不同应激损伤所致血管内皮细胞中vWF的变化
作者：洪欣 李凤芝 尹昭云 颜培华 何一心
单位：洪欣 李凤芝 尹昭云 颜培华(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；何一心(中国医学 科学院血液病研究所，天津 300041)
关键词：血管内皮细胞；vWF；低氧；低温损伤
中国应用生理学杂志000406
摘要 目的：通过检测血管内皮细胞(VEC)中vWF的变化，评价VEC的损伤。方法：利用免疫组化技术对体外培养的猪肺动脉内皮细胞(PAEC)和大鼠主动脉内 皮细胞(AEC)中vWF进行免疫荧光标记，通过流式细胞仪对vWF的细胞阳性率和荧光强度进行 定性、定量分析，观察低氧和低温所引起的vWF变化。结果：正常猪PAEC和 大鼠AEC的vWF阳性率在80%左右，阳性程度较高。但缺氧或冷冻损伤可使PAEC和AEC的vWF阳 性率不同程度的降低，同时，阳性细胞功能代偿，合成vWF增加，阳性细胞的荧光强度增加 。结论：检测细胞vWF的变化可以反映VEC的在不同致损伤条件下的功能状态 。
, http://www.100md.com
中图分类号： R852.11；Q463文献标识码：A
文章编号：1000-6834(2000)04-0310-04
THE CHANGE OF WF IN VASCULAR ENDOTHELIAL
CELLS UNDER DIFFERENT STRESS
HONG Xin LI Feng-zhi YIN Zhao-yun YAN Peu-hua HE Yi-xin
(Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Milit ary Medical Sciences, Tianjin 300050)
ABSTRACT Aim: To correlate the injury of vascular endothelial cells during va rious pathological conditions with the change of vWF (von Willebrand Factor) in different VEC lines. Methods: Flow cytometer(FCM) were used to d efect the immunoflourescent stained vWF in pulmonary artery endothelial cells (P AEC) of pig and aortic endothelial cells(AEC) of rats. Results: The positive rates of vWF in PAEC of pigs is similar with that in AEC of rats un der normal condition, but it decreased differently after hypoxic or cold injury. It was very interesting that the mean fluorescence intensity of positive PAEC o r AEC exposed to hypoxia or cold elevated significantly compared with those of c ontrol. Conclusions: The change of vWF in VEC can be used to eva luate the function of VEC under different stress.
, 百拇医药
KEY WORDS：
血管内皮细胞(VEC)是覆衬于全身所有血管内面的单层扁平细胞，直接与循环血液接触, 具有多种重要的生理功能[1,2]。 vWF(von Willebrand Factor)，也称因子Ⅷ相关 抗原，是由VEC合成释放的一种蛋白因子，它不仅参与血液凝固和血栓的形成，而且还做为 内皮细胞上的特征因子用以鉴别体外培养的VEC[3,4]。近来发现vWF还参与粘附因 子的合成和表达[7]，说明vWF与多种重要的生物学功能有关。有人曾经分析了血液 或VEC培养液中vWF含量的变化，用以反应血管损伤疾病的发生，但并未直接分析细胞上vWF 的变化[5，6]。本文利用免疫组化技术，建立了通过流式细胞仪(FCM)检测体外培 养VEC细胞上vWF的方法，检测了缺氧和冷冻损伤中，不同来源不同类型VEC中vWF的变化，为 在血管损伤性疾病中直观评价VEC的功能变化提供了新的途径。
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1 材料与方法
1.1 猪PAEC体外培养
