靶向化疗：基因治疗研究的新热点
作者：戴益民
单位：第二军医大学病理学教研室 上海市 200433
关键词：肿瘤/治疗；自杀基因；基因治疗
中国图书馆分类号 R730中国图书馆分类号 R730.5
Subject headings neoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy
1 原文要点
作者应用逆转录病毒感染法将目的基因G1 CEA CDNa及pCD2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞系(Lovo)中，再分别接种到裸鼠皮下，成瘤后腹腔给予5-FC(500mg/kg.d)治疗，疗程40d，结果显示含G1 CEA CDNa及pCD2 逆转录病毒载体的病毒滴度分别为1.3×107及2.1×108 CFU/L，所有转基因成功并接种动物均成瘤. 腹腔给予5-FC治疗后发现，转染含CEA基因顺式转录调控序列(TRS)CD基因(G1CEACDNa)的裸鼠移植大肠癌，对5-FC的疗效敏感性明显高于不含该调控序列CD基因(pCD2)转染的裸鼠肿瘤，治疗结束后肿瘤重量分别为3.1mg±8.0mg及113mg±23.0mg，病理组织学图象显示前者癌细胞数量稀少，形态生长不良，彼此统计学差异非常显著(P<0.01). 作者结论，CEA转录调控序列可控制CD基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达，进而在前药5-FC的作用下发挥选择性杀伤肿瘤的作用.
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2 评论
2.1 肿瘤基因治疗的由来[1-14] 基因治疗(gene therapy)作为肿瘤治疗的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注，它是分子生物学各项技术成熟基础上建立起来的. 基因治疗是指把目的基因导入靶细胞和宿主体内，通过基因整合，成为宿主遗传物质的一部分，纠正错误的基因表达和基因表达的错误，以达到治疗目的，这一工作通常包括：基因置换(由正常基因置换掉疾病基因)，基因修正(纠正缺陷基因的突变碱基序列)，基因修饰(将目的基因导入病变细胞基因，其表达产物用以修饰缺陷基因导致细胞功能异常，或使正常功能得以加强)和基因失活(应用反义技术封闭不该表达的基因，以抑制有害基因，或直接抑制基因表达)等途径和内容. 近10多年来，随着分子生物学技术和理论的飞速发展，使基因治疗这一新型治疗方法成为可能，并在对单基因缺陷性遗传疾病的治疗中取得了令人瞩目的成就. 肿瘤的基因治疗研究也成为目前肿瘤防治研究的一个活跃领域[1-2]. 自Rosenberg(1989)[3]利用逆转录病毒载体基因转移技术将细胞因子基因导入肿瘤浸润淋巴细胞，率先开展了肿瘤免疫基因治疗的临床试验以来，随着人们对肿瘤免疫、肿瘤发病的分子机制，以及细胞生长调控规律研究的深入，肿瘤的基因治疗研究获得了巨大推动力，开始逐渐走向成熟，已有许多临床试验计划得到了批准. 迄今，人们已探索开展了免疫基因治疗[4-5]，转导抑癌基因或反义癌基因治疗[6-9]，以及自杀基因靶向化疗[10-14]等极富发展前景的肿瘤基因治疗研究，初步结果令人鼓舞. 肿瘤基因疗法具有下列优越性：①肿瘤的选择性比放疗、化疗更强，这可通过特异性基因转导技术或特异基因的定向作用而获得；②对患瘤个体损伤小而轻；③对晚期肿瘤或转移瘤灶仍有效. 目前，肿瘤的基因治疗已成为世界医学界的热点，谈家桢院士认为21世纪的医疗革命将取决于基因治疗研究的成功. 美国著名的Kelly博士预言，21世纪的基因治疗，将象20世纪免疫预防和抗生素一样给人类带来极其深远的影响[15]. 所以，崔龙等人能瞄准当前肿瘤基因治疗这一国内外热门研究前沿领域，选题开展应用性研究，并取得初步建树，实属可喜.
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2.2 肿瘤基因治疗的关键环节[15-17]
2.2.1 目的基因 目的基因是弥补缺损基因及纠正异常基因的基因序列. 目的基因纯化和扩增是基因治疗首先关心的问题，人体有30亿个碱基对，5万～10万个基因，从中正确选择所需的基因片段是成功的关键. 提取目的基因的方法有：①用限制性内切酶把所需的基因切割下来；②用cDNA文库，即根据蛋白质(或酶)的氨基酸顺序选择的mRNA，然后用逆转录酶合成DNA；③人工合成DNA. 从体细胞中获取的DNA比较困难且既有外显子又有内含子，而后两种方法所获得的DNA常常只有外显子，而无内含子. 目的DNA提纯后尚需要扩增，扩增方法可使用PCR也可使用载体，如目的基因可以接种到大肠杆菌，当大肠杆菌繁殖时，目的基因也达到了大量复制，目前常用的还有质粒(plasma). 质粒是细菌染色体外的遗传单体，其大小约在1kb～200kb，它往往具有以下特点：相对较小，便于操作，具有复制的起始点，加一段特殊基因片段(如耐药基团)作为标记，常常带有一个或几个可供选择的基因标记；质粒DNA序列中常包含了启动子、终止子，SD序列；这要求目的基因分子量<10kb，一般为2kb～3kb. 常用的质粒载体有pBR322，pUC118/119，pSP64/65，pGEM. 其他常用的载体还包括λ噬菌体载体、粘粒载体、单链丝状噬菌体等. 另外，目的基因选择后还需考虑2个问题：①基因必须连接完整信号肽序列，只有在启动子控制下，目的基因才能表达；②目的基因往往连上一个标记基因，如常用的耐药基因、TK基因. 由于目的基因在载体或进入靶细胞时整合比率较低，使用标记基因便于从无数个细胞中选出确实整合的质粒或靶细胞.
