榧子蛋白高效毛细管电泳法鉴别
作者：陈振德 陈志良 侯连兵 许重远 郑汉臣
单位：第一军医大学南方医院 广州 510515
关键词：榧子；高效毛细管电泳；生药鉴别
中草药000531 摘 要 对国产榧属植物种子进行蛋白电泳鉴别。采用高效毛细管电泳法对榧属植物种子蛋白进行分析。榧属植物种子蛋白高效毛细管电泳谱图有明显的种间差异。高效毛细管电泳可作为中药榧子的鉴别方法。
Identification of Proteins from the Kernel of Torreya (Torreya Arn.) Nut by HPCE
Chen Zhende Chen Zhiliang Hou Lianbing Xu Chongyuan and Zheng Hanchen
, 百拇医药
(Nanfang Hospital, the First Military Medical University Guangzhou 510515)
Abstract To identify the proteins obtained from different species of Torreya Arn. nuts by HPCE, in order to distinguish their various origins. Results showed that the electrophorograms did show some differences which could be used for the pharmacognostic identification of Torreya Arn.
Key words Torreya Arn. nut HPCE pharmacognostic identification
, 百拇医药
红豆杉科榧属植物 Torreya Arn. 全世界有8种和8个栽培品种，我国有5种，8个栽培品种及1个引进栽培种[1，2]。该属植物种子均富含优质脂肪油，可供食用或工业用[1～3]。其中，榧子始载于《神农本草经》，历版《中国药典》均收载，具有杀虫、消积、润肠、通便之功效。经笔者调查发现，云南榧子、巴山榧子等在产地也作为榧子应用，而《中国药典》对榧子只有性状描述，没有较理想的鉴定方法。我们拟以中药材细胞中普遍存在的、受遗传基因控制的蛋白分子为指标，用高效毛细管电泳(HPCE)法来探索鉴别中药榧子的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料：榧子 Torreya grandis， 香榧子 T.grandis cv. merrillii于1996年9月27日采自浙江诸暨，采集人陈振德；九龙山榧子 T.jiulongshanensis 于1997年9月28日采自浙江遂昌，采集人傅秋华；长叶榧子T.jackii于1997年9月24日采自浙江仙居，采集人朱志明；巴山榧子T.fargesii于1997年9月25日采自湖北神农架，采集人石世贵；云南榧子T.yunnanensis于1996年9月28日采自云南洱源，采集人寸润林；日本榧子 T.nucifera 于1997年9月26日采自上海，采集人陈振德；并经作者鉴定，标本存放于第二军医大学药学院生药学教研室。
, http://www.100md.com
1.2 仪器与试剂 美国 BIO-RAD 公司 BioFocusTM3000 型 Capillary Ion Analyzer，配有紫外扫描检测器。熔融石英毛细管 75 μm×60 cm(河北永年光纤厂)。所用试剂均为分析纯。
1.3 电泳条件：电解缓冲液为 150 mmol/L 硼酸盐溶液(pH 8.5)；电压为 20 kV；温度 20 ℃；紫外检测波长 200 nm；重力进样，时间 5 s。开机后先用 0.1 mol/L 氢氧化钠冲洗毛细管 2 min，再用去离子水冲洗 5 min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳后开始进样。每两次进样之间设定缓冲液冲洗 2 min。
1.4 样品溶液的配制：取生药样品 0.5 g，加入蛋白提取液 5 mL，在冰浴中研磨成匀浆状，转移至离心管内，以 5 000 r/min 离心 20 min，取上清液备用。Tris-甘氨酸蛋白提取液：Tris 0.6 g，甘氨酸 2.88 g，加蒸馏水溶解至 1 000 mL。碱性蛋白提取液：Tris-HCl 0.1 mol/L，0.1% 抗坏血酸，巯基乙醇 10 mmol/L，pH 8.0。酸性蛋白提取液：柠檬酸 80 mmol/L，Na2HPO4 32 mmol/L，抗坏血酸 5 mmol/L，巯基乙醇 10 mmol/L,pH 2.8。
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2 结果
2.1 在酸性提取液中，7种榧子在 4.0～10.0 min 区间都有相似的两个吸收峰；在18.0～20.0 min 区间九龙山榧子、长叶榧子、日本榧子、巴山榧子和云南榧子都有1个吸收峰，而榧子和香榧子无此吸收峰。
2.2 在中性提取液中，7种榧子在 4.0～15.0 min 区间都有较相似的两个吸收峰；在 15.0～20.0 min 区间九龙山榧子、长叶榧子、日本榧子、巴山榧子和云南榧子都有1个吸收峰，而榧子和香榧子无此吸收峰。
