丙型肝炎病毒NS3区辅助性T细胞抗原表位的应答
作者：汪涛 齐连权 徐俊杰 郭华章 金伯泉 王海涛
单位：汪涛(航天医学工程研究所13室，北京100094)；齐连权(军事医学科学院微生物流行病研究所)；徐俊杰(军事医学科学院微生物流行病研究所)；郭华章(军事医学科学院微生物流行病研究所)；金伯泉(西安第四军医大学免疫学教研室)；王海涛(军事医学科学院微生物流行病研究所)
关键词：丙型肝炎病毒；HLA；表位；辅助性T细胞；NS3区
细胞与分子免疫学杂志000112
摘要：目的观察2例慢性HCV携带者及1例HCVRNA转阴者外周血淋巴细胞对HCVNS3区辅助性T细胞抗原表位的应答。方法用血清学方法检测患者的HLA分型。根据计算机软件分析和文献资料，合成了1个位于HCVNS3区长度为14个氨基酸的辅助性T细胞表位，与在GeneBank中已发表的34个HCV全长序列进行了比较。用T细胞增殖实验方法检测对这一表位的应答。结果3例患者的MHCII类分子不完全相同。这一表位在已发表的34个HCV全长序列中高度保守，只在4个序列有1个氨基酸的差异。本实验发现，无论是两例长期HCV患者，还是1例HCVRNA转阴者，对此多肽的刺激均有较强的应答，刺激指数均大于3，而8例正常对照组均小于1.6。结论对HCVNS3区的这一辅助性T细胞表位的应答强度，不仅与HCV的自限性有关，而且与慢性HCV感染的发病状况有关。
, 百拇医药
关键词:丙型肝炎病毒；HLA；表位；辅助性T细胞；NS3区
中图号:R392.2 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0038-40
Proliferative response to an Th cell epitope within the
HCV NS3 domain by PBMC of HCV patients
WANG Tao
(Institute of Space Medico-Engineering, Beijing 100094)
QI Lian-quan XU Jun-jie GUO Hua-zhang WANG Hai-tao
, http://www.100md.com
(Insti-tute of Microbiology ＆ Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences)
JIN Bo-quan
(Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710033 )
Abstract:Aim To investigate the helper T cell response to an epitope within the NS3 domain in two chronic HCV carriers and one self-limited patient. Methods HLA type was determined by serotyping technique. An epitope(amino acids 1248 to 1264) was synthesized according to computer analysis and published articles. The epitope was analyzed within 34 HCV complete sequences in GenBank. Results The epitope was highly conserved in all sequences except that one amino acid difference was found in four sequences respectively. The HLA typ wasn't same in three patients.The levels of proliferative response to this epitope by PBMC from all three patients was higher than those from normal control. Conclusion The response to the epitope within HCV NS3 domain may not only have relationship to self-limited course of HCV infected patients,hut also to the disease condition of chronic HCV infected patients.
