CTLA4Ig基因表达对鼠心脏移植免疫抑制作用的研究
作者：梅广林 林众治 横山逸男 高木弘
单位：梅广林(南通医学院附属医院普外科，南通226001)；林众治 横山逸男 高木弘(日本国名古屋大学医学部第二外科移植教研室)
关键词：腺病毒载体；CTLA4Ig；心脏移植；排斥反应；反转录聚合酶链反应；大鼠
南通医学院学报000106[摘 要] 大鼠DA和Lewis分别作为移植的供受体。心脏移植前1周，用腺病毒作载体将CTLA4Ig基因导入Lewis鼠体内，研究该基因在鼠体内的表达以及对同种心脏移植后的免疫抑制作用。以编码β-半乳糖苷酶有复制缺陷的腺病毒重组体(Adex/Lac E)为对照组。RT-PCR法检测基因的表达，并用流式细胞仪测定CTLA4Ig蛋白质浓度变化。用移植物生存时间判断免疫抑制效果。结果显示：导入鼠体内的CTLA4Ig基因能够在鼠的肝脏中表达，并使其表达产物CTLA4Ig在血中浓度明显高于对照组(P<0.05)。而且移植心脏的生存时间显著长于对照组(P<0.05)。实验表明CTLA4Ig基因能在鼠体内良好表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R654.2 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0016-02
ADENOVIRUS-MEDIATED TRANSFER OF CTLA4Ig GENE RESULTS IN
PROLONGED SURVIVAL OF HEART ALOGRAFT
MEI Guanglin
(Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001)
Hayshi S Yokoyarna I Takagi H
, http://www.100md.com
(Department SurgeryⅡ,Nagoya University School of Medic,Nagaya,Japan)
[Abstract] The study of CTLA4Ig's expression and its products immunoinhibition after the CTLA4Ig gene cloned in adenovirus was introduced into the recipient rat during heart allograft.The replication-defective recombinant adenovirus encoding the Escherichia coli Lacz gene,cable of producing the enzyme β-galactosidase was used as control.RT-PCR was employed to detect the expression of CTLA4Ig gene in the recipient rat and,flow cytometer was used to monitor the blood concentration of CTLA4Ig product.The experiments showed that the transfected CTLA4Ig gene could express highly in the recipient rat liver and its products were able to remarkably prolong survival of heart allograft(P<0.05).Therefore CTLA4Ig can be considered to have strong inhibitory effect on the immune rejection of allograft organs.
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[Key words] adenovirus vector;CTLA4Ig;heart allograft;rejection;RT-PCR;rats
作者利用大鼠DA和Lewis分别作为供、受体，在心脏移植前1周，用腺病毒作为载体将CTLA4Ig基因导入Lewis鼠体内，来研究该基因在鼠体内的表达以及对同种异体心脏移植排斥反应的抑制作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物 纯系雄鼠DA(Rt 1a)和Lewis(Rt 1L)，体重为250～300g，分别作为移植的供体和受体。实验动物均在标准条件下喂养。
1.2 心脏移植 采用异位心脏移植，即将供体的心脏移植在受体的颈部。血管吻合采用Cuff分别将供体的主动脉、肺动脉与受体的颈动、静脉吻合。移植术后通过每天的心脏触诊对移植心脏进行监控，当移植心脏停跳时，考虑为排斥反应所致，立即取出心脏用福尔马林固定，用病理组织学检查证实。
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1.3 腺病毒载体 以编码β-半乳糖苷酶的有复制缺陷的Z腺病毒重组体(Adex/LacE)为对照组。表达人CTLA4Ig cDNA的重组腺病毒(Adex/h CTLA4Ig)的构建，是通过具有表达该基因的cosmid与亲代病毒基因组间进行同源重组而成。产生重组腺病毒的方法是在Saito基础上修改后使用[1]。重组腺病毒进一步在293细胞中扩增，病毒溶液在-80℃的低温下保存。
1.4 实验分组及载体转染 (1)对照组：心脏移植前7天，从Lewis鼠的尾静脉注射含有LacZ基因的病毒液1×108PFU(n=5)；(2)基因转染组：心脏移植前7天，从Lewis鼠的尾静脉注射含有CTLA4Ig基因的病毒液1×108PFU(n=5)。