选用天津市肉联厂检疫合格的健康成年猪，体重100～150 kg，雌雄不拘，活杀后，在相 对无菌条件下分离肺动脉， D-Hank’s液反复冲洗管腔至无残留血液为止，放入预温至37 ℃、0.25%胰蛋白酶中消化20 min,消化液800×g，离心10 min。弃上清，向离心管加入M1 99培养液(含有20%胎牛血清，10 mmol/L HEPES，双抗100 u/ml， pH7.0)。苔盼蓝染 色计活细胞数，调整细胞浓度，将细胞悬液以105cells/ml密度接种于培养瓶中，置于3 7℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养，长成单层后及时传代。采用形态学和免疫 学的方法对其鉴定后进行实验。
1.2 大鼠AEC的体外培养
, 百拇医药
选用Wistar大鼠，体重150～250 g，雌雄不拘，活杀后，解剖分离腹主动脉，采用组织 块贴壁法进行AEC培养，其它方法同上。
1.3 实验条件
1.3.1 低氧条件 PAEC随机分组后，常氧组置常氧培养箱内培养，条件与 上述相同。低氧组置低氧培养箱内，条件为3%O2、5%CO2＼92%N2、饱和湿度，分 别培养不同时间后，分析vWF的变化。
1.3.2 低温条件 AEC以1℃/min的速率冷冻至细胞培养液的温度为-20、 -40℃时取出立即放入37℃水中复温后置37℃、5%CO2培养箱内复温并继续培养l～ 3 d后 分别检测vWF的变化。
1.4 vWF的测定
, 百拇医药
1.4.1 细胞荧光染色 以Jaffe法对内皮细胞进行荧光染色[3] ，试剂购自上海生物制品所。将细胞制成细胞悬液，800 ×g，离心10 min，4℃的4%甲 醛固定25 min，加温37℃的D-Hank’s液洗3次。加入兔抗人vWF血清抗体(1∶40)，37℃孵 育30 min。PBS洗3次。加入羊抗兔FITC-IgG二抗(1∶10)，37℃孵育30 min。PBS洗3次，暗 处保存，2 h内检测。流式细胞仪检测前，用300目尼龙滤网过滤细胞悬液，去除未分离的细 胞团块，将细胞制成单细胞悬液，用于流式细胞仪检测。
1.4.2 仪器条件 采用美国Coulter公司生产的EPICSCS临床型流式细胞 仪，SW氩离子激光器，输功率260 mW，激发光波长488 nm。前置滤光片，使光电倍增管接收 绿色免疫荧光。用10 μm直径的荧光球校正仪器，使仪器CV值稳定在3%以内。改变前向角 以去除细胞碎片的干扰：每个样品记数l万个细胞，从中分析大小形态在正常范围内的8 7 00左右内皮细胞。计算机Log单参数1 024道直方图实时收集处理数据，记录vWF阶性细胞数 及阳性细胞的平均荧光强度，并进行统计处理，软件系统为EASY-2。
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检测Wistar大鼠AEC冷冻损伤后vWF变化的仪器为FACS-440型流式细胞仪，条件与上述 大致相同。
1.5 统计处理
实验结果以均数±标准差(
±s)表示，FCM自动分析处理数据，采用方差或 t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 低氧时PAEC内vWF的变化
内皮细胞进行荧光染色后，功能正常的PAEC将呈荧光阶性反应。PAEC在常氧和低氧条件 下培养不同时间后，通过流式细胞仪分析PAEC内vWF(表1)，常氧条件下vWF阳性率均在80% 以上，培养时间的长短对vWF的阳性率无明显影响。但在3%O2的低氧条件下，vWF阳性率 明显下降。vWF阳性的PAEC的荧光强度与胞内 vWF的含量成正比，所以分析vWF的荧光强度， 能了解PAEC在低氧时合成vWF的变化(表2)，常氧条件下阳性PAEC内的vWF含量基本无变化。 但在低氧条件下vWF的荧光强度明显增加。
, 百拇医药
Tab.1 Change of the positive rate(%) of immunofluorescence
of vWF in cultured PAEC
after hypoxia of different h ours(±s,n=8) Group
2h
12h
24h
48h
Control
88.70±3.85
, http://www.100md.com
84.59±3.73
82.86±4.24
87.93±7.13
Hypoxia
76.68±12.50*
61.18±4.40**
67.05±3.68**
57.12±8.29**
*P<0.05，** P<0.01，vs controlTab.2 Change of the mean intensity(channel ) of
, 百拇医药
immunofluorescence of vWF in cultured PAEC
after hypoxia of different hou rs(±s,n=8) Group
2h
12h
24h
48h
Control
8.92±2.12
9.31±1.58
10.76±2.40
, 百拇医药
8.05±1.24
Hypoxia
11.16±2.01*
11.51±1.22*
13.23±0.87*
10.69±1.44*
* P<0.05,vs control
2.2 低温损伤时AEC中vWF的变化
用PACS-440型流式细胞仪检测Wistar大鼠AEC冷冻损伤后vWF的变化见表3，正常培养的 AEC的vWF免疫荧光阳性率为79.03%，与PAEC的阳性率大致相同。冷冻损伤后，阳性率有不 同程度的降低，而阳性细胞的荧光强度却明显增加(表4)。