, http://www.100md.com
Keywords: hepatitis C virus; HLA; epitope; helper T cell; NS3 domain
丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科的正链RNA病毒，能引起肝炎、肝硬化和肝癌。辅助性T淋巴细胞可通过分泌细胞因子，调节CD8+T细胞介导的杀伤作用，促进B细胞分泌免疫球蛋白调节免疫功能，因而在病毒免疫中起重要的作用〔1〕。近年来研究表明，辅助性T细胞应答与HCV急性感染的自限性有关。Diepolder等〔2〕发现, 对HCV NS3区抗原有强特异性辅助性T细胞应答的患者，HCV感染呈自限性发病过程；而弱或无T细胞应答的患者会发展为慢性肝炎。并找到1个位于NS3区中14个氨基酸的辅助性T细胞表位，能被大多数HLA-DR提呈给辅助性T细胞〔3〕，表明这一表位有可能与HCV患者HCV转阴和慢性HCV感染有关。我们检测了2例慢性HCV感染者和1例HCV转阴者对这一表位的应答,探讨了这一表位在慢性HCV感染者中的作用。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 慢性HCV患者(编号为94-1,291)和HCV转阴患者的系列血清，分别采于1991年～1998年。血样本于-20℃冻存备用。血清标本均经5’端非码区PCR扩增证实，为HCV RNA阳性，经PCR鉴定无乙型肝炎病毒(HBV)感染。2例研究对象来自河北省固安县自然村，他们于1987年献血时感染HCV；经询问1991年后未再输血，5 a来无自觉症状。正常对照组血清，采自8 例无偿献血者，均经血清学检测无HIV、HBV和HCV感染，血清转氨酶均正常。
1.2 方法 患者HLA分型用泰萨奇HLA一类分型干板(One Lambda公司)，对3例患者采用补体依赖的微量细胞毒方法，进行HLA血清学分型。多肽合成：用PE公司433A型多肽合成仪，以Fmoc法合成。经Bio-Rad公司HPLC分离纯化。多肽序列位于HCV NS3区(1248-1264，共14个氨基酸)。在GenBank中查出34个HCV基因的全序列，核苷酸序列用Goldkey(军事医学科学院软件)翻译成蛋白质序列，然后进行NS3区辅助性T细胞表位变化的分析。辅助性T细胞的应答：无菌取外周血，用淋巴细胞分层液(Phamacia公司)分离单个核细胞。用RPMI 1640培养液(Gibco公司)洗2次，加入含100 mL/L AB型血清的完全RPMI 1640培养液制成1×109/L，每孔加0.2 mL细胞于96孔板中，再加入20 μL 14肽(终质量浓度为10 mg/L)。在含50 mL/L CO2的培养箱中培养5 d，于细胞收获前12 h，每孔加入20 μL 925 MBq/L的3H-TdR(Ameshan公司)。将细胞收获于9999型滤纸上，自然风干后，置于含5 mL闪烁液的测量瓶中，用液体闪烁仪测定每分钟的脉冲数(cpm)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 HCV患者的临床资料 3例患者血清中病毒RNA及抗核心区抗体的检测， 所获结果见表1。
表 1 HCV感染患者临床资料
Tab 1 Clinical data for patients with hepatitis C infection NO.
Sex Age
(yr)
HBV
HCV RNA Anti-core domain Ab titer
1991
, http://www.100md.com
1994
1996
1998
1991
1994
1996
1998*
29-1
Male 35
-
+
+
+
, 百拇医药
+
1∶10
1∶10
ND
+
94-1
Male 31
-
+
+
+
+
1∶10
, 百拇医药 1∶10
ND
+
68-1
Male 42
-
+
-
-
-
-
-
ND
-
, 百拇医药
*Detection of antibodies by second generation HCV ElISA kit
2.2 患者HLA分型与多肽合成 患者94-1号的HLA分型为：A11，30；B13，-；Bw4，-；DR52，53； DQ2,7;患者29-1号为: A2,11;B60(40),70;Bw6,-;DR8,15;DR52,-;DQ1,患者68-1号为：A2,A11;B40,55(22); Bw6,-;DR4,7;DR53,-;DQ2,-。HCV NS3区辅助性T细胞表位氨基酸合成的结果见图1。图1表明，合成多肽的纯度超过80%。
Position at drawing lines are mutated amino acid, HPCCGENOM of them is Hebei strain
, 百拇医药
图1 HCV NS3区辅助性T细胞表位的序列比较
Fig 1 Sequence comparison of helper T cell epitope in HCV NS3 domain
2.3 辅助性T细胞表位的序列比较 在GenBank中查出了34个HCV全基因序列，用Goldkey软件将其翻译成氨基酸序列的结果见图2。从图2中可以看出，由14个氨基酸组成的辅助性T细胞表位中，只有4个分离株的表位存在1个氨基酸的差异，说明此表位高度保守。
