology,1993;67(6):3191
3，Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆操作指南.第2版.北京：科学出版社，1992:16-50
4，张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990；6(2)：111
5，王秀清，金宁一，田 梅 et al.HIV-2 env 基因在大肠杆菌和重组痘苗中的表达.中国兽医学报，1998；18(3)：216
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6，张智清，徐大模，侯云德 et al.人白细胞介素-2 cDNA在大肠杆菌中的高效表达及纯化.病毒学报，1988；4(2)：165
7，程 云，汪力亚，李伯安 et al.HBV PreS2单链抗体基因在大肠杆菌中的克隆及初步表达.中华微生物学和免疫学杂志，1996；16(4)：236
8，曾蔚蓝，刘崇柏.乙型肝炎病毒e抗原在大肠杆菌中的表达.病毒学报，1991；7(4)：232
9，张智清，侯云德，李玉英et al.应用PRPL串联启动子和Clts857调控基因高效表达人γ干扰素.病毒学报，1988；4(2)：97
10，黎孟枫，曾 庆，周 圆 et al.人ω I型干扰素基因在大肠杆菌中的表达.病毒学报，1992；8(2)：184
11，李伍举，吴加金.pBV220载体中外源基因二级结构与表达水平关系.生物技术通讯，1996；7(4)：149
12，隋广超，胡美浩.影响大肠杆菌中外源基因表达的因素.生物化学与生物物理进展，1994；21(2)：128
收稿1999-01-22 修回1999-11-01, 百拇医药