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2.2.2 靶细胞的选择 含将被纠正的异常基因的细胞称为靶细胞，在基因治疗中正确选择靶细胞是基因治疗成功的又一关键，理论上，基因治疗的靶细胞有两类：生殖细胞和体细胞，由于生殖细胞可以传给后代，特别是目的基因治疗尚不完善，为防止基因治疗给后代带来可能损害，改变人类基因信息体系，国际上从伦理方面考虑严禁用于人类生殖细胞，即使在动物身上使用也有严格限制. 体细胞是基因治疗的主要对象. 基因缺陷的器官或组织是首选材料. 靶细胞要求必须容易获得且容易在体外培养. 在体外作基因治疗时，要把靶细胞取出，把目的基因转入后再回输到体内，这一类最常应用于血液系统细胞，如红细胞、淋巴细胞、造血干细胞，此外还用于肝细胞. 其次必须容易被转导，经验证明，凡靶细胞处于活跃分裂的细胞基因转移效率较高，在合适转导条件下，转染到在体外经刺激后分裂活跃的细胞. 如骨髓干细胞和肿瘤细胞中，大多能取得较高转移效率，同时还必须有较长的寿命. 为了使基因治疗终生或至少长期有效，期望靶细胞有较长的寿命，这方面比较理想的是骨髓干细胞和肿瘤细胞. 在目前基因治疗实践中使用较多的靶细胞，除某些恶性肿瘤细胞外，还有肿瘤内浸润淋巴细胞(TIL)、骨髓干细胞、红细胞，以及肝、心、脾等实质器官细胞等，可以用于临床其他的靶细胞还有内皮细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、骨骼细胞，但都有一定的局限性.
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2.2.3 转导(转移)方法的选择 把目的基因直接或间接导入靶细胞过程称为转导或转移(translation). 无论是体内还是体外，如何将基因导入机体细胞或肿瘤细胞，并获得安全有效表达是目前基因治疗研究的热门课题，向细胞内导入外源基因的方法较多，大体上可分为二类，一是非病毒转导法. 如DNA-磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体介导、受体介导转移、DNA直接注射及基因枪等. 其中DNA直接注射体内的方法简便，实用性强，易被临床所接受. 它包括以下内容：①体内直接肌注质粒DNA，Wolff et al首先将质粒DNA注入小鼠股四头肌中并获得目的基因的表达，表达时间最长达18mo. 这对肿瘤的基因治疗是有利的，因为肿瘤的治疗并不要求外源基因永久表达. 目前认为肌细胞摄取质粒DNA可能与肌细胞的横管及肌浆网有关. ②用脂质体包裹DNA后静脉注射，但其缺点是转导和表达效率较低，达不到治疗肿瘤所需要的表达量. 二是病毒介导法. 重组病毒具有天然的侵袭细胞和整合于宿主细胞的能力. 目前研究和应用较多的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒(RNA病毒)、腺病毒相关病毒和疱疹病毒等. 彼此各有优缺点，文献中选用逆转录病毒作为导入目的基因载体的报道相对较多.
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2.3 自杀基因靶向化疗的特点与进展[10-17]
2.3.1 自杀基因(suicide gene)疗法 亦称病毒介导的酶解药物前体疗法(virus-divected enzyme/produrg tharapy, VDEPT). 其原理是将某些外源性酶解前药基因导入肿瘤细胞，使这些具有潜在毁灭性的基因获得内源性表达，生成特定的酶类，这些酶产物对进入肿瘤细胞无毒的或极低毒性的前体药物具有特别的敏感性，并能催化其转变成具有毒性的化疗药物，从而导致这些肿瘤细胞的死亡，即“自杀”. 据知此类基因的作用不仅仅引起导入基因的肿瘤细胞“自杀”，尚可通过“旁观者”效应(bystander effect)杀伤未导入基因的邻近分裂细胞，显著扩大其杀伤效应. 其发生机制认为可能与细胞连接交通，诱导细胞凋亡，增强肿瘤局部的抗肿瘤免疫以及造成肿瘤局部的血管损伤等有关. 目前该领域的一个重要进展是组织特异性自杀基因疗法，即将肿瘤特异性启动基因与自杀基因连接并转染细胞，这样该系统只在含有必需转录因子的特定肿瘤细胞中表达，使得被激活的药物前体选择性介导细胞毒性作用破坏肿瘤细胞，例如，单纯疱疹病毒腺苷激酶(HSV-tk)能把核苷酸类似物GCV(ganciclovir)转化为一种毒性代谢物-三磷酸丙氧鸟苷，作为链的终止剂，干扰细胞分裂时DNA的合成，最终导致细胞阻抑或死亡. 由此设计的治疗策略是将HSV-tk基因导入肿瘤细胞，随后用GCV进行治疗. 这种方法的基础在于HSV-tk基因可选择性导入肿瘤细胞，不侵犯正常细胞，理想的治疗方法是使带有tk基因的逆转录病毒载体选择性地导入正在分裂的肿瘤细胞，然后加上GCV治疗，从而增加了肿瘤细胞对GCV的敏感性，提高其抗肿瘤效果.