, 百拇医药
Tab.3 Change of the positive rate(%) of immunofluorescence
of vWF in cultured AEC of rats after cold injury(±s，n=4) Croup
0 d
1 d
2 d
3 d
37℃
79.03±24.09
-20℃
, http://www.100md.com
10.14±3.53**
5.20±1.12**
2 .15±0.47**
2.50±0.52**
-40℃
7.79±1.70**
0.60±0.11**
0. 10±0.02**
0.60±0.10**
, 百拇医药
** P<0.01，vs 37℃ groupTab.4 Change of the mean intensity(cha nnel)
of immunofluorescence of vWF in
cultured AEC of rats after cold in jury(±s，n=4) Croup
0 d
1 d
2 d
3 d
37℃
, 百拇医药
56.24±17.15
-20℃
98.81±32.49*
83.73±18.04*
82.06±17.80*
82.4 0±17.07*
-40℃
82.75±17.82*
82.67±15.29*
88.29±16.83*
, 百拇医药
80.91±15. 24*
* P<0.05，vs 37℃ group
3 讨论
vWF，亦称因子Ⅷ相关抗原(Ⅷ R∶Ag)，是 VEC合成并释放的一种高分子糖蛋白(>1 200 kd)，是VEC特异性标志之一[3,4]，因此常用来鉴定体外培养的VEC。正常的VE C含有一定量的vWF，而在VEC受到外来刺激或某些血管损伤性疾病中[5,6] ， VEC的vWF的含量明显降低，血中vWF含量增加。所以在某些病理过程中观察VEC中vWF的变 化可以间接反映VEC生长和功能状态。Cunha-Ribeiro将人脐静脉内皮细胞暴露在14 mmHg的 氧分压12～72 h后，用Elisa检测内皮细胞培养液中的vWF因子，发现vWF含量明显增加 [6]，但并没有直接观察到VEC中vWF的变化。所以，急需建立一种准确分析VEC上vWF的 实验方法，更加直观地了解vWF在病理过程中的变化。本实验通过免疫学的方法先将VEC中vW F进行免疫荧光标记，然后利用FCM对猪PAEC和大鼠AEC中vWF因子的荧光强度进行定性定量分 析，检测结果表明，低氧组PAEC的vWF阳性率下降10～20%左右，说明 PAEC对低氧十分敏感 。值得注意的是，低氧组阳性PAEC的vWF平均荧光强度均显著高于各自的对照组，表明阳性P AEC的vWF含量增加。这可能是由于低氧导致细胞损伤或细胞释放vWF增加，另一些PAEC代偿 ，合成vWF增加所致，其机理尚需进一步探讨。为证明FCM检测vWF的方法是否能用于评价其 它来源的VEC的其它损伤，我们用另一型号的FCM对大鼠的AEC的vWF进行了分析，并观察了低 温损伤后AEC的vWF的变化。结果表明，正常大鼠AEC的vWF阳性率与PAEC大致相同，但低温损 伤后VEC的阳性率下降幅度较大，这可能是低温的损伤程度较重所致。我们的另一些病理实 验结果也表明低温所致细胞损伤比低氧所致的严重。采用不同型号的FCM分析到的大鼠AEC阳 性细胞的荧光强度虽然与PAEC在绝对值上不同，但均能很明显地分析到vWF的变化趋势。以 上结果表明，用FCM检测VEC上的vWF可以间接反映细胞的损伤程度。另有研究表明[7] ， P-选择素储存在W-P小体内，vWF的表达和释放可促进P-选择素的表达。缺氧和冷冻 过程中，PAEC的 vWF阳性细胞数均明显下降，vWF大量释放，必将导致P-选择素的表达增加 ，促进白细胞/内皮细胞的粘附作用。所以，观察VEC上vWF的变化有着重要的理论意义，本 实验所建立的FCM检测细胞上vWF的方法，为客观准确评价VEC上vWF的变化提供了有效的途径 ，有一定的应用价值。此外，通过本方法的建立也提示我们，只要能够对细胞中特异的成分 或蛋白因子进行免疫荧光标记，细胞可以分离为单个细胞，就可以利用FCM对其进行检测， 这无疑对今后的科研工作有着重要的启示。
, 百拇医药
作者简介：洪欣(1966-)，男，黑龙江人，博士研究生，从事低 氧病理生理学研究。
4 参考文献
[1] Haler H. Endothelial function. General considerations [J]. Dru gs, 1997,53(suppl 1):1-10
[2] Lum H, malik A. Mechanisms of increased endothelial permeability[J]. C an J Physiol Pharmacol, 1996,74(7): 787-800.
[3] Jaffe E A, Nachman R L, Becher C G, et al. Cultured of human endotheli al cells derived from umbilical vein. Identification by morphologic and immunolo gic criteria[J]. J Clin Invest, 1973,52:2745-2756.
