肝癌单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析
作者：孙建新 张从昕 殷学平 吴祥甫△
单位：
关键词：肝肿瘤；抗体；单克隆；免疫球蛋白可变区；基因克隆；序列分析
摘要 目的摘要 目的：获取抗人原发性肝癌单克隆抗体重、轻链可变区基因。方法：从分泌高亲和力的抗人原发性肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM8.11中提取细胞的总RNA，以随机引物反转录合成cDNA，以特异引物进行PCR ，扩增了单抗的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因，并进行了序列分析。结果：VH基因片段长度为351 bp ，编码117个氨基酸残基；VL基因片段长度为324 bp,编码107个氨基酸残基。两者均有4个框架区(FRs)及3个抗原互补决定区(CDRs)，并含有抗体特征性的两个半胱氨酸残基。结论：VH及VL基因的克隆成功为基因工程抗体的研究奠定了良好的基础。
中国图书资料分类法分类号 R 735.7
, 百拇医药
Cloning and sequencing of variable region gene of monoclonal antibody against human primary hepatoma
Sun Jianxin ，Zhang Chongxin，Ying Xueping，Wu Xiangfu (Department of Science and Research，Second Military Medical University，Shanghai，200433)
Abstract Objective: To acquire the variable region genes of heavy and light chain of monoclonal antibody against human primary hepatoma. Methods: Total RNA extracted from hybridoma cell SM8.11 secreting specific McAb against human primary hepatoma was transcripted reversely into cDNA with random primers. The SM8.11 variable region of the heavy chain (VH) and variable region of the light chain (VL) gene fragments were amplified using PCR method and sequenced using the dideoxy chain termination technique. Results: The VH gene consisted of 351 base pairs and encoded 117 amino acids residues; the VL gene consisted of 324 base pairs and encoded 107 amino acids residues. There were four FRs, three CDRs and two characteristic cysteine residues within VH and VL genes, respectively. Conclusion: The success of cloning of McAb SM8.11 VH and VL gene lays a good basis for construction of a recombinant antibody.
, 百拇医药
Key words hepatoma; antibodies, monoclonal; variable region; gene cloning; sequencing
单克隆抗体以其良好的特异性和生化效应，在以抗体为主导的免疫学研究、临床诊断及肿瘤的导向治疗研究中发挥重要作用，但目前用于诊断及治疗的抗体多为鼠源性的单抗，本身具有很强的免疫原性[1]，同时全抗体分子大，不易穿透肿瘤组织[2]，因而在临床应用中受到一定限制。近年来，随着分子生物学技术的发展，在基因水平上改造抗体分子已成为可能[2，3]。抗人原发性肝癌单克隆抗体SM 8.11对肝癌组织特异性强，在原发性肝癌的诊断与治疗中有一定的实用价值[4]。本研究利用RT-PCR法扩增了该单抗的轻、重链可变区基因，为进一步对其进行人源化改造及构建单链抗体分子奠定了物质基础。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 细胞系 小鼠抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤细胞系SM8.11由第二军医大学肝胆外科研究所施乐华博士惠赠。
1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Klenow酶、TRIzol reagent，cDNA 合成试剂盒均为GIBCO BRL公司产品；DNA Sequencing Kit为USB公司产品；pUC19载体及大肠杆菌TG1由中国科学院上海生物化学研究所218组保存。
1.3 引物的设计与合成 参照Orlandi[2]设计免疫球蛋白重、轻链可变区基因引物，引物由上海细胞所合成。
VH Primer For:5′-AGGT(GC)(AC)A(GA)CTGCAG(GC)AGTC(TA)GG-3′； VH Primer Back:5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3′； VL Prim-er For:5′-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3′； VL Primer Back:5′-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′。
, 百拇医药
1.4 细胞总RNA的提取 1×106个细胞加入TRIzol reagent 1 ml吹打均匀，室温放置5 min后加入氯仿200 μl,充分摇匀，室温放置5 min。12000 r/min 离心15 min，吸取上层水相，加入异丙醇400 μl，摇匀，室温放置10 min。12 00 r/min 离心10 min，沉淀以70%乙醇洗一次，真空抽干，溶于20 μl DEPC处理的水中，以电泳及260 nm处的紫外吸收来判定RNA的质和量。