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由于哺乳动物细胞内不含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酸(E.coli-cytocine deaminase, CD)基因，转导CD基因的细胞可将无毒性的5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转换成有毒性的5-氟脲嘧啶(5-FU)，从而导致细胞死亡. 此种基因治疗方案首先是由Huber et al1991年针对原发性肝细胞癌的特点设计的一种基因转移与化疗药物相结合的一种靶向化疗抗肿瘤新方法[13]. 这种方法避免了化疗药物特异性差，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有严重杀伤作用的缺点，提高了化疗药物抗肿瘤细胞的特异性和靶向性. 结果显示4%的肿瘤细胞表达CD基因即可产生明显的抗肿瘤效应，杀灭60%以上的肿瘤细胞.
2.3.2 特异性转录调控 肿瘤自杀基因疗法，要求目的基因能选择性的表达于肿瘤靶细胞中，方能准确地杀伤肿瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用，特别是随着药物的旁杀作用愈来愈强，对自杀基因表达的肿瘤细胞特异性的要求就显得尤为重要. 为此人们不断设计了一些方法，以满足自杀基因的特异性转染与表达. 如利用病毒载体特异地整合于分裂细胞的特性，将目的基因导入正在分裂的肿瘤细胞，此法多应用于中枢神经系统肿瘤；以及利用受体介导的基因靶向系统，如George et al通过末端为半乳糖的糖蛋白受体建立的可溶性DNA载体系统，在体内特异地将外源基因导入肝脏肿瘤等. 此外，近年，不少研究者又找到了一个更加灵活、具有更广泛意义的治疗基因特异表达于肿瘤细胞的方法，即选用肿瘤特异性调控元件(启动子或增强子)以驱动自杀基因表达于特定的靶细胞. 目前此法已用于肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、 胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃肉瘤、黑素瘤等实体瘤的实验研究，并取得了预期效果，本刊物刊载的崔龙等报道的“5-FC/CD系统对大肠癌裸鼠肿瘤的杀伤效应”一文就是按这一原理设计的实验课题，具有一定的科学价值.
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已用于自杀基因靶向化疗(VDEPT)研究的特异性转录调控元件，计有甲胎蛋白(AFP)基因启动子(pAFP)，癌胚抗原(CEA)启动子(pCEA)，人表皮活化蛋白-A基因启动子(SPA)，DF3增强子，分泌性白细胞蛋白分解酶抑素启动子(pSLPI)，酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白启动子(styrb pTRP)，清蛋白启动子(pALB)，前列腺特异抗原启动子(pPSA)，骨钙化蛋白启动子(pOC)，erbB2癌基因启动子(pERBB2)，Mye-Max应答元件等(见表1).
表1 可供选择的VDEPT特异性转录调控元件
特异性转录调控元件
组织/肿瘤
癌胚抗原(CEA)
胃肠道、肺
, 百拇医药 甲胎蛋白(AFP)
肝细胞癌、畸胎瘤
多巴氨脱羟酶
神经外胚层、小细胞肺癌
前列腺特异性抗原
前列腺
甲状腺球蛋白
甲状腺
多形上皮粘蛋白
乳腺、胰腺
Vilin
胃肠道、胰腺
, http://www.100md.com erb-B2
胃肠道、胰腺
erb-B3
胃肠道、胰腺
人酪氨酸激酶
黑色素瘤
脱氧胞嘧啶激酶(dck)
血细胞肿瘤
清蛋白(ALB)
肝癌
DIA 多巴胺受体
中枢神经系统肿瘤
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p11,p12,pⅡ
生殖腺肿瘤
DF3
乳腺癌
人表皮活化蛋白A(SPA)
非小细胞肺癌
骨钙化蛋白
骨肉瘤
2.3.3 基本原理 肿瘤特异性转录调控元件之所以能够驱动自杀基因靶向特异地杀伤肿瘤细胞，表面上看好象是因为肿瘤细胞表达某种特异的蛋白，而其他非肿瘤细胞不表达，而实质上是因为非肿瘤细胞没有特定的转录激活因子，因而不能转录出特定的mRNA， 因此也就不能表达出相应的蛋白，而肿瘤细胞中则具有该转录因子活性，所以能激活特定的蛋白的表达，其转录激活作用又是通过结构基因上游的调控元件(启动子或增强子序列)而起作用. 因此，在正常细胞和肿瘤细胞都被转染的情况下，当用该调控元件驱动自杀基因时，肿瘤细胞自然会特异地表达出自杀基因的活性，而正常细胞则不能.