, 百拇医药
[4] 韩启德，允文镒.血管生物学[M].北京.北京医科大学中国协和医科大学联合出 版社，1997，24-38.
[5] 张广森.因子Ⅷ与动脉血栓性疾病[J].国外医学生理病理科学分册，1984，4：18 8-91.
[6] Cunha-Ribeiro L M,Sakariassen K S. Modulation of vascular properties of c ul tured human endothelium by hypoxia and reoxygenation[M]. New York:Plenum pre ss, 1996,281:260.
[7] Pinsky D J, Naka Y, Liao H, et al. Hypoxia induced exocyotosis of endo thelial cell Weibel-Palade bodies. A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation[J]. J Clin Invest, 1996,97:493-500.
收稿日期：1999-07-12
修回日期：2000-07-27, 百拇医药
单位：洪欣 李凤芝 尹昭云 颜培华(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)；何一心(中国医学 科学院血液病研究所，天津 300041)
关键词：血管内皮细胞；vWF；低氧；低温损伤
中国应用生理学杂志000406
摘要 目的：通过检测血管内皮细胞(VEC)中vWF的变化，评价VEC的损伤。方法：利用免疫组化技术对体外培养的猪肺动脉内皮细胞(PAEC)和大鼠主动脉内 皮细胞(AEC)中vWF进行免疫荧光标记，通过流式细胞仪对vWF的细胞阳性率和荧光强度进行 定性、定量分析，观察低氧和低温所引起的vWF变化。结果：正常猪PAEC和 大鼠AEC的vWF阳性率在80%左右，阳性程度较高。但缺氧或冷冻损伤可使PAEC和AEC的vWF阳 性率不同程度的降低，同时，阳性细胞功能代偿，合成vWF增加，阳性细胞的荧光强度增加 。结论：检测细胞vWF的变化可以反映VEC的在不同致损伤条件下的功能状态 。
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中图分类号： R852.11；Q463文献标识码：A
文章编号：1000-6834(2000)04-0310-04
THE CHANGE OF WF IN VASCULAR ENDOTHELIAL
CELLS UNDER DIFFERENT STRESS
HONG Xin LI Feng-zhi YIN Zhao-yun YAN Peu-hua HE Yi-xin
(Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Milit ary Medical Sciences, Tianjin 300050)
ABSTRACT Aim: To correlate the injury of vascular endothelial cells during va rious pathological conditions with the change of vWF (von Willebrand Factor) in different VEC lines. Methods: Flow cytometer(FCM) were used to d efect the immunoflourescent stained vWF in pulmonary artery endothelial cells (P AEC) of pig and aortic endothelial cells(AEC) of rats. Results: The positive rates of vWF in PAEC of pigs is similar with that in AEC of rats un der normal condition, but it decreased differently after hypoxic or cold injury. It was very interesting that the mean fluorescence intensity of positive PAEC o r AEC exposed to hypoxia or cold elevated significantly compared with those of c ontrol. Conclusions: The change of vWF in VEC can be used to eva luate the function of VEC under different stress.