2.3 在碱中性提取液中， 九龙山榧子主要在7.61～8.54 min 处有两个吸收峰，榧子与香榧子在 18.00 min 前有相似的吸收峰，但榧子在 18.66 min 处有一吸收峰，而香榧子在 23.65 min 处有一吸收峰；长叶榧子、日本榧子、巴山榧子和云南榧子在 14.00 min 前有相似的吸收峰，但长叶榧子在 20.07 min 有一吸收峰，日本榧子在16.35 min 和 20.47 min 处各有一个吸收峰，巴山榧子在 14.40 min 和 18.55 min 处各有一个吸收峰，而云南榧子只在 19.04 min 处有一吸收峰。
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综合3种提取液所检测的图谱，7种榧子有一些相似的特征峰，又有各自之间的差别，容易加以区别，详见表1和图1，特别是中药榧子与同属其它种子有较大差异。可见，HPCE 可作为中药榧子的鉴别方法。
A-榧子 B-香榧子 C-九龙山榧子 D-长叶榧子
E-日本榧子 F-巴山榧子 G-云南榧子
1-酸性提取物 2-中性提取物 3-碱性提取物
图1 榧属植物种子蛋白HPCE图谱
表1 榧属植物种子蛋白电泳图谱中各峰的迁移时间(min) 名 称
酸性提取液
, 百拇医药
中性提取液
碱性提取液
榧子
5.28，7.38，19.37
5.12，5.68，6.86，7.50～14.00
5.35，5.96，7.43，8.25，8.60，8.70～18.00，18.66
香榧子
5.10，5.60，7.00
5.04，5.58，6.71，7.10～15.00
5.10，5.58，6.83，7.81～18.00，23.65
, 百拇医药
九龙山榧子
7.13，7.33，19.55，22.24
5.50，7.23，7.62，7.97，20.05
7.61，8.54，23.17
长叶榧子
5.27，7.46，19.73
5.28，6.29，7.10～14.80，19.70
5.36，6.51，7.05，7.39，7.45～18.00，20.07
日本榧子
5.38，7.24，7.33，19.71
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5.25，6.14，7.00，7.10～13.80，18.20
5.80，6.57，7.10，7.20～14.00，16.35，20.47
巴山榧子
5.24，7.12，18.70
5.32，6.20，7.08，7.00～15.00，18.25
5.34，6.34，6.84，7.60～14.00，14.40，18.55
云南榧子
5.35，7.23，18.77
4.79，5.47，6.42，7.00～13.80，19.87
, 百拇医药
5.14，6.45，6.9，7.50～14.00，19.04
3 讨论
3.1 HPCE是近年来迅速发展起来的一种重要分离技术，已在多肽、蛋白质、核酸、手性化合物等生物活性物质的分离分析方面显示了极为广阔的前景[4]。1997年胡平等报道提取菟丝子种子植物蛋白用 HPCE 法进行生药鉴定，结果表明不同种间成分和含量上存在明显差异，认为根据种子植物蛋白的电泳图谱，可有效地鉴别菟丝子的来源[5]。1998年张朝晖等报道对12种海马、海龙类药材采用 HPCE 进行鉴别，结果表明种间区别较明显，认为该法速度快，分辨力强、重现性好[6]。
3.2 榧子与同属其它种子的 HPCE 图谱有明显的差异，可有效地加以区别。因此，HPCE 可作为中药榧子的鉴别方法之一。
, 百拇医药 Addr ess:Chen Zhende,Nanfang Hospital of the First Military Medical University ,Guangzho
陈振德 男，博士、副教授、副主任药师、硕士生导师。1984年大学毕业，1998年博士毕业 。曾从事叶绿素主要降解产物紫红素18、二氢卟吩 P6 及其衍生物的制备与肿瘤光生物活 性和保肝作用的研究，此成果正在申请两项发明专利。攻读博士学位期间主要从事中国榧属 植物资源、化学和药理的研究。发表论文20余篇，参编2部专著，已申请发明专利1项，《大 蒜除臭新工艺》获军队科技进步二等奖。《中国榧属植物资源、化学成分和药理活性的研究 》获2000年度国家自然科学基金资助，批准号：39970893。《中药复方防治术后腹膜粘连的 新药研究》获2000年度国家新药研究基金资助，批准号：9690105245。现主要从事中 药材鉴定、资源及天然药物化学等方面的研究工作。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，中科院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第七卷).北京：科学出版社，1978：456
2，陈振德，等.国外医药*植物药分册，1996，11(4)：150
3，云南省植物研究所.云南经济植物.昆明：云南人民出版社，1974：77
4，胡 平，等.药学学报，1997，32(7)：549