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目前，肿瘤特异性转录调控元件在基因治疗中的研究一般分四步. 首先，从已有的基础研究中，找出某一特定肿瘤的特异表达基因，并确定控制该基因向mRNA转录的上游调控序列；然后克隆出该调控序列，拼接于报告基因前，再将此嵌合基因重组于表达载体，转录入肿瘤细胞中，测其表达效率(与pV40比较)；第三步，当得到预期的结果后，再将该上游调控元件接上自杀基因，重组于载体，转染肿瘤细胞，随后给予前体药物，测其杀伤效率；第四步，得到满意结果后，最后将转染的肿瘤细胞种植于小鼠体内，给予前体药物，观察治疗效果. 崔龙等人撰写的此篇论文，就是总结前述第四步工作的初步研究结果.
2.4 存在的问题和展望[1，2，7-8，10-12，15-17]
2.4.1 存在的问题 在肿瘤治疗中，尽管基因疗法具有很大潜力，但目前所进行的工作还是探索性的，大多尚处于实验阶段. 目前在肿瘤自杀基因导向治疗研究中普遍存在的一个问题是对照组所用细胞均为各种肿瘤细胞，没有肿瘤细胞与癌旁组织的比较，也没有与骨髓、肠上皮等敏感组织的比较. 如Tadashi et al在用癌胚抗原(CEA)启动子对肺癌进行基因治疗的研究中，试验组采用CEA高表达的人肺癌细胞系AV49，CEA低表达的人肺癌细胞系CADO-LC9和不表达CEA的人宫颈癌细胞系Hela. 崔龙等的工作也存在类似问题，只是对大肠癌细胞自身有无CD基因和不同敏感类型CD基因转导的比较. 这样虽然证明了该启动子的作用，但是不应该忘记我们研究肿瘤特异性启动子的目的不是为了区分各种肿瘤细胞，而是为了区分肿瘤细胞与正常组织细胞，以达到特异地杀伤肿瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用的目的. 因此，在今后的研究工作中，主要目标是要立足于研究肿瘤特异性启动子对肿瘤及其周围组织，以及骨髓造血干细胞、小肠上皮细胞等化疗敏感组织的作用.
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存在的第二个问题是如何主动地寻找出针对某一肿瘤的特异性启动子. 肿瘤特异性启动子的研究，实质在于特异表达基因的研究. 目前，目的基因导入后在体内的表达水平不够理想，国内外学者大多从肿瘤标志物的研究出发，寻找能特异到达肿瘤组织的基因，从中筛选出特异的启动子. 如果某种肿瘤特异的标志物尚未搞清，则针对该肿瘤的特异性的基因治疗就无法开展. 即使象诸如AFP，CEA等胚胎性抗原那样也只是肝癌、结直肠癌的相对特异性标志物，并非绝对特异. 因此，如何主动地寻找针对某一种肿瘤的特异性启动子的问题就摆在了我们的面前. 存在的第三个问题，目前尚缺乏对原发癌瘤的基因治疗研究. 尽管裸鼠成瘤模型体内实验结果显示了用肿瘤特异的启动子连接自杀基因对肿瘤进行基因治疗的可行性，但前提是肿瘤细胞100%地带上自杀基因，而对于临床原发癌瘤实际上是做不到的，因而离临床实际应用还有一段路程要走. 另外，药物转导基因的旁观者效应及其毒副作用的机制也需进一步阐明.
2.4.2 展望 鉴于肿瘤基因治疗，尤其是肿瘤自杀基因靶向化疗已开始从理论走向实践，其有效性已在体外和动物实验中初见端倪，部分计划已开始临床实验(表2).表2 已获批准的肿瘤基因治疗人体实验方案
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方案
疾病
NeoR/TIL
恶性黑素瘤、肾细胞癌
TNF/TIL
恶性黑素瘤
TNF/肿瘤
恶性黑素瘤、肾癌、结肠癌
IL-2/肿瘤
恶性黑素瘤、肾癌、结肠癌
HSV-TK
卵巢癌
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HLA-B7/黑素瘤
恶性黑素瘤
但仍存在不少问题有待改进和提高. 例如寻找转导效率高，表达稳定、安全性好能反复多次应用，组织或细胞定向特异的载体，寻找新的自杀基因系统，多基因系统联合应用等等，以进一步提高疗效和确保使用的安全性. 随着人们对肿瘤发病的分子机制和细胞生长调控研究的深入，以及基因转移技术的不断发展，必然能从分子水平设计出更为有效的基因治疗方案，建立简单、安全的操作系统. 预计将来肿瘤的基因治疗可能会出现这样一种模式：当某一患者被确诊为患某一癌症后，外检取其癌细胞及癌旁正常组织，以及骨髓、肠上皮等敏感组织，运用差异显示技术(如递减杂交、差示筛选、吸收探针、扣除文库、印迹转移和差异显示PT-PCR技术等)分析其各组织基因表达的特点，筛选出该患者所患肿瘤特异性表达的基因及其上游调控序列，然后截去结构基因，接上治疗基因，使其受控于特异的启动子之下，从而构建成特异的治疗基因载体，通过活体瘤内直接注射或其他措施，将其转染所患肿瘤，然后服用相应的无毒性或低毒性前体药物，在肿瘤内转换成毒性药物，将肿瘤杀死，而不累及正常组织. 也就是，对具体肿瘤类型先选出其特异启动子，接上自杀基因，转染瘤体，给予前体药，特异地杀伤肿瘤细胞，这种分子水平的精细定向化疗，势必为最终攻克包括消化道常见癌瘤、如胃癌、肝癌、结直肠癌等在内的癌症这一顽疾提供强有力的武器.
