β-转化生长因子对异种骨移植局部白细胞介素6 mRNA表达的影响
作者：徐虎 胡蕴玉
单位：(710032 西安，第四军医大学西京医院骨科研究所)
关键词：
中华医学杂志000125 白细胞介素6(IL-6)是一种B细胞刺激因子，可由多种细胞表达或分泌, 对于细胞免疫和体液免疫都具有重要的调节作用, 在骨组织中与骨吸收关系密切[1]。β-转化生长因子(TGF-β)是一种可由多种细胞分泌的多功能细胞因子,生物学作用广泛, 可调节多种正常细胞或瘤性细胞的生长、分化[2]。有关异种骨移植局部免疫因子的表达与定位以及TGF-β对该局部细胞因子的调节作用国内外报道很少, 我们将TGF-β复合于牛松质骨载体后植入小鼠股部肌肉内, 并应用原位杂交技术检测了其局部IL-6 mRNA表达与细胞定位,现将结果报道如下。
一、材料和方法
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1. TGF-β的提取及活性试验：TGF-β由本所根据Assoian等[3]的方法自行提取。将TGF-β注射于出生1d小鼠皮下，0 h，24 h和48 h各注射1次，第72h取材，HE染色。
2. 牛松质骨载体的制备及TGF-β的复合：取新鲜小牛骨松质，切成边长3 mm的正方体，水洗2 h，氯仿/甲醇脱脂10 h，过氧化氢选择性脱蛋白8h，0.6 mol/L盐酸脱钙1 min，蒸馏水冲洗浸泡30 min，冻干即为松质骨载体。将TGF-β溶于20 mmol/L HCl，在负压下与松质骨载体混合15 min，透析48 h，冻干即为复合载体。
3. 动物及标本的处理：Balb/c鼠72只，随机分为A, B, C，3组，在A组小鼠左侧股部肌间隙植入复合TGF-β牛松质骨载体，B组植入单纯牛松质骨载体，每只小鼠植1粒，C组为空白对照。术后4, 7, 14和21 d每组各处死6只小鼠，取载体及周围包绕的软组织，C组取股部肌肉，HE染色。
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4. 原位杂交检测方法：切片脱蜡后酒精至水, 0.2 mol/L HCl浸泡10 min, 10 μg/ml蛋白酶K消化30 min，地高辛标记的IL-6 cDNA探针(深圳晶美公司)100℃水浴10 min，42℃杂交18 h，梯度SSC洗涤，封闭30 min，加地高辛抗体，37℃，2 h，NBT暗处显色，核固红衬染。
5. 对照试验：用慢性乙型肝炎标本与待检标本同时进行原位杂交检测作为阳性对照。 用PBS取代cDNA探针作为空白对照, 另外用RNA酶预处理切片后作原位杂交。
6. 图像分析：将原位杂交组织切片显微照相, 照片经Microtek E6扫描仪采入计算机, Photoshop V4.0软件分析, SPSS统计软件处理数据。
二、结果
1. TGF-β活性试验：光镜下观察，在注射TGF-β的局部皮下可见明显的组织增生现象，大量成纤维细胞，间充质细胞，巨噬细胞及粒细胞聚集，并有大量成纤维细胞包绕的新生毛细血管，表明TGF-β活性良好。
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2. 大体观察：在小鼠骨移植术后至伤口愈合期间(约7～10 d)，移植部位可见一包块，触诊质中等硬度。 14 d后包块明显增大, 质偏硬, 21 d后, 质硬, 与周围组织粘连, 不易推动。
3. 组织学观察：术后4 d, A, B组牛松质骨载体周围可见大量间充质细胞及成纤维细胞增生, 单核-巨噬细胞和中性粒细胞浸润, 7 d时, 载体周边细胞增殖及聚集现象更加明显,增生组织形成纤维环包绕载体, 14 d和21 d, 纤维结缔组织更加致密, 并侵入载体的孔隙内, 使载体破碎, 可见新生的毛细血管, 载体边缘可见散在的多核巨细胞。
4. 原位杂交检测结果：术后4, 7, 14 d和21 d, A, B组小鼠植骨局部皆可检测到IL-6 mRNA的阳性表达。蓝色或蓝紫色的阳性颗粒定位于多种类型的细胞胞核及胞浆中。4d时, IL-6 mRNA主要表达于增生组织中浸润的单核细胞, 巨噬细胞, 中性粒细胞。7d时,牛松质骨载体周围一些单核细胞, 巨噬细胞, 成纤维细胞和中性粒细胞阳性表达IL-6 mRNA。14和21d时, IL-6 mRNA主要定位于一些成纤维细胞, 血管内皮细胞, 血管平滑肌细胞及多核巨细胞中。
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5. 对照试验：用RNA酶进行预处理后杂交, 用PBS取代cDNA探针, 及C组的肌肉组织, 检测结果均为阴性。慢性乙型肝炎标本检测结果为强阳性。
6. 图像分析：A, B两组IL-6 mRNA表达量的峰值皆出现于14d时, A组IL-6 mRNA表达量在各时间点均低于B组(P<0.01，表1)。
表1 异种骨移植局部IL-6mRNA的表达(
±
) 组别
鼠数
移植后4d
7d
14d
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21d
A
24
73±5△
102±8△
119±7△
110±6△
B
24
107±5
139±6
170±5
, 百拇医药
145±8
注：与B组比较△P<0.01 三、讨论