, 百拇医药
KEY WORDS：
血管内皮细胞(VEC)是覆衬于全身所有血管内面的单层扁平细胞，直接与循环血液接触, 具有多种重要的生理功能[1,2]。 vWF(von Willebrand Factor)，也称因子Ⅷ相关 抗原，是由VEC合成释放的一种蛋白因子，它不仅参与血液凝固和血栓的形成，而且还做为 内皮细胞上的特征因子用以鉴别体外培养的VEC[3,4]。近来发现vWF还参与粘附因 子的合成和表达[7]，说明vWF与多种重要的生物学功能有关。有人曾经分析了血液 或VEC培养液中vWF含量的变化，用以反应血管损伤疾病的发生，但并未直接分析细胞上vWF 的变化[5，6]。本文利用免疫组化技术，建立了通过流式细胞仪(FCM)检测体外培 养VEC细胞上vWF的方法，检测了缺氧和冷冻损伤中，不同来源不同类型VEC中vWF的变化，为 在血管损伤性疾病中直观评价VEC的功能变化提供了新的途径。
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1 材料与方法
1.1 猪PAEC体外培养
选用天津市肉联厂检疫合格的健康成年猪，体重100～150 kg，雌雄不拘，活杀后，在相 对无菌条件下分离肺动脉， D-Hank’s液反复冲洗管腔至无残留血液为止，放入预温至37 ℃、0.25%胰蛋白酶中消化20 min,消化液800×g，离心10 min。弃上清，向离心管加入M1 99培养液(含有20%胎牛血清，10 mmol/L HEPES，双抗100 u/ml， pH7.0)。苔盼蓝染 色计活细胞数，调整细胞浓度，将细胞悬液以105cells/ml密度接种于培养瓶中，置于3 7℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养，长成单层后及时传代。采用形态学和免疫 学的方法对其鉴定后进行实验。
1.2 大鼠AEC的体外培养
, 百拇医药
选用Wistar大鼠，体重150～250 g，雌雄不拘，活杀后，解剖分离腹主动脉，采用组织 块贴壁法进行AEC培养，其它方法同上。
1.3 实验条件
1.3.1 低氧条件 PAEC随机分组后，常氧组置常氧培养箱内培养，条件与 上述相同。低氧组置低氧培养箱内，条件为3%O2、5%CO2＼92%N2、饱和湿度，分 别培养不同时间后，分析vWF的变化。
1.3.2 低温条件 AEC以1℃/min的速率冷冻至细胞培养液的温度为-20、 -40℃时取出立即放入37℃水中复温后置37℃、5%CO2培养箱内复温并继续培养l～ 3 d后 分别检测vWF的变化。
1.4 vWF的测定
, 百拇医药
1.4.1 细胞荧光染色 以Jaffe法对内皮细胞进行荧光染色[3] ，试剂购自上海生物制品所。将细胞制成细胞悬液，800 ×g，离心10 min，4℃的4%甲 醛固定25 min，加温37℃的D-Hank’s液洗3次。加入兔抗人vWF血清抗体(1∶40)，37℃孵 育30 min。PBS洗3次。加入羊抗兔FITC-IgG二抗(1∶10)，37℃孵育30 min。PBS洗3次，暗 处保存，2 h内检测。流式细胞仪检测前，用300目尼龙滤网过滤细胞悬液，去除未分离的细 胞团块，将细胞制成单细胞悬液，用于流式细胞仪检测。
1.4.2 仪器条件 采用美国Coulter公司生产的EPICSCS临床型流式细胞 仪，SW氩离子激光器，输功率260 mW，激发光波长488 nm。前置滤光片，使光电倍增管接收 绿色免疫荧光。用10 μm直径的荧光球校正仪器，使仪器CV值稳定在3%以内。改变前向角 以去除细胞碎片的干扰：每个样品记数l万个细胞，从中分析大小形态在正常范围内的8 7 00左右内皮细胞。计算机Log单参数1 024道直方图实时收集处理数据，记录vWF阶性细胞数 及阳性细胞的平均荧光强度，并进行统计处理，软件系统为EASY-2。