2.4 辅助性T细胞应答 两例慢性HCV携带者及1例HCV RNA转阴者，对HCV NS3区辅助性T细胞抗原表位的应答结果是：291号患者的刺激指数为3.29，941号患者为3.98，681号患者为3.81，刺激指数均大于3；而8例正常对照均小于1.6。
3 讨 论
, 百拇医药
T细胞在HCV清除和肝损害中都起重要的作用。丙型肝炎的发病机理十分复杂，有关CTL在HCV感染中的作用尚不完全明了。近年研究发现，辅助性T细胞在清除HCV感染中起重要的作用。辅助性T细胞在免疫应答中，主要通过T细胞受体识别病毒感染细胞表面的MHC II类分子与病毒源性短肽复合物，分泌细胞因子，从而起免疫调节作用。研究辅助性T细胞应答的主要方法，是用重组蛋白或多肽刺激患者的外周血淋巴细胞，培养5～7 d后，掺入同位素，测定刺激指数，大于3者为阳性〔4〕。Diepolder等〔1〕报道，对HCV NS3区抗原有强特异性辅助性T细胞应答的患者，HCV感染呈自限性发病过程；而弱或无T细胞应答的患者会发展为慢性肝炎。另外，找到了1个位于NS3区的由14个氨基酸组成的辅助性T细胞表位，能被大多数HLADR提呈给辅助性T细胞〔2〕。此外还发现，HCV痊愈的患者对E，C, NS4A和NS5区重组蛋白抗原和合成肽的增殖反应也有较强的辅助性T细胞应答〔5～7〕。上述结果表明，T细胞应答的强度与HCV感染的控制和疾病的转归有密切的关系。
, 百拇医药 本研究表明，有1例HCV转阴者，其外周血淋巴细胞对位于NS3区的由14个氨基酸组成的多肽有强的应答。而此患者经连续观察，不存在抗HCV抗体，表明对这一表位存在强的辅助性T细胞应答，可能是此患者转阴的主要原因。关于其机制可能是辅助性T细胞应答的增强，促进了CTL的杀伤作用所致；也可能是HCV感染患者转阴的原因之一。而2例 HCV携带者，在对其随访的7 a中，转氨酶均正常，也无明显不适，表明对此表位的辅助性T细胞应答与慢性HCV患者的发病状况有关。以上实验进一步证明，辅助性T细胞应答对在急性期能否清除病毒或慢性肝炎的病情状况有密切的关系。对临床治疗丙型肝炎和愈后判断也具有重要的指导意义。此外，由于此表位在HCV发表的序列中高度保守，而且3例患者的HLA各不相同，但仍有强的应答，说明此表位是T细胞疫苗的良好部位，从而为今后制备T细胞疫苗打下了良好的基础。
基金项目：国家自然基金重点基金资助项目No.39630020
作者简介：汪涛，男,34岁，博士
, http://www.100md.com
北京市圆明园西路1号，Tel.(010) 66365759
参考文献：
〔1〕 Bottomly KA. Functional dichotomy in CD4+ T lymphocyte〔J〕 . Immunol Today, 1988;9:268- 273.
〔2〕 Diepolder HM,Zachoval R,Hoffmann RM,et al. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to non-structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection〔J〕 . Lancet,1995;346:1006- 1007.
〔3〕 Diepolder HM,Gerlach JT,Zachoval R,et al. Immunodominant CD4+ T cell epitope within non-structural protein 3 in acute hepatitis C virus infection〔J〕 . J Virol, 1997;71(8):6011- 6019.
, http://www.100md.com
〔4〕 Lechmann ML,Ihlenfeldt HG,Braunschweiger I,et al.T-and B-cell responses to different hepatitis C virus antigens in patients with chronic hepatitis C infection and in healthy anti-hepatitis C virus-positive blood donors without viremia〔J〕 .Hepatology,1996;24(4):790-795.
〔5〕 Missale G,Bertoni R,larmonaca V, et al.Different clinical behaviors of acute hepatitis C virus infection are associated with different vigor of the antiviral cell-mediated immune response〔J〕 .J Clin Invest,1996;98:706- 714.
, http://www.100md.com
〔6〕 Ferrari C,Valli A,Galati L,et al.T-cell response to structural and non-structrual hepatitis C virus antigens in persistent and self limited hepatitis C virus infections〔J〕 . Hepatology, 1994; 19:286- 295.