1.5 cDNA的合成 参照cDNA合成试剂盒说明书进行。
1.6 PCR扩增VH及VL基因 PCR反应体积为50 μl,含上述合成的cDNA第1链模板2 μl,10×PCR反应缓冲液5 μl,2.5mmol/L dNTP 4 μl,2.5 U/μl Taq DNA聚合酶1 μl,50 pmol/L的引物4 μl,去离子水34 μl。按如下条件进行PCR：94℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,共40个循环，最后一个循环72 ℃延伸10 min。取10 μl的PCR产物进行1.5%的Agarose电泳，紫外灯下观察结果。
, http://www.100md.com
1.7 PCR产物的克隆 VH及VL基因的PCR产物分别以Klenow酶补平后，1.5%的低熔点凝胶电泳回收所需片段，克隆于pUC19的SmaI位点。连接产物转化E.coli TG1,以双酶切的方法来鉴定重组的阳性克隆。
1.8 核苷酸序列测定 参照USB公司测序试剂盒说明书进行。
2 结 果
2.1 RT-PCR获取VH，VL基因 以TRIzol reagent 提取杂交瘤细胞的总RNA，D260/D280为2.0,电泳图谱可清晰见到18 S和28 S的两条核糖体RNA条带，说明所抽提的RNA无降解。以此RNA为模板反转录成cDNA，分别以重、轻链的两条引物进行PCR。PCR 产物经1.5% Agarose电泳检查，重链、轻链分别在约350 bp及320 bp可清晰见到扩增条带(图1)。
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2.2 VH，VL基因PCR产物的克隆及序列分析 VH及VL基因PCR产物以Klenow酶补平后，克隆进pUC19的SmaⅠ位点，构建重组质粒pUC19VH及pUC19VL，以BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切来鉴定重组阳性克隆。 随机挑选2个重链重组子及3个轻链重组子分别进行测序， 发现其核苷酸
图1 单克隆抗体SM8.11重链及轻链可变区
基因的PCR扩增结果
Fig 1 PCR amplification of the VH and VL variable
region gene of monoclonal antibody SM8.11
, 百拇医药
A:DNA marker；B:VL PCR product；C:VH PCR product
图2 肝癌单克隆抗体SM8.11重链可变区(A)和轻链可变区(B)的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列
Fig2 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of SM8.11 antibody VH(A) and LH(B) gene
序列完全一致。结果表明，重链基因片段长度为351 bp, 编码117个氨基酸残基；含有维持抗体可变区空间结构所必需的两个特征性的半胱氨酸残基，分别位于氨基酸序列的第22位和第96位；并有明确的4个框架区(FRs)和3个抗原互补决定区(CDRs)(图2A)。轻链基因片段长度为324 bp, 编码107个氨基酸残基；两个特征性的半胱氨酸残基分别位于氨基酸序列的第23位和第89位；同样具有明确的4个FRs和3个CDRs(图2B)。VH及VL的氨基酸序列符合鼠抗体可变区的特征。
, 百拇医药
3 讨 论
获取抗体可变区基因是构建基因工程抗体的关键。Orlandi等[2]根据免疫球蛋白可变区基因FRs核苷酸组成相对恒定这一特点，设计两对引物，用PCR法体外扩增了抗体的可变区基因。我们在实验中采用了此法，并成功地扩增了抗人原发性肝癌单克隆抗体的轻、重链可变区基因，实践证明，此法快速、有效。本实验中以TRIzol reagent来提取细胞的总RNA，所抽提的RNA质量高、无降解，具有快速、简单、费用不高等优点，是一种行之有效的抽提RNA的好方法。在VH及VL基因的克隆过程中，直接将PCR产物克隆于pUC19的Sma I位点，由于平端连接相对较难，因此在连接反应中，加入1 μl(10 U/μl)的Sma I，以防止载体的自身连接，减少了假阳性克隆的出现，提高了阳性克隆的筛选率，大大简化了克隆过程。抗人原发性肝癌单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆成功，为今后对此抗体进行人源化改造或构建单链抗体奠定了良好的基础。
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Colapinto EV, Humphrey PA, Zalutsky MR, et al. Comparative localization of murine monoclonal antibody mel14 F(ab′)2 fragment and whole IgG2a in human glioma xenografts. Cancer Res, 1988, 48(20): 5701
2 Orlandi R, Gussow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domain for expression by the polymerase chain reaction. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1989, 86(10): 3833
3 Yokota T, Milenic DE, Withlow M, et al. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin form. Cancer Res, 1992, 52(12): 3402
4 施乐华，谢天培，沈 锋，等. 分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤的制备及专一性分析. 第二军医大学学报，1996，17(4)：313
(1997-10-14收稿，1998-02-12修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：肝肿瘤；抗体；单克隆；免疫球蛋白可变区；基因克隆；序列分析