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通讯作者 戴益民
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收稿日期 1999-03-28, 百拇医药
单位：第二军医大学病理学教研室 上海市 200433
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作者应用逆转录病毒感染法将目的基因G1 CEA CDNa及pCD2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞系(Lovo)中，再分别接种到裸鼠皮下，成瘤后腹腔给予5-FC(500mg/kg.d)治疗，疗程40d，结果显示含G1 CEA CDNa及pCD2 逆转录病毒载体的病毒滴度分别为1.3×107及2.1×108 CFU/L，所有转基因成功并接种动物均成瘤. 腹腔给予5-FC治疗后发现，转染含CEA基因顺式转录调控序列(TRS)CD基因(G1CEACDNa)的裸鼠移植大肠癌，对5-FC的疗效敏感性明显高于不含该调控序列CD基因(pCD2)转染的裸鼠肿瘤，治疗结束后肿瘤重量分别为3.1mg±8.0mg及113mg±23.0mg，病理组织学图象显示前者癌细胞数量稀少，形态生长不良，彼此统计学差异非常显著(P<0.01). 作者结论，CEA转录调控序列可控制CD基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达，进而在前药5-FC的作用下发挥选择性杀伤肿瘤的作用.
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2 评论
2.1 肿瘤基因治疗的由来[1-14] 基因治疗(gene therapy)作为肿瘤治疗的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注，它是分子生物学各项技术成熟基础上建立起来的. 基因治疗是指把目的基因导入靶细胞和宿主体内，通过基因整合，成为宿主遗传物质的一部分，纠正错误的基因表达和基因表达的错误，以达到治疗目的，这一工作通常包括：基因置换(由正常基因置换掉疾病基因)，基因修正(纠正缺陷基因的突变碱基序列)，基因修饰(将目的基因导入病变细胞基因，其表达产物用以修饰缺陷基因导致细胞功能异常，或使正常功能得以加强)和基因失活(应用反义技术封闭不该表达的基因，以抑制有害基因，或直接抑制基因表达)等途径和内容. 近10多年来，随着分子生物学技术和理论的飞速发展，使基因治疗这一新型治疗方法成为可能，并在对单基因缺陷性遗传疾病的治疗中取得了令人瞩目的成就. 肿瘤的基因治疗研究也成为目前肿瘤防治研究的一个活跃领域[1-2]. 自Rosenberg(1989)[3]利用逆转录病毒载体基因转移技术将细胞因子基因导入肿瘤浸润淋巴细胞，率先开展了肿瘤免疫基因治疗的临床试验以来，随着人们对肿瘤免疫、肿瘤发病的分子机制，以及细胞生长调控规律研究的深入，肿瘤的基因治疗研究获得了巨大推动力，开始逐渐走向成熟，已有许多临床试验计划得到了批准. 迄今，人们已探索开展了免疫基因治疗[4-5]，转导抑癌基因或反义癌基因治疗[6-9]，以及自杀基因靶向化疗[10-14]等极富发展前景的肿瘤基因治疗研究，初步结果令人鼓舞. 肿瘤基因疗法具有下列优越性：①肿瘤的选择性比放疗、化疗更强，这可通过特异性基因转导技术或特异基因的定向作用而获得；②对患瘤个体损伤小而轻；③对晚期肿瘤或转移瘤灶仍有效. 目前，肿瘤的基因治疗已成为世界医学界的热点，谈家桢院士认为21世纪的医疗革命将取决于基因治疗研究的成功. 美国著名的Kelly博士预言，21世纪的基因治疗，将象20世纪免疫预防和抗生素一样给人类带来极其深远的影响[15]. 所以，崔龙等人能瞄准当前肿瘤基因治疗这一国内外热门研究前沿领域，选题开展应用性研究，并取得初步建树，实属可喜.
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2.2 肿瘤基因治疗的关键环节[15-17]
2.2.1 目的基因 目的基因是弥补缺损基因及纠正异常基因的基因序列. 目的基因纯化和扩增是基因治疗首先关心的问题，人体有30亿个碱基对，5万～10万个基因，从中正确选择所需的基因片段是成功的关键. 提取目的基因的方法有：①用限制性内切酶把所需的基因切割下来；②用cDNA文库，即根据蛋白质(或酶)的氨基酸顺序选择的mRNA，然后用逆转录酶合成DNA；③人工合成DNA. 从体细胞中获取的DNA比较困难且既有外显子又有内含子，而后两种方法所获得的DNA常常只有外显子，而无内含子. 目的DNA提纯后尚需要扩增，扩增方法可使用PCR也可使用载体，如目的基因可以接种到大肠杆菌，当大肠杆菌繁殖时，目的基因也达到了大量复制，目前常用的还有质粒(plasma). 质粒是细菌染色体外的遗传单体，其大小约在1kb～200kb，它往往具有以下特点：相对较小，便于操作，具有复制的起始点，加一段特殊基因片段(如耐药基团)作为标记，常常带有一个或几个可供选择的基因标记；质粒DNA序列中常包含了启动子、终止子，SD序列；这要求目的基因分子量<10kb，一般为2kb～3kb. 常用的质粒载体有pBR322，pUC118/119，pSP64/65，pGEM. 其他常用的载体还包括λ噬菌体载体、粘粒载体、单链丝状噬菌体等. 另外，目的基因选择后还需考虑2个问题：①基因必须连接完整信号肽序列，只有在启动子控制下，目的基因才能表达；②目的基因往往连上一个标记基因，如常用的耐药基因、TK基因. 由于目的基因在载体或进入靶细胞时整合比率较低，使用标记基因便于从无数个细胞中选出确实整合的质粒或靶细胞.