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检测Wistar大鼠AEC冷冻损伤后vWF变化的仪器为FACS-440型流式细胞仪，条件与上述 大致相同。
1.5 统计处理
实验结果以均数±标准差(
±s)表示，FCM自动分析处理数据，采用方差或 t检验进行统计学分析。2 结果
2.1 低氧时PAEC内vWF的变化
内皮细胞进行荧光染色后，功能正常的PAEC将呈荧光阶性反应。PAEC在常氧和低氧条件 下培养不同时间后，通过流式细胞仪分析PAEC内vWF(表1)，常氧条件下vWF阳性率均在80% 以上，培养时间的长短对vWF的阳性率无明显影响。但在3%O2的低氧条件下，vWF阳性率 明显下降。vWF阳性的PAEC的荧光强度与胞内 vWF的含量成正比，所以分析vWF的荧光强度， 能了解PAEC在低氧时合成vWF的变化(表2)，常氧条件下阳性PAEC内的vWF含量基本无变化。 但在低氧条件下vWF的荧光强度明显增加。
, 百拇医药
Tab.1 Change of the positive rate(%) of immunofluorescence
of vWF in cultured PAEC
after hypoxia of different h ours(
±s,n=8) Group2h
12h
24h
48h
Control
88.70±3.85
, http://www.100md.com
84.59±3.73
82.86±4.24
87.93±7.13
Hypoxia
76.68±12.50*
61.18±4.40**
67.05±3.68**
57.12±8.29**
*P<0.05，** P<0.01，vs controlTab.2 Change of the mean intensity(channel ) of
, 百拇医药
immunofluorescence of vWF in cultured PAEC
after hypoxia of different hou rs(
±s,n=8) Group2h
12h
24h
48h
Control
8.92±2.12
9.31±1.58
10.76±2.40
, 百拇医药
8.05±1.24
Hypoxia
11.16±2.01*
11.51±1.22*
13.23±0.87*
10.69±1.44*
* P<0.05,vs control
2.2 低温损伤时AEC中vWF的变化
用PACS-440型流式细胞仪检测Wistar大鼠AEC冷冻损伤后vWF的变化见表3，正常培养的 AEC的vWF免疫荧光阳性率为79.03%，与PAEC的阳性率大致相同。冷冻损伤后，阳性率有不 同程度的降低，而阳性细胞的荧光强度却明显增加(表4)。
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Tab.3 Change of the positive rate(%) of immunofluorescence
of vWF in cultured AEC of rats after cold injury(
±s，n=4) Croup0 d
1 d
2 d
3 d
37℃
79.03±24.09
-20℃
, http://www.100md.com
10.14±3.53**
5.20±1.12**
2 .15±0.47**
2.50±0.52**
-40℃
7.79±1.70**
0.60±0.11**
0. 10±0.02**
0.60±0.10**
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** P<0.01，vs 37℃ groupTab.4 Change of the mean intensity(cha nnel)