1.5 反转录聚合酶链反应(RT-PCR) 用导有CTLA4Ig基因鼠的冰冻肝组织约50mg，提取总RNA和逆转cDNA。其方法分别依据RNA extract kit of Nippon Gene Company 和 Supper ScriptTM preamplification System for First Strand cDNA Synthesis of GIBCOBRL所描写的标准方法。然后根据CTLA4Ig DNA的序列，使用5’-TACGGCAACCTACATGA-3’和5’-GGTGTACCATGCACGACAAC-3’两个引物进行多聚酶链反应。扩增的cDNA用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，β-actin cDNA作为标准分子量。非转染肝组织样品作为对照。
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1.6 血中CTLA4Ig浓度的测定 用基因转染组被检测血浆100μl，与5×105个导有B7基因小鼠成纤维细胞(NIH3T3/B7.1)混合，再加入抗人的CTLA4Ig荧光抗体100μl(Ig-FITC 50mg/ml，购自丹麦DAKO)后，用流式细胞仪检测。
2 结 果
2.1 移植心脏生存时间 对照组移植心脏生存时间均为6天，基因转染组生存时间为8～14天，平均11天，两组比较差异有显著性(P<0.05)。
2.2 移植手术前、后血中CTLA4Ig浓度 对照组和基因转移组移植前血中CTLA4Ig浓度分别为0.44μl/ml和1.96μl/ml；术后移植心脏停跳时血中浓度分别为0.44μl/ml和0.6μl/ml。
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2.3 RT-PCR结果 在使用了CTLA4Ig引物，通过DNA电泳发现，从基因转染组鼠的肝脏中提取的总mRNA样品中，能特异扩增出CTLA4Ig cDNA(条带1)；而从对照组鼠的肝脏中提取的总mRNA样品中没有特异扩增信号(条带3)。用β-actin引物，上述两组样品均出现β-actin条带(条带2、4)。见图1。
图1 DNA电泳结果
3 讨 论
同种移植抗原被T细胞识别，并经抗原提呈细胞(APC)处理后提呈给T细胞，在抗原的刺激下使T细胞被激活，从而产生免疫应答反应。这是同种移植排斥反应的主要机理。作者推测通过APC所传递的协同刺激信号有控制对移植免疫反应的功能[2]。目前已证实，在T细胞对移植物的排斥反应过程中，如果缺乏粘附分子提供的协同刺激信号，T细胞将不能被激活[3]。Lin Y等[4]报道，已弄清了一些存在于APCs表面参与协同刺激的分子。如在小鼠同种心脏移植中，阻断ICAM-1/LFA-1的信号传递，可诱导对移植物的免疫耐受[5]。体外实验证明，在同种移植排斥反应中，CD28/B7分子对是提供T细胞激活信号的分子之一[6]。Freeman GJ等[7]报道，在APCs表面存在的B7分子作为CD28和CTLA4Ig的配体，在有抗原刺激的前提下，当CD28与B7结合时，T细胞被激活；而CTLA4Ig与B7结合时，T细胞不能被激活。从而抑制同种移植的排斥反应。本组实验应用腺病毒作为载体，将CTLA4Ig基因导入受体体内，通过CTLA4Ig与B7结合而竞争性抑制由CD28/B7产生的协同刺激信号，达到了抗排斥反应的目的。对照组移植心脏平均存活时间为6.0天，而基因转染组为11.0天(P<0.05)。移植物的存活时间与基因病毒液的用量和表达产物的血中浓度有关。Namii等[8]报道其用量为1×109PFU，而本实验为1×108PFU，虽然用量减少了10倍，但抑制排斥反应效果明显(P<0.05)。其结果表明：在对同种移植排斥反应有明显抑制效果的前提下，可以适当减少病毒液用量，以减少病毒感染所引起的并发症和副作用的发生率。这可以对今后临床开发利用病毒作为载体进行基因治疗提供参考。
, 百拇医药
本实验DNA电泳结果显示，在使用了CTLA4Ig引物，从基因转染组鼠肝脏中提取的总mRNA样品能特异扩增出CTLA4Ig cDNA(条带1)；而对照组鼠肝脏为阴性结果。用β-actin引物，上述两种状态下的样品均出现β-actin带(条带2、4)。这一结果与Hayashi.S等[9]报道一致，CTLA4Ig基因导入后主要在肝脏中表达。其表达时间一般在1周左右，这就是为何选择基因导入后1周进行心脏移植之依据。为证实移植手术时基因确已表达，术前常规检测CTLA4Ig基因表达产物的浓度。本组基因转染组血中平均浓度为1.96μl/ml。其浓度的高低和在血中持续时间与基因病毒液的用量有关，随着用量的增加血中浓度和持续时间会相应提高和延长，但进入人体内的病毒量也会增加，就会出现病毒感染的并发症，重者可致死亡。本实验在移植心脏未停跳前没有追踪血中表达产物浓度，而是在停跳时检测，即术后浓度。因为当移植心脏停跳时，考虑为排斥反应所致。此时由于血中CTLA4Ig参与了抗排斥反应而被消耗，浓度降至或接近对照组水平。平均为0.6μl/ml。所有停跳心脏标本均经病理组织学检查为典型的排斥反应。
, 百拇医药
本文结果提示：应用腺病毒载体导入CTLA4Ig基因对同种移植排斥反应有明显抑制作用。
[参考文献]
[1] Saito I,Oya Y,Yamamoto K,et al.Construction of Nondefective adenovirus type 5 bearing a 2.8-Kilobase hepatitis B virus DNA near the right end of its fenome[J]. J Virology,1985,54∶711.