近年来的研究发现IL-6还可表达于成骨细胞和软骨细胞[4]，一些体外实验发现IL-6可抑制骨生成或促进骨吸收作用[5]。而TGF-β对骨组织及免疫系统呈现出双向式的调节作用。本研究中，通过对IL-6 mRNA在异种骨移植局部不同时间表达量的统计学分析，我们发现IL-6 mRNA在复合TGF-β载体组和单纯载体组中表达的峰值皆出现于移植术后14d, 而复合TGF-β载体组IL-6 mRNA表达量明显较单纯移植组低, 表明TGF-β在异种骨移植局部可以下调IL-6 mRNA的表达水平。这一点提示TGF-β可以通过调节IL-6 mRNA的表达水平来参与异种骨移植局部的免疫反应, 可能会成为降低骨移植局部免疫反应的一条途径。
本研究结果，表明了在异种骨移植局部多种类型细胞可表达IL-6 mRNA, 阳性表达细胞的类型随移植术后时间而转变。TGF-β可下调骨移植局部IL-6 mRNA的表达水平。■
, 百拇医药
基金项目： 国家自然科学基金资助项目(39570709)
参考文献：
[1]Jones TH. Interleukin-6 an endocrine cytokine. Clin Endocrinol, 1994, 40:703-713.
[2]Lawrence DA. Transforming growth factor-β:An &127;overview. Kid Internat， 1995, 47 suppl 49:s19.
[3]Assoian RK, Komoriya A, Meyers CA, et al. Transforming growth factor-β in human platelets. J Bio Chem, 1983, 258:7155.
, 百拇医药
[4]Ishimi Y, Miyura C, Jin CH, et al. IL-6 is produced by osteoblasts and induces bone resorption. J I mmunol, 1990, 145:3297-3303.
[5]Harris SE, Bonewald LF, Harris MA, et al. Effects of TGF-β&127;on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein-2, osteocalin, osteopontin, alkaline phosphatase and type I collagen mRNA in prolonged cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. J Bone Miner Res, 1994, 9:855.
收稿日期：1999-01-04, 百拇医药
单位：(710032 西安，第四军医大学西京医院骨科研究所)
关键词：
中华医学杂志000125 白细胞介素6(IL-6)是一种B细胞刺激因子，可由多种细胞表达或分泌, 对于细胞免疫和体液免疫都具有重要的调节作用, 在骨组织中与骨吸收关系密切[1]。β-转化生长因子(TGF-β)是一种可由多种细胞分泌的多功能细胞因子,生物学作用广泛, 可调节多种正常细胞或瘤性细胞的生长、分化[2]。有关异种骨移植局部免疫因子的表达与定位以及TGF-β对该局部细胞因子的调节作用国内外报道很少, 我们将TGF-β复合于牛松质骨载体后植入小鼠股部肌肉内, 并应用原位杂交技术检测了其局部IL-6 mRNA表达与细胞定位,现将结果报道如下。
一、材料和方法
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1. TGF-β的提取及活性试验：TGF-β由本所根据Assoian等[3]的方法自行提取。将TGF-β注射于出生1d小鼠皮下，0 h，24 h和48 h各注射1次，第72h取材，HE染色。
2. 牛松质骨载体的制备及TGF-β的复合：取新鲜小牛骨松质，切成边长3 mm的正方体，水洗2 h，氯仿/甲醇脱脂10 h，过氧化氢选择性脱蛋白8h，0.6 mol/L盐酸脱钙1 min，蒸馏水冲洗浸泡30 min，冻干即为松质骨载体。将TGF-β溶于20 mmol/L HCl，在负压下与松质骨载体混合15 min，透析48 h，冻干即为复合载体。
3. 动物及标本的处理：Balb/c鼠72只，随机分为A, B, C，3组，在A组小鼠左侧股部肌间隙植入复合TGF-β牛松质骨载体，B组植入单纯牛松质骨载体，每只小鼠植1粒，C组为空白对照。术后4, 7, 14和21 d每组各处死6只小鼠，取载体及周围包绕的软组织，C组取股部肌肉，HE染色。
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4. 原位杂交检测方法：切片脱蜡后酒精至水, 0.2 mol/L HCl浸泡10 min, 10 μg/ml蛋白酶K消化30 min，地高辛标记的IL-6 cDNA探针(深圳晶美公司)100℃水浴10 min，42℃杂交18 h，梯度SSC洗涤，封闭30 min，加地高辛抗体，37℃，2 h，NBT暗处显色，核固红衬染。
5. 对照试验：用慢性乙型肝炎标本与待检标本同时进行原位杂交检测作为阳性对照。 用PBS取代cDNA探针作为空白对照, 另外用RNA酶预处理切片后作原位杂交。
6. 图像分析：将原位杂交组织切片显微照相, 照片经Microtek E6扫描仪采入计算机, Photoshop V4.0软件分析, SPSS统计软件处理数据。
二、结果