〔7〕 Leroux-Roel G,Esquivel CA,Deleys R,et al. lympho-proliferative response to hepatitis C virus core,E1,E2 and NS3 in patients with chronic hepatitis C infection treated with interferon alpha〔J〕 . Hepotology, 1996;23:8- 16.
收稿日期：1999-03-30
修回日期：1999-06-15, 百拇医药
单位：汪涛(航天医学工程研究所13室，北京100094)；齐连权(军事医学科学院微生物流行病研究所)；徐俊杰(军事医学科学院微生物流行病研究所)；郭华章(军事医学科学院微生物流行病研究所)；金伯泉(西安第四军医大学免疫学教研室)；王海涛(军事医学科学院微生物流行病研究所)
关键词：丙型肝炎病毒；HLA；表位；辅助性T细胞；NS3区
细胞与分子免疫学杂志000112
摘要：目的观察2例慢性HCV携带者及1例HCVRNA转阴者外周血淋巴细胞对HCVNS3区辅助性T细胞抗原表位的应答。方法用血清学方法检测患者的HLA分型。根据计算机软件分析和文献资料，合成了1个位于HCVNS3区长度为14个氨基酸的辅助性T细胞表位，与在GeneBank中已发表的34个HCV全长序列进行了比较。用T细胞增殖实验方法检测对这一表位的应答。结果3例患者的MHCII类分子不完全相同。这一表位在已发表的34个HCV全长序列中高度保守，只在4个序列有1个氨基酸的差异。本实验发现，无论是两例长期HCV患者，还是1例HCVRNA转阴者，对此多肽的刺激均有较强的应答，刺激指数均大于3，而8例正常对照组均小于1.6。结论对HCVNS3区的这一辅助性T细胞表位的应答强度，不仅与HCV的自限性有关，而且与慢性HCV感染的发病状况有关。
, 百拇医药
关键词:丙型肝炎病毒；HLA；表位；辅助性T细胞；NS3区
中图号:R392.2 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0038-40
Proliferative response to an Th cell epitope within the
HCV NS3 domain by PBMC of HCV patients
WANG Tao
(Institute of Space Medico-Engineering, Beijing 100094)
QI Lian-quan XU Jun-jie GUO Hua-zhang WANG Hai-tao
, http://www.100md.com
(Insti-tute of Microbiology ＆ Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences)
JIN Bo-quan
(Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710033 )
Abstract:Aim To investigate the helper T cell response to an epitope within the NS3 domain in two chronic HCV carriers and one self-limited patient. Methods HLA type was determined by serotyping technique. An epitope(amino acids 1248 to 1264) was synthesized according to computer analysis and published articles. The epitope was analyzed within 34 HCV complete sequences in GenBank. Results The epitope was highly conserved in all sequences except that one amino acid difference was found in four sequences respectively. The HLA typ wasn't same in three patients.The levels of proliferative response to this epitope by PBMC from all three patients was higher than those from normal control. Conclusion The response to the epitope within HCV NS3 domain may not only have relationship to self-limited course of HCV infected patients,hut also to the disease condition of chronic HCV infected patients.