of immunofluorescence of vWF in
cultured AEC of rats after cold in jury(
±s，n=4) Croup0 d
1 d
2 d
3 d
37℃
, 百拇医药
56.24±17.15
-20℃
98.81±32.49*
83.73±18.04*
82.06±17.80*
82.4 0±17.07*
-40℃
82.75±17.82*
82.67±15.29*
88.29±16.83*
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80.91±15. 24*
* P<0.05，vs 37℃ group
3 讨论
vWF，亦称因子Ⅷ相关抗原(Ⅷ R∶Ag)，是 VEC合成并释放的一种高分子糖蛋白(>1 200 kd)，是VEC特异性标志之一[3,4]，因此常用来鉴定体外培养的VEC。正常的VE C含有一定量的vWF，而在VEC受到外来刺激或某些血管损伤性疾病中[5,6] ， VEC的vWF的含量明显降低，血中vWF含量增加。所以在某些病理过程中观察VEC中vWF的变 化可以间接反映VEC生长和功能状态。Cunha-Ribeiro将人脐静脉内皮细胞暴露在14 mmHg的 氧分压12～72 h后，用Elisa检测内皮细胞培养液中的vWF因子，发现vWF含量明显增加 [6]，但并没有直接观察到VEC中vWF的变化。所以，急需建立一种准确分析VEC上vWF的 实验方法，更加直观地了解vWF在病理过程中的变化。本实验通过免疫学的方法先将VEC中vW F进行免疫荧光标记，然后利用FCM对猪PAEC和大鼠AEC中vWF因子的荧光强度进行定性定量分 析，检测结果表明，低氧组PAEC的vWF阳性率下降10～20%左右，说明 PAEC对低氧十分敏感 。值得注意的是，低氧组阳性PAEC的vWF平均荧光强度均显著高于各自的对照组，表明阳性P AEC的vWF含量增加。这可能是由于低氧导致细胞损伤或细胞释放vWF增加，另一些PAEC代偿 ，合成vWF增加所致，其机理尚需进一步探讨。为证明FCM检测vWF的方法是否能用于评价其 它来源的VEC的其它损伤，我们用另一型号的FCM对大鼠的AEC的vWF进行了分析，并观察了低 温损伤后AEC的vWF的变化。结果表明，正常大鼠AEC的vWF阳性率与PAEC大致相同，但低温损 伤后VEC的阳性率下降幅度较大，这可能是低温的损伤程度较重所致。我们的另一些病理实 验结果也表明低温所致细胞损伤比低氧所致的严重。采用不同型号的FCM分析到的大鼠AEC阳 性细胞的荧光强度虽然与PAEC在绝对值上不同，但均能很明显地分析到vWF的变化趋势。以 上结果表明，用FCM检测VEC上的vWF可以间接反映细胞的损伤程度。另有研究表明[7] ， P-选择素储存在W-P小体内，vWF的表达和释放可促进P-选择素的表达。缺氧和冷冻 过程中，PAEC的 vWF阳性细胞数均明显下降，vWF大量释放，必将导致P-选择素的表达增加 ，促进白细胞/内皮细胞的粘附作用。所以，观察VEC上vWF的变化有着重要的理论意义，本 实验所建立的FCM检测细胞上vWF的方法，为客观准确评价VEC上vWF的变化提供了有效的途径 ，有一定的应用价值。此外，通过本方法的建立也提示我们，只要能够对细胞中特异的成分 或蛋白因子进行免疫荧光标记，细胞可以分离为单个细胞，就可以利用FCM对其进行检测， 这无疑对今后的科研工作有着重要的启示。
, 百拇医药
作者简介：洪欣(1966-)，男，黑龙江人，博士研究生，从事低 氧病理生理学研究。
4 参考文献
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收稿日期：1999-07-12
修回日期：2000-07-27, 百拇医药