[2] Lafferty KJ,Prowse SJ,Simeonovic CJ.Immunobiology of tissue transplantation:a return to the passenger leukocyte concept[J]. Ann Rev Immunol,1983,1∶143.
, 百拇医药
[3] Jenkins MK,Burrell E,Ashwell JD.Antgen pressentative by resting B cells:effectiveness at inducing T cell proliferation is determined by costimulatory signals,not T cell receptor occupany[J]. J Immunol,1990,144∶1585.
[4] Lin Y,Linsley PS.Costimulation of T cell growth[J]. Gurr Opin Immunol,1992,4∶265.
[5] Isobe M,Yagita H,Okumura K,et al.Specific acceptance of cardiac allograft after treatment with antibodies to ICAM-1 and LFA[J]. Science,1992,255∶1125.
, 百拇医药
[6] Boussiotis VA,Freeman GJ,Gray G,et al.B7 but not intercellular adhision molecule-1 costimutation prevents the induction of human alloantigen-specific tolexrance[J]. J exp Med,1993,178∶1753.
[7] Freeman GJ,Gribben JG,Boussiotis VA,et al.Cloning of B7-2 a CTLA4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation[J]. Science,1993,262∶909.
[8] Namii Y,Hayashi S.Evidence that the adenoviral vector contaning the CTLA4Ig Gene improves transgene expression and graft survival[J]. Transplantation Prceedings,1997,29∶1738.
[9] Hayashi S,Namii Y.Effect of CTLA4Ig gene transfer using adnoviral vector in organ and cell transplantation[J]. Transplantation Proceedings,1997,29∶2212.
(1999-09-06收稿), http://www.100md.com
单位：梅广林(南通医学院附属医院普外科，南通226001)；林众治 横山逸男 高木弘(日本国名古屋大学医学部第二外科移植教研室)
关键词：腺病毒载体；CTLA4Ig；心脏移植；排斥反应；反转录聚合酶链反应；大鼠
南通医学院学报000106[摘 要] 大鼠DA和Lewis分别作为移植的供受体。心脏移植前1周，用腺病毒作载体将CTLA4Ig基因导入Lewis鼠体内，研究该基因在鼠体内的表达以及对同种心脏移植后的免疫抑制作用。以编码β-半乳糖苷酶有复制缺陷的腺病毒重组体(Adex/Lac E)为对照组。RT-PCR法检测基因的表达，并用流式细胞仪测定CTLA4Ig蛋白质浓度变化。用移植物生存时间判断免疫抑制效果。结果显示：导入鼠体内的CTLA4Ig基因能够在鼠的肝脏中表达，并使其表达产物CTLA4Ig在血中浓度明显高于对照组(P<0.05)。而且移植心脏的生存时间显著长于对照组(P<0.05)。实验表明CTLA4Ig基因能在鼠体内良好表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。
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[中图分类号] R654.2 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0016-02
ADENOVIRUS-MEDIATED TRANSFER OF CTLA4Ig GENE RESULTS IN
PROLONGED SURVIVAL OF HEART ALOGRAFT
MEI Guanglin
(Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001)
Hayshi S Yokoyarna I Takagi H
, http://www.100md.com
(Department SurgeryⅡ,Nagoya University School of Medic,Nagaya,Japan)
[Abstract] The study of CTLA4Ig's expression and its products immunoinhibition after the CTLA4Ig gene cloned in adenovirus was introduced into the recipient rat during heart allograft.The replication-defective recombinant adenovirus encoding the Escherichia coli Lacz gene,cable of producing the enzyme β-galactosidase was used as control.RT-PCR was employed to detect the expression of CTLA4Ig gene in the recipient rat and,flow cytometer was used to monitor the blood concentration of CTLA4Ig product.The experiments showed that the transfected CTLA4Ig gene could express highly in the recipient rat liver and its products were able to remarkably prolong survival of heart allograft(P<0.05).Therefore CTLA4Ig can be considered to have strong inhibitory effect on the immune rejection of allograft organs.