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Keywords: hepatitis C virus; HLA; epitope; helper T cell; NS3 domain
丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科的正链RNA病毒，能引起肝炎、肝硬化和肝癌。辅助性T淋巴细胞可通过分泌细胞因子，调节CD8+T细胞介导的杀伤作用，促进B细胞分泌免疫球蛋白调节免疫功能，因而在病毒免疫中起重要的作用〔1〕。近年来研究表明，辅助性T细胞应答与HCV急性感染的自限性有关。Diepolder等〔2〕发现, 对HCV NS3区抗原有强特异性辅助性T细胞应答的患者，HCV感染呈自限性发病过程；而弱或无T细胞应答的患者会发展为慢性肝炎。并找到1个位于NS3区中14个氨基酸的辅助性T细胞表位，能被大多数HLA-DR提呈给辅助性T细胞〔3〕，表明这一表位有可能与HCV患者HCV转阴和慢性HCV感染有关。我们检测了2例慢性HCV感染者和1例HCV转阴者对这一表位的应答,探讨了这一表位在慢性HCV感染者中的作用。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 慢性HCV患者(编号为94-1,291)和HCV转阴患者的系列血清，分别采于1991年～1998年。血样本于-20℃冻存备用。血清标本均经5’端非码区PCR扩增证实，为HCV RNA阳性，经PCR鉴定无乙型肝炎病毒(HBV)感染。2例研究对象来自河北省固安县自然村，他们于1987年献血时感染HCV；经询问1991年后未再输血，5 a来无自觉症状。正常对照组血清，采自8 例无偿献血者，均经血清学检测无HIV、HBV和HCV感染，血清转氨酶均正常。
1.2 方法 患者HLA分型用泰萨奇HLA一类分型干板(One Lambda公司)，对3例患者采用补体依赖的微量细胞毒方法，进行HLA血清学分型。多肽合成：用PE公司433A型多肽合成仪，以Fmoc法合成。经Bio-Rad公司HPLC分离纯化。多肽序列位于HCV NS3区(1248-1264，共14个氨基酸)。在GenBank中查出34个HCV基因的全序列，核苷酸序列用Goldkey(军事医学科学院软件)翻译成蛋白质序列，然后进行NS3区辅助性T细胞表位变化的分析。辅助性T细胞的应答：无菌取外周血，用淋巴细胞分层液(Phamacia公司)分离单个核细胞。用RPMI 1640培养液(Gibco公司)洗2次，加入含100 mL/L AB型血清的完全RPMI 1640培养液制成1×109/L，每孔加0.2 mL细胞于96孔板中，再加入20 μL 14肽(终质量浓度为10 mg/L)。在含50 mL/L CO2的培养箱中培养5 d，于细胞收获前12 h，每孔加入20 μL 925 MBq/L的3H-TdR(Ameshan公司)。将细胞收获于9999型滤纸上，自然风干后，置于含5 mL闪烁液的测量瓶中，用液体闪烁仪测定每分钟的脉冲数(cpm)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 HCV患者的临床资料 3例患者血清中病毒RNA及抗核心区抗体的检测， 所获结果见表1。
表 1 HCV感染患者临床资料
Tab 1 Clinical data for patients with hepatitis C infection NO.
Sex Age
(yr)
HBV
HCV RNA Anti-core domain Ab titer
1991
, http://www.100md.com
1994
1996
1998
1991
1994
1996
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*Detection of antibodies by second generation HCV ElISA kit
2.2 患者HLA分型与多肽合成 患者94-1号的HLA分型为：A11，30；B13，-；Bw4，-；DR52，53； DQ2,7;患者29-1号为: A2,11;B60(40),70;Bw6,-;DR8,15;DR52,-;DQ1,患者68-1号为：A2,A11;B40,55(22); Bw6,-;DR4,7;DR53,-;DQ2,-。HCV NS3区辅助性T细胞表位氨基酸合成的结果见图1。图1表明，合成多肽的纯度超过80%。
Position at drawing lines are mutated amino acid, HPCCGENOM of them is Hebei strain
, 百拇医药
图1 HCV NS3区辅助性T细胞表位的序列比较
Fig 1 Sequence comparison of helper T cell epitope in HCV NS3 domain
2.3 辅助性T细胞表位的序列比较 在GenBank中查出了34个HCV全基因序列，用Goldkey软件将其翻译成氨基酸序列的结果见图2。从图2中可以看出，由14个氨基酸组成的辅助性T细胞表位中，只有4个分离株的表位存在1个氨基酸的差异，说明此表位高度保守。
2.4 辅助性T细胞应答 两例慢性HCV携带者及1例HCV RNA转阴者，对HCV NS3区辅助性T细胞抗原表位的应答结果是：291号患者的刺激指数为3.29，941号患者为3.98，681号患者为3.81，刺激指数均大于3；而8例正常对照均小于1.6。
3 讨 论
, 百拇医药