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2.2.2 靶细胞的选择 含将被纠正的异常基因的细胞称为靶细胞，在基因治疗中正确选择靶细胞是基因治疗成功的又一关键，理论上，基因治疗的靶细胞有两类：生殖细胞和体细胞，由于生殖细胞可以传给后代，特别是目的基因治疗尚不完善，为防止基因治疗给后代带来可能损害，改变人类基因信息体系，国际上从伦理方面考虑严禁用于人类生殖细胞，即使在动物身上使用也有严格限制. 体细胞是基因治疗的主要对象. 基因缺陷的器官或组织是首选材料. 靶细胞要求必须容易获得且容易在体外培养. 在体外作基因治疗时，要把靶细胞取出，把目的基因转入后再回输到体内，这一类最常应用于血液系统细胞，如红细胞、淋巴细胞、造血干细胞，此外还用于肝细胞. 其次必须容易被转导，经验证明，凡靶细胞处于活跃分裂的细胞基因转移效率较高，在合适转导条件下，转染到在体外经刺激后分裂活跃的细胞. 如骨髓干细胞和肿瘤细胞中，大多能取得较高转移效率，同时还必须有较长的寿命. 为了使基因治疗终生或至少长期有效，期望靶细胞有较长的寿命，这方面比较理想的是骨髓干细胞和肿瘤细胞. 在目前基因治疗实践中使用较多的靶细胞，除某些恶性肿瘤细胞外，还有肿瘤内浸润淋巴细胞(TIL)、骨髓干细胞、红细胞，以及肝、心、脾等实质器官细胞等，可以用于临床其他的靶细胞还有内皮细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、骨骼细胞，但都有一定的局限性.
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2.2.3 转导(转移)方法的选择 把目的基因直接或间接导入靶细胞过程称为转导或转移(translation). 无论是体内还是体外，如何将基因导入机体细胞或肿瘤细胞，并获得安全有效表达是目前基因治疗研究的热门课题，向细胞内导入外源基因的方法较多，大体上可分为二类，一是非病毒转导法. 如DNA-磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体介导、受体介导转移、DNA直接注射及基因枪等. 其中DNA直接注射体内的方法简便，实用性强，易被临床所接受. 它包括以下内容：①体内直接肌注质粒DNA，Wolff et al首先将质粒DNA注入小鼠股四头肌中并获得目的基因的表达，表达时间最长达18mo. 这对肿瘤的基因治疗是有利的，因为肿瘤的治疗并不要求外源基因永久表达. 目前认为肌细胞摄取质粒DNA可能与肌细胞的横管及肌浆网有关. ②用脂质体包裹DNA后静脉注射，但其缺点是转导和表达效率较低，达不到治疗肿瘤所需要的表达量. 二是病毒介导法. 重组病毒具有天然的侵袭细胞和整合于宿主细胞的能力. 目前研究和应用较多的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒(RNA病毒)、腺病毒相关病毒和疱疹病毒等. 彼此各有优缺点，文献中选用逆转录病毒作为导入目的基因载体的报道相对较多.
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2.3 自杀基因靶向化疗的特点与进展[10-17]
2.3.1 自杀基因(suicide gene)疗法 亦称病毒介导的酶解药物前体疗法(virus-divected enzyme/produrg tharapy, VDEPT). 其原理是将某些外源性酶解前药基因导入肿瘤细胞，使这些具有潜在毁灭性的基因获得内源性表达，生成特定的酶类，这些酶产物对进入肿瘤细胞无毒的或极低毒性的前体药物具有特别的敏感性，并能催化其转变成具有毒性的化疗药物，从而导致这些肿瘤细胞的死亡，即“自杀”. 据知此类基因的作用不仅仅引起导入基因的肿瘤细胞“自杀”，尚可通过“旁观者”效应(bystander effect)杀伤未导入基因的邻近分裂细胞，显著扩大其杀伤效应. 其发生机制认为可能与细胞连接交通，诱导细胞凋亡，增强肿瘤局部的抗肿瘤免疫以及造成肿瘤局部的血管损伤等有关. 目前该领域的一个重要进展是组织特异性自杀基因疗法，即将肿瘤特异性启动基因与自杀基因连接并转染细胞，这样该系统只在含有必需转录因子的特定肿瘤细胞中表达，使得被激活的药物前体选择性介导细胞毒性作用破坏肿瘤细胞，例如，单纯疱疹病毒腺苷激酶(HSV-tk)能把核苷酸类似物GCV(ganciclovir)转化为一种毒性代谢物-三磷酸丙氧鸟苷，作为链的终止剂，干扰细胞分裂时DNA的合成，最终导致细胞阻抑或死亡. 由此设计的治疗策略是将HSV-tk基因导入肿瘤细胞，随后用GCV进行治疗. 这种方法的基础在于HSV-tk基因可选择性导入肿瘤细胞，不侵犯正常细胞，理想的治疗方法是使带有tk基因的逆转录病毒载体选择性地导入正在分裂的肿瘤细胞，然后加上GCV治疗，从而增加了肿瘤细胞对GCV的敏感性，提高其抗肿瘤效果.