摘要 目的摘要 目的：获取抗人原发性肝癌单克隆抗体重、轻链可变区基因。方法：从分泌高亲和力的抗人原发性肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM8.11中提取细胞的总RNA，以随机引物反转录合成cDNA，以特异引物进行PCR ，扩增了单抗的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因，并进行了序列分析。结果：VH基因片段长度为351 bp ，编码117个氨基酸残基；VL基因片段长度为324 bp,编码107个氨基酸残基。两者均有4个框架区(FRs)及3个抗原互补决定区(CDRs)，并含有抗体特征性的两个半胱氨酸残基。结论：VH及VL基因的克隆成功为基因工程抗体的研究奠定了良好的基础。
中国图书资料分类法分类号 R 735.7
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Cloning and sequencing of variable region gene of monoclonal antibody against human primary hepatoma
Sun Jianxin ，Zhang Chongxin，Ying Xueping，Wu Xiangfu (Department of Science and Research，Second Military Medical University，Shanghai，200433)
Abstract Objective: To acquire the variable region genes of heavy and light chain of monoclonal antibody against human primary hepatoma. Methods: Total RNA extracted from hybridoma cell SM8.11 secreting specific McAb against human primary hepatoma was transcripted reversely into cDNA with random primers. The SM8.11 variable region of the heavy chain (VH) and variable region of the light chain (VL) gene fragments were amplified using PCR method and sequenced using the dideoxy chain termination technique. Results: The VH gene consisted of 351 base pairs and encoded 117 amino acids residues; the VL gene consisted of 324 base pairs and encoded 107 amino acids residues. There were four FRs, three CDRs and two characteristic cysteine residues within VH and VL genes, respectively. Conclusion: The success of cloning of McAb SM8.11 VH and VL gene lays a good basis for construction of a recombinant antibody.
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Key words hepatoma; antibodies, monoclonal; variable region; gene cloning; sequencing
单克隆抗体以其良好的特异性和生化效应，在以抗体为主导的免疫学研究、临床诊断及肿瘤的导向治疗研究中发挥重要作用，但目前用于诊断及治疗的抗体多为鼠源性的单抗，本身具有很强的免疫原性[1]，同时全抗体分子大，不易穿透肿瘤组织[2]，因而在临床应用中受到一定限制。近年来，随着分子生物学技术的发展，在基因水平上改造抗体分子已成为可能[2，3]。抗人原发性肝癌单克隆抗体SM 8.11对肝癌组织特异性强，在原发性肝癌的诊断与治疗中有一定的实用价值[4]。本研究利用RT-PCR法扩增了该单抗的轻、重链可变区基因，为进一步对其进行人源化改造及构建单链抗体分子奠定了物质基础。
1 材料和方法
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1.1 细胞系 小鼠抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤细胞系SM8.11由第二军医大学肝胆外科研究所施乐华博士惠赠。
1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Klenow酶、TRIzol reagent，cDNA 合成试剂盒均为GIBCO BRL公司产品；DNA Sequencing Kit为USB公司产品；pUC19载体及大肠杆菌TG1由中国科学院上海生物化学研究所218组保存。
1.3 引物的设计与合成 参照Orlandi[2]设计免疫球蛋白重、轻链可变区基因引物，引物由上海细胞所合成。
VH Primer For:5′-AGGT(GC)(AC)A(GA)CTGCAG(GC)AGTC(TA)GG-3′； VH Primer Back:5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3′； VL Prim-er For:5′-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3′； VL Primer Back:5′-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′。
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1.4 细胞总RNA的提取 1×106个细胞加入TRIzol reagent 1 ml吹打均匀，室温放置5 min后加入氯仿200 μl,充分摇匀，室温放置5 min。12000 r/min 离心15 min，吸取上层水相，加入异丙醇400 μl，摇匀，室温放置10 min。12 00 r/min 离心10 min，沉淀以70%乙醇洗一次，真空抽干，溶于20 μl DEPC处理的水中，以电泳及260 nm处的紫外吸收来判定RNA的质和量。