T细胞在HCV清除和肝损害中都起重要的作用。丙型肝炎的发病机理十分复杂，有关CTL在HCV感染中的作用尚不完全明了。近年研究发现，辅助性T细胞在清除HCV感染中起重要的作用。辅助性T细胞在免疫应答中，主要通过T细胞受体识别病毒感染细胞表面的MHC II类分子与病毒源性短肽复合物，分泌细胞因子，从而起免疫调节作用。研究辅助性T细胞应答的主要方法，是用重组蛋白或多肽刺激患者的外周血淋巴细胞，培养5～7 d后，掺入同位素，测定刺激指数，大于3者为阳性〔4〕。Diepolder等〔1〕报道，对HCV NS3区抗原有强特异性辅助性T细胞应答的患者，HCV感染呈自限性发病过程；而弱或无T细胞应答的患者会发展为慢性肝炎。另外，找到了1个位于NS3区的由14个氨基酸组成的辅助性T细胞表位，能被大多数HLADR提呈给辅助性T细胞〔2〕。此外还发现，HCV痊愈的患者对E，C, NS4A和NS5区重组蛋白抗原和合成肽的增殖反应也有较强的辅助性T细胞应答〔5～7〕。上述结果表明，T细胞应答的强度与HCV感染的控制和疾病的转归有密切的关系。
, 百拇医药 本研究表明，有1例HCV转阴者，其外周血淋巴细胞对位于NS3区的由14个氨基酸组成的多肽有强的应答。而此患者经连续观察，不存在抗HCV抗体，表明对这一表位存在强的辅助性T细胞应答，可能是此患者转阴的主要原因。关于其机制可能是辅助性T细胞应答的增强，促进了CTL的杀伤作用所致；也可能是HCV感染患者转阴的原因之一。而2例 HCV携带者，在对其随访的7 a中，转氨酶均正常，也无明显不适，表明对此表位的辅助性T细胞应答与慢性HCV患者的发病状况有关。以上实验进一步证明，辅助性T细胞应答对在急性期能否清除病毒或慢性肝炎的病情状况有密切的关系。对临床治疗丙型肝炎和愈后判断也具有重要的指导意义。此外，由于此表位在HCV发表的序列中高度保守，而且3例患者的HLA各不相同，但仍有强的应答，说明此表位是T细胞疫苗的良好部位，从而为今后制备T细胞疫苗打下了良好的基础。
基金项目：国家自然基金重点基金资助项目No.39630020
作者简介：汪涛，男,34岁，博士
, http://www.100md.com
北京市圆明园西路1号，Tel.(010) 66365759
参考文献：
〔1〕 Bottomly KA. Functional dichotomy in CD4+ T lymphocyte〔J〕 . Immunol Today, 1988;9:268- 273.
〔2〕 Diepolder HM,Zachoval R,Hoffmann RM,et al. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to non-structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection〔J〕 . Lancet,1995;346:1006- 1007.
〔3〕 Diepolder HM,Gerlach JT,Zachoval R,et al. Immunodominant CD4+ T cell epitope within non-structural protein 3 in acute hepatitis C virus infection〔J〕 . J Virol, 1997;71(8):6011- 6019.
, http://www.100md.com
〔4〕 Lechmann ML,Ihlenfeldt HG,Braunschweiger I,et al.T-and B-cell responses to different hepatitis C virus antigens in patients with chronic hepatitis C infection and in healthy anti-hepatitis C virus-positive blood donors without viremia〔J〕 .Hepatology,1996;24(4):790-795.
〔5〕 Missale G,Bertoni R,larmonaca V, et al.Different clinical behaviors of acute hepatitis C virus infection are associated with different vigor of the antiviral cell-mediated immune response〔J〕 .J Clin Invest,1996;98:706- 714.
, http://www.100md.com
〔6〕 Ferrari C,Valli A,Galati L,et al.T-cell response to structural and non-structrual hepatitis C virus antigens in persistent and self limited hepatitis C virus infections〔J〕 . Hepatology, 1994; 19:286- 295.
〔7〕 Leroux-Roel G,Esquivel CA,Deleys R,et al. lympho-proliferative response to hepatitis C virus core,E1,E2 and NS3 in patients with chronic hepatitis C infection treated with interferon alpha〔J〕 . Hepotology, 1996;23:8- 16.
收稿日期：1999-03-30
修回日期：1999-06-15, 百拇医药