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由于哺乳动物细胞内不含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酸(E.coli-cytocine deaminase, CD)基因，转导CD基因的细胞可将无毒性的5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转换成有毒性的5-氟脲嘧啶(5-FU)，从而导致细胞死亡. 此种基因治疗方案首先是由Huber et al1991年针对原发性肝细胞癌的特点设计的一种基因转移与化疗药物相结合的一种靶向化疗抗肿瘤新方法[13]. 这种方法避免了化疗药物特异性差，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有严重杀伤作用的缺点，提高了化疗药物抗肿瘤细胞的特异性和靶向性. 结果显示4%的肿瘤细胞表达CD基因即可产生明显的抗肿瘤效应，杀灭60%以上的肿瘤细胞.
2.3.2 特异性转录调控 肿瘤自杀基因疗法，要求目的基因能选择性的表达于肿瘤靶细胞中，方能准确地杀伤肿瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用，特别是随着药物的旁杀作用愈来愈强，对自杀基因表达的肿瘤细胞特异性的要求就显得尤为重要. 为此人们不断设计了一些方法，以满足自杀基因的特异性转染与表达. 如利用病毒载体特异地整合于分裂细胞的特性，将目的基因导入正在分裂的肿瘤细胞，此法多应用于中枢神经系统肿瘤；以及利用受体介导的基因靶向系统，如George et al通过末端为半乳糖的糖蛋白受体建立的可溶性DNA载体系统，在体内特异地将外源基因导入肝脏肿瘤等. 此外，近年，不少研究者又找到了一个更加灵活、具有更广泛意义的治疗基因特异表达于肿瘤细胞的方法，即选用肿瘤特异性调控元件(启动子或增强子)以驱动自杀基因表达于特定的靶细胞. 目前此法已用于肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、 胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃肉瘤、黑素瘤等实体瘤的实验研究，并取得了预期效果，本刊物刊载的崔龙等报道的“5-FC/CD系统对大肠癌裸鼠肿瘤的杀伤效应”一文就是按这一原理设计的实验课题，具有一定的科学价值.
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已用于自杀基因靶向化疗(VDEPT)研究的特异性转录调控元件，计有甲胎蛋白(AFP)基因启动子(pAFP)，癌胚抗原(CEA)启动子(pCEA)，人表皮活化蛋白-A基因启动子(SPA)，DF3增强子，分泌性白细胞蛋白分解酶抑素启动子(pSLPI)，酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白启动子(styrb pTRP)，清蛋白启动子(pALB)，前列腺特异抗原启动子(pPSA)，骨钙化蛋白启动子(pOC)，erbB2癌基因启动子(pERBB2)，Mye-Max应答元件等(见表1).
表1 可供选择的VDEPT特异性转录调控元件
特异性转录调控元件
组织/肿瘤
癌胚抗原(CEA)
胃肠道、肺
, 百拇医药 甲胎蛋白(AFP)
肝细胞癌、畸胎瘤
多巴氨脱羟酶
神经外胚层、小细胞肺癌
前列腺特异性抗原
前列腺
甲状腺球蛋白
甲状腺
多形上皮粘蛋白
乳腺、胰腺
Vilin
胃肠道、胰腺
, http://www.100md.com erb-B2
胃肠道、胰腺
erb-B3
胃肠道、胰腺
人酪氨酸激酶
黑色素瘤
脱氧胞嘧啶激酶(dck)
血细胞肿瘤
清蛋白(ALB)
肝癌
DIA 多巴胺受体
中枢神经系统肿瘤
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p11,p12,pⅡ
生殖腺肿瘤
DF3
乳腺癌
人表皮活化蛋白A(SPA)
非小细胞肺癌
骨钙化蛋白
骨肉瘤
2.3.3 基本原理 肿瘤特异性转录调控元件之所以能够驱动自杀基因靶向特异地杀伤肿瘤细胞，表面上看好象是因为肿瘤细胞表达某种特异的蛋白，而其他非肿瘤细胞不表达，而实质上是因为非肿瘤细胞没有特定的转录激活因子，因而不能转录出特定的mRNA， 因此也就不能表达出相应的蛋白，而肿瘤细胞中则具有该转录因子活性，所以能激活特定的蛋白的表达，其转录激活作用又是通过结构基因上游的调控元件(启动子或增强子序列)而起作用. 因此，在正常细胞和肿瘤细胞都被转染的情况下，当用该调控元件驱动自杀基因时，肿瘤细胞自然会特异地表达出自杀基因的活性，而正常细胞则不能.
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目前，肿瘤特异性转录调控元件在基因治疗中的研究一般分四步. 首先，从已有的基础研究中，找出某一特定肿瘤的特异表达基因，并确定控制该基因向mRNA转录的上游调控序列；然后克隆出该调控序列，拼接于报告基因前，再将此嵌合基因重组于表达载体，转录入肿瘤细胞中，测其表达效率(与pV40比较)；第三步，当得到预期的结果后，再将该上游调控元件接上自杀基因，重组于载体，转染肿瘤细胞，随后给予前体药物，测其杀伤效率；第四步，得到满意结果后，最后将转染的肿瘤细胞种植于小鼠体内，给予前体药物，观察治疗效果. 崔龙等人撰写的此篇论文，就是总结前述第四步工作的初步研究结果.