1.5 cDNA的合成 参照cDNA合成试剂盒说明书进行。
1.6 PCR扩增VH及VL基因 PCR反应体积为50 μl,含上述合成的cDNA第1链模板2 μl,10×PCR反应缓冲液5 μl,2.5mmol/L dNTP 4 μl,2.5 U/μl Taq DNA聚合酶1 μl,50 pmol/L的引物4 μl,去离子水34 μl。按如下条件进行PCR：94℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,共40个循环，最后一个循环72 ℃延伸10 min。取10 μl的PCR产物进行1.5%的Agarose电泳，紫外灯下观察结果。
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1.7 PCR产物的克隆 VH及VL基因的PCR产物分别以Klenow酶补平后，1.5%的低熔点凝胶电泳回收所需片段，克隆于pUC19的SmaI位点。连接产物转化E.coli TG1,以双酶切的方法来鉴定重组的阳性克隆。
1.8 核苷酸序列测定 参照USB公司测序试剂盒说明书进行。
2 结 果
2.1 RT-PCR获取VH，VL基因 以TRIzol reagent 提取杂交瘤细胞的总RNA，D260/D280为2.0,电泳图谱可清晰见到18 S和28 S的两条核糖体RNA条带，说明所抽提的RNA无降解。以此RNA为模板反转录成cDNA，分别以重、轻链的两条引物进行PCR。PCR 产物经1.5% Agarose电泳检查，重链、轻链分别在约350 bp及320 bp可清晰见到扩增条带(图1)。
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2.2 VH，VL基因PCR产物的克隆及序列分析 VH及VL基因PCR产物以Klenow酶补平后，克隆进pUC19的SmaⅠ位点，构建重组质粒pUC19VH及pUC19VL，以BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切来鉴定重组阳性克隆。 随机挑选2个重链重组子及3个轻链重组子分别进行测序， 发现其核苷酸
图1 单克隆抗体SM8.11重链及轻链可变区
基因的PCR扩增结果
Fig 1 PCR amplification of the VH and VL variable
region gene of monoclonal antibody SM8.11
, 百拇医药
A:DNA marker；B:VL PCR product；C:VH PCR product
图2 肝癌单克隆抗体SM8.11重链可变区(A)和轻链可变区(B)的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列
Fig2 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of SM8.11 antibody VH(A) and LH(B) gene
序列完全一致。结果表明，重链基因片段长度为351 bp, 编码117个氨基酸残基；含有维持抗体可变区空间结构所必需的两个特征性的半胱氨酸残基，分别位于氨基酸序列的第22位和第96位；并有明确的4个框架区(FRs)和3个抗原互补决定区(CDRs)(图2A)。轻链基因片段长度为324 bp, 编码107个氨基酸残基；两个特征性的半胱氨酸残基分别位于氨基酸序列的第23位和第89位；同样具有明确的4个FRs和3个CDRs(图2B)。VH及VL的氨基酸序列符合鼠抗体可变区的特征。
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3 讨 论
获取抗体可变区基因是构建基因工程抗体的关键。Orlandi等[2]根据免疫球蛋白可变区基因FRs核苷酸组成相对恒定这一特点，设计两对引物，用PCR法体外扩增了抗体的可变区基因。我们在实验中采用了此法，并成功地扩增了抗人原发性肝癌单克隆抗体的轻、重链可变区基因，实践证明，此法快速、有效。本实验中以TRIzol reagent来提取细胞的总RNA，所抽提的RNA质量高、无降解，具有快速、简单、费用不高等优点，是一种行之有效的抽提RNA的好方法。在VH及VL基因的克隆过程中，直接将PCR产物克隆于pUC19的Sma I位点，由于平端连接相对较难，因此在连接反应中，加入1 μl(10 U/μl)的Sma I，以防止载体的自身连接，减少了假阳性克隆的出现，提高了阳性克隆的筛选率，大大简化了克隆过程。抗人原发性肝癌单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆成功，为今后对此抗体进行人源化改造或构建单链抗体奠定了良好的基础。
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Colapinto EV, Humphrey PA, Zalutsky MR, et al. Comparative localization of murine monoclonal antibody mel14 F(ab′)2 fragment and whole IgG2a in human glioma xenografts. Cancer Res, 1988, 48(20): 5701
2 Orlandi R, Gussow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domain for expression by the polymerase chain reaction. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1989, 86(10): 3833
3 Yokota T, Milenic DE, Withlow M, et al. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin form. Cancer Res, 1992, 52(12): 3402
4 施乐华，谢天培，沈 锋，等. 分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤的制备及专一性分析. 第二军医大学学报，1996，17(4)：313
(1997-10-14收稿，1998-02-12修回), http://www.100md.com