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[Key words] adenovirus vector;CTLA4Ig;heart allograft;rejection;RT-PCR;rats
作者利用大鼠DA和Lewis分别作为供、受体，在心脏移植前1周，用腺病毒作为载体将CTLA4Ig基因导入Lewis鼠体内，来研究该基因在鼠体内的表达以及对同种异体心脏移植排斥反应的抑制作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物 纯系雄鼠DA(Rt 1a)和Lewis(Rt 1L)，体重为250～300g，分别作为移植的供体和受体。实验动物均在标准条件下喂养。
1.2 心脏移植 采用异位心脏移植，即将供体的心脏移植在受体的颈部。血管吻合采用Cuff分别将供体的主动脉、肺动脉与受体的颈动、静脉吻合。移植术后通过每天的心脏触诊对移植心脏进行监控，当移植心脏停跳时，考虑为排斥反应所致，立即取出心脏用福尔马林固定，用病理组织学检查证实。
, http://www.100md.com
1.3 腺病毒载体 以编码β-半乳糖苷酶的有复制缺陷的Z腺病毒重组体(Adex/LacE)为对照组。表达人CTLA4Ig cDNA的重组腺病毒(Adex/h CTLA4Ig)的构建，是通过具有表达该基因的cosmid与亲代病毒基因组间进行同源重组而成。产生重组腺病毒的方法是在Saito基础上修改后使用[1]。重组腺病毒进一步在293细胞中扩增，病毒溶液在-80℃的低温下保存。
1.4 实验分组及载体转染 (1)对照组：心脏移植前7天，从Lewis鼠的尾静脉注射含有LacZ基因的病毒液1×108PFU(n=5)；(2)基因转染组：心脏移植前7天，从Lewis鼠的尾静脉注射含有CTLA4Ig基因的病毒液1×108PFU(n=5)。
1.5 反转录聚合酶链反应(RT-PCR) 用导有CTLA4Ig基因鼠的冰冻肝组织约50mg，提取总RNA和逆转cDNA。其方法分别依据RNA extract kit of Nippon Gene Company 和 Supper ScriptTM preamplification System for First Strand cDNA Synthesis of GIBCOBRL所描写的标准方法。然后根据CTLA4Ig DNA的序列，使用5’-TACGGCAACCTACATGA-3’和5’-GGTGTACCATGCACGACAAC-3’两个引物进行多聚酶链反应。扩增的cDNA用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，β-actin cDNA作为标准分子量。非转染肝组织样品作为对照。
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1.6 血中CTLA4Ig浓度的测定 用基因转染组被检测血浆100μl，与5×105个导有B7基因小鼠成纤维细胞(NIH3T3/B7.1)混合，再加入抗人的CTLA4Ig荧光抗体100μl(Ig-FITC 50mg/ml，购自丹麦DAKO)后，用流式细胞仪检测。
2 结 果
2.1 移植心脏生存时间 对照组移植心脏生存时间均为6天，基因转染组生存时间为8～14天，平均11天，两组比较差异有显著性(P<0.05)。
2.2 移植手术前、后血中CTLA4Ig浓度 对照组和基因转移组移植前血中CTLA4Ig浓度分别为0.44μl/ml和1.96μl/ml；术后移植心脏停跳时血中浓度分别为0.44μl/ml和0.6μl/ml。
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2.3 RT-PCR结果 在使用了CTLA4Ig引物，通过DNA电泳发现，从基因转染组鼠的肝脏中提取的总mRNA样品中，能特异扩增出CTLA4Ig cDNA(条带1)；而从对照组鼠的肝脏中提取的总mRNA样品中没有特异扩增信号(条带3)。用β-actin引物，上述两组样品均出现β-actin条带(条带2、4)。见图1。
图1 DNA电泳结果
3 讨 论
同种移植抗原被T细胞识别，并经抗原提呈细胞(APC)处理后提呈给T细胞，在抗原的刺激下使T细胞被激活，从而产生免疫应答反应。这是同种移植排斥反应的主要机理。作者推测通过APC所传递的协同刺激信号有控制对移植免疫反应的功能[2]。目前已证实，在T细胞对移植物的排斥反应过程中，如果缺乏粘附分子提供的协同刺激信号，T细胞将不能被激活[3]。Lin Y等[4]报道，已弄清了一些存在于APCs表面参与协同刺激的分子。如在小鼠同种心脏移植中，阻断ICAM-1/LFA-1的信号传递，可诱导对移植物的免疫耐受[5]。体外实验证明，在同种移植排斥反应中，CD28/B7分子对是提供T细胞激活信号的分子之一[6]。Freeman GJ等[7]报道，在APCs表面存在的B7分子作为CD28和CTLA4Ig的配体，在有抗原刺激的前提下，当CD28与B7结合时，T细胞被激活；而CTLA4Ig与B7结合时，T细胞不能被激活。从而抑制同种移植的排斥反应。本组实验应用腺病毒作为载体，将CTLA4Ig基因导入受体体内，通过CTLA4Ig与B7结合而竞争性抑制由CD28/B7产生的协同刺激信号，达到了抗排斥反应的目的。对照组移植心脏平均存活时间为6.0天，而基因转染组为11.0天(P<0.05)。移植物的存活时间与基因病毒液的用量和表达产物的血中浓度有关。Namii等[8]报道其用量为1×109PFU，而本实验为1×108PFU，虽然用量减少了10倍，但抑制排斥反应效果明显(P<0.05)。其结果表明：在对同种移植排斥反应有明显抑制效果的前提下，可以适当减少病毒液用量，以减少病毒感染所引起的并发症和副作用的发生率。这可以对今后临床开发利用病毒作为载体进行基因治疗提供参考。