2.4 存在的问题和展望[1，2，7-8，10-12，15-17]
2.4.1 存在的问题 在肿瘤治疗中，尽管基因疗法具有很大潜力，但目前所进行的工作还是探索性的，大多尚处于实验阶段. 目前在肿瘤自杀基因导向治疗研究中普遍存在的一个问题是对照组所用细胞均为各种肿瘤细胞，没有肿瘤细胞与癌旁组织的比较，也没有与骨髓、肠上皮等敏感组织的比较. 如Tadashi et al在用癌胚抗原(CEA)启动子对肺癌进行基因治疗的研究中，试验组采用CEA高表达的人肺癌细胞系AV49，CEA低表达的人肺癌细胞系CADO-LC9和不表达CEA的人宫颈癌细胞系Hela. 崔龙等的工作也存在类似问题，只是对大肠癌细胞自身有无CD基因和不同敏感类型CD基因转导的比较. 这样虽然证明了该启动子的作用，但是不应该忘记我们研究肿瘤特异性启动子的目的不是为了区分各种肿瘤细胞，而是为了区分肿瘤细胞与正常组织细胞，以达到特异地杀伤肿瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用的目的. 因此，在今后的研究工作中，主要目标是要立足于研究肿瘤特异性启动子对肿瘤及其周围组织，以及骨髓造血干细胞、小肠上皮细胞等化疗敏感组织的作用.
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存在的第二个问题是如何主动地寻找出针对某一肿瘤的特异性启动子. 肿瘤特异性启动子的研究，实质在于特异表达基因的研究. 目前，目的基因导入后在体内的表达水平不够理想，国内外学者大多从肿瘤标志物的研究出发，寻找能特异到达肿瘤组织的基因，从中筛选出特异的启动子. 如果某种肿瘤特异的标志物尚未搞清，则针对该肿瘤的特异性的基因治疗就无法开展. 即使象诸如AFP，CEA等胚胎性抗原那样也只是肝癌、结直肠癌的相对特异性标志物，并非绝对特异. 因此，如何主动地寻找针对某一种肿瘤的特异性启动子的问题就摆在了我们的面前. 存在的第三个问题，目前尚缺乏对原发癌瘤的基因治疗研究. 尽管裸鼠成瘤模型体内实验结果显示了用肿瘤特异的启动子连接自杀基因对肿瘤进行基因治疗的可行性，但前提是肿瘤细胞100%地带上自杀基因，而对于临床原发癌瘤实际上是做不到的，因而离临床实际应用还有一段路程要走. 另外，药物转导基因的旁观者效应及其毒副作用的机制也需进一步阐明.
2.4.2 展望 鉴于肿瘤基因治疗，尤其是肿瘤自杀基因靶向化疗已开始从理论走向实践，其有效性已在体外和动物实验中初见端倪，部分计划已开始临床实验(表2).表2 已获批准的肿瘤基因治疗人体实验方案
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方案
疾病
NeoR/TIL
恶性黑素瘤、肾细胞癌
TNF/TIL
恶性黑素瘤
TNF/肿瘤
恶性黑素瘤、肾癌、结肠癌
IL-2/肿瘤
恶性黑素瘤、肾癌、结肠癌
HSV-TK
卵巢癌
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HLA-B7/黑素瘤
恶性黑素瘤
但仍存在不少问题有待改进和提高. 例如寻找转导效率高，表达稳定、安全性好能反复多次应用，组织或细胞定向特异的载体，寻找新的自杀基因系统，多基因系统联合应用等等，以进一步提高疗效和确保使用的安全性. 随着人们对肿瘤发病的分子机制和细胞生长调控研究的深入，以及基因转移技术的不断发展，必然能从分子水平设计出更为有效的基因治疗方案，建立简单、安全的操作系统. 预计将来肿瘤的基因治疗可能会出现这样一种模式：当某一患者被确诊为患某一癌症后，外检取其癌细胞及癌旁正常组织，以及骨髓、肠上皮等敏感组织，运用差异显示技术(如递减杂交、差示筛选、吸收探针、扣除文库、印迹转移和差异显示PT-PCR技术等)分析其各组织基因表达的特点，筛选出该患者所患肿瘤特异性表达的基因及其上游调控序列，然后截去结构基因，接上治疗基因，使其受控于特异的启动子之下，从而构建成特异的治疗基因载体，通过活体瘤内直接注射或其他措施，将其转染所患肿瘤，然后服用相应的无毒性或低毒性前体药物，在肿瘤内转换成毒性药物，将肿瘤杀死，而不累及正常组织. 也就是，对具体肿瘤类型先选出其特异启动子，接上自杀基因，转染瘤体，给予前体药，特异地杀伤肿瘤细胞，这种分子水平的精细定向化疗，势必为最终攻克包括消化道常见癌瘤、如胃癌、肝癌、结直肠癌等在内的癌症这一顽疾提供强有力的武器.
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通讯作者 戴益民
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收稿日期 1999-03-28, 百拇医药