1. TGF-β活性试验：光镜下观察，在注射TGF-β的局部皮下可见明显的组织增生现象，大量成纤维细胞，间充质细胞，巨噬细胞及粒细胞聚集，并有大量成纤维细胞包绕的新生毛细血管，表明TGF-β活性良好。
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2. 大体观察：在小鼠骨移植术后至伤口愈合期间(约7～10 d)，移植部位可见一包块，触诊质中等硬度。 14 d后包块明显增大, 质偏硬, 21 d后, 质硬, 与周围组织粘连, 不易推动。
3. 组织学观察：术后4 d, A, B组牛松质骨载体周围可见大量间充质细胞及成纤维细胞增生, 单核-巨噬细胞和中性粒细胞浸润, 7 d时, 载体周边细胞增殖及聚集现象更加明显,增生组织形成纤维环包绕载体, 14 d和21 d, 纤维结缔组织更加致密, 并侵入载体的孔隙内, 使载体破碎, 可见新生的毛细血管, 载体边缘可见散在的多核巨细胞。
4. 原位杂交检测结果：术后4, 7, 14 d和21 d, A, B组小鼠植骨局部皆可检测到IL-6 mRNA的阳性表达。蓝色或蓝紫色的阳性颗粒定位于多种类型的细胞胞核及胞浆中。4d时, IL-6 mRNA主要表达于增生组织中浸润的单核细胞, 巨噬细胞, 中性粒细胞。7d时,牛松质骨载体周围一些单核细胞, 巨噬细胞, 成纤维细胞和中性粒细胞阳性表达IL-6 mRNA。14和21d时, IL-6 mRNA主要定位于一些成纤维细胞, 血管内皮细胞, 血管平滑肌细胞及多核巨细胞中。
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5. 对照试验：用RNA酶进行预处理后杂交, 用PBS取代cDNA探针, 及C组的肌肉组织, 检测结果均为阴性。慢性乙型肝炎标本检测结果为强阳性。
6. 图像分析：A, B两组IL-6 mRNA表达量的峰值皆出现于14d时, A组IL-6 mRNA表达量在各时间点均低于B组(P<0.01，表1)。
表1 异种骨移植局部IL-6mRNA的表达(
±) 组别鼠数
移植后4d
7d
14d
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21d
A
24
73±5△
102±8△
119±7△
110±6△
B
24
107±5
139±6
170±5
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145±8
注：与B组比较△P<0.01 三、讨论
近年来的研究发现IL-6还可表达于成骨细胞和软骨细胞[4]，一些体外实验发现IL-6可抑制骨生成或促进骨吸收作用[5]。而TGF-β对骨组织及免疫系统呈现出双向式的调节作用。本研究中，通过对IL-6 mRNA在异种骨移植局部不同时间表达量的统计学分析，我们发现IL-6 mRNA在复合TGF-β载体组和单纯载体组中表达的峰值皆出现于移植术后14d, 而复合TGF-β载体组IL-6 mRNA表达量明显较单纯移植组低, 表明TGF-β在异种骨移植局部可以下调IL-6 mRNA的表达水平。这一点提示TGF-β可以通过调节IL-6 mRNA的表达水平来参与异种骨移植局部的免疫反应, 可能会成为降低骨移植局部免疫反应的一条途径。
本研究结果，表明了在异种骨移植局部多种类型细胞可表达IL-6 mRNA, 阳性表达细胞的类型随移植术后时间而转变。TGF-β可下调骨移植局部IL-6 mRNA的表达水平。■
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基金项目： 国家自然科学基金资助项目(39570709)
参考文献：
[1]Jones TH. Interleukin-6 an endocrine cytokine. Clin Endocrinol, 1994, 40:703-713.
[2]Lawrence DA. Transforming growth factor-β:An &127;overview. Kid Internat， 1995, 47 suppl 49:s19.
[3]Assoian RK, Komoriya A, Meyers CA, et al. Transforming growth factor-β in human platelets. J Bio Chem, 1983, 258:7155.
, 百拇医药
[4]Ishimi Y, Miyura C, Jin CH, et al. IL-6 is produced by osteoblasts and induces bone resorption. J I mmunol, 1990, 145:3297-3303.
[5]Harris SE, Bonewald LF, Harris MA, et al. Effects of TGF-β&127;on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein-2, osteocalin, osteopontin, alkaline phosphatase and type I collagen mRNA in prolonged cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. J Bone Miner Res, 1994, 9:855.
收稿日期：1999-01-04, 百拇医药