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本实验DNA电泳结果显示，在使用了CTLA4Ig引物，从基因转染组鼠肝脏中提取的总mRNA样品能特异扩增出CTLA4Ig cDNA(条带1)；而对照组鼠肝脏为阴性结果。用β-actin引物，上述两种状态下的样品均出现β-actin带(条带2、4)。这一结果与Hayashi.S等[9]报道一致，CTLA4Ig基因导入后主要在肝脏中表达。其表达时间一般在1周左右，这就是为何选择基因导入后1周进行心脏移植之依据。为证实移植手术时基因确已表达，术前常规检测CTLA4Ig基因表达产物的浓度。本组基因转染组血中平均浓度为1.96μl/ml。其浓度的高低和在血中持续时间与基因病毒液的用量有关，随着用量的增加血中浓度和持续时间会相应提高和延长，但进入人体内的病毒量也会增加，就会出现病毒感染的并发症，重者可致死亡。本实验在移植心脏未停跳前没有追踪血中表达产物浓度，而是在停跳时检测，即术后浓度。因为当移植心脏停跳时，考虑为排斥反应所致。此时由于血中CTLA4Ig参与了抗排斥反应而被消耗，浓度降至或接近对照组水平。平均为0.6μl/ml。所有停跳心脏标本均经病理组织学检查为典型的排斥反应。
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本文结果提示：应用腺病毒载体导入CTLA4Ig基因对同种移植排斥反应有明显抑制作用。
[参考文献]
[1] Saito I,Oya Y,Yamamoto K,et al.Construction of Nondefective adenovirus type 5 bearing a 2.8-Kilobase hepatitis B virus DNA near the right end of its fenome[J]. J Virology,1985,54∶711.
[2] Lafferty KJ,Prowse SJ,Simeonovic CJ.Immunobiology of tissue transplantation:a return to the passenger leukocyte concept[J]. Ann Rev Immunol,1983,1∶143.
, 百拇医药
[3] Jenkins MK,Burrell E,Ashwell JD.Antgen pressentative by resting B cells:effectiveness at inducing T cell proliferation is determined by costimulatory signals,not T cell receptor occupany[J]. J Immunol,1990,144∶1585.
[4] Lin Y,Linsley PS.Costimulation of T cell growth[J]. Gurr Opin Immunol,1992,4∶265.
[5] Isobe M,Yagita H,Okumura K,et al.Specific acceptance of cardiac allograft after treatment with antibodies to ICAM-1 and LFA[J]. Science,1992,255∶1125.
, 百拇医药
[6] Boussiotis VA,Freeman GJ,Gray G,et al.B7 but not intercellular adhision molecule-1 costimutation prevents the induction of human alloantigen-specific tolexrance[J]. J exp Med,1993,178∶1753.
[7] Freeman GJ,Gribben JG,Boussiotis VA,et al.Cloning of B7-2 a CTLA4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation[J]. Science,1993,262∶909.
[8] Namii Y,Hayashi S.Evidence that the adenoviral vector contaning the CTLA4Ig Gene improves transgene expression and graft survival[J]. Transplantation Prceedings,1997,29∶1738.
[9] Hayashi S,Namii Y.Effect of CTLA4Ig gene transfer using adnoviral vector in organ and cell transplantation[J]. Transplantation Proceedings,1997,29∶2212.
(1999-09-06收稿), http://www.100md.com