5，李红旗，等.生物工程进展，1995，15(6)：40
6，张朝晖，等.中国中药杂志，1998，23(5)：259
收稿1999-05-19
修回1999-10-15, http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院 广州 510515
关键词：榧子；高效毛细管电泳；生药鉴别
中草药000531 摘 要 对国产榧属植物种子进行蛋白电泳鉴别。采用高效毛细管电泳法对榧属植物种子蛋白进行分析。榧属植物种子蛋白高效毛细管电泳谱图有明显的种间差异。高效毛细管电泳可作为中药榧子的鉴别方法。
Identification of Proteins from the Kernel of Torreya (Torreya Arn.) Nut by HPCE
Chen Zhende Chen Zhiliang Hou Lianbing Xu Chongyuan and Zheng Hanchen
, 百拇医药
(Nanfang Hospital, the First Military Medical University Guangzhou 510515)
Abstract To identify the proteins obtained from different species of Torreya Arn. nuts by HPCE, in order to distinguish their various origins. Results showed that the electrophorograms did show some differences which could be used for the pharmacognostic identification of Torreya Arn.
Key words Torreya Arn. nut HPCE pharmacognostic identification
, 百拇医药
红豆杉科榧属植物 Torreya Arn. 全世界有8种和8个栽培品种，我国有5种，8个栽培品种及1个引进栽培种[1，2]。该属植物种子均富含优质脂肪油，可供食用或工业用[1～3]。其中，榧子始载于《神农本草经》，历版《中国药典》均收载，具有杀虫、消积、润肠、通便之功效。经笔者调查发现，云南榧子、巴山榧子等在产地也作为榧子应用，而《中国药典》对榧子只有性状描述，没有较理想的鉴定方法。我们拟以中药材细胞中普遍存在的、受遗传基因控制的蛋白分子为指标，用高效毛细管电泳(HPCE)法来探索鉴别中药榧子的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料：榧子 Torreya grandis， 香榧子 T.grandis cv. merrillii于1996年9月27日采自浙江诸暨，采集人陈振德；九龙山榧子 T.jiulongshanensis 于1997年9月28日采自浙江遂昌，采集人傅秋华；长叶榧子T.jackii于1997年9月24日采自浙江仙居，采集人朱志明；巴山榧子T.fargesii于1997年9月25日采自湖北神农架，采集人石世贵；云南榧子T.yunnanensis于1996年9月28日采自云南洱源，采集人寸润林；日本榧子 T.nucifera 于1997年9月26日采自上海，采集人陈振德；并经作者鉴定，标本存放于第二军医大学药学院生药学教研室。
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1.2 仪器与试剂 美国 BIO-RAD 公司 BioFocusTM3000 型 Capillary Ion Analyzer，配有紫外扫描检测器。熔融石英毛细管 75 μm×60 cm(河北永年光纤厂)。所用试剂均为分析纯。
1.3 电泳条件：电解缓冲液为 150 mmol/L 硼酸盐溶液(pH 8.5)；电压为 20 kV；温度 20 ℃；紫外检测波长 200 nm；重力进样，时间 5 s。开机后先用 0.1 mol/L 氢氧化钠冲洗毛细管 2 min，再用去离子水冲洗 5 min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳后开始进样。每两次进样之间设定缓冲液冲洗 2 min。
1.4 样品溶液的配制：取生药样品 0.5 g，加入蛋白提取液 5 mL，在冰浴中研磨成匀浆状，转移至离心管内，以 5 000 r/min 离心 20 min，取上清液备用。Tris-甘氨酸蛋白提取液：Tris 0.6 g，甘氨酸 2.88 g，加蒸馏水溶解至 1 000 mL。碱性蛋白提取液：Tris-HCl 0.1 mol/L，0.1% 抗坏血酸，巯基乙醇 10 mmol/L，pH 8.0。酸性蛋白提取液：柠檬酸 80 mmol/L，Na2HPO4 32 mmol/L，抗坏血酸 5 mmol/L，巯基乙醇 10 mmol/L,pH 2.8。
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2 结果
2.1 在酸性提取液中，7种榧子在 4.0～10.0 min 区间都有相似的两个吸收峰；在18.0～20.0 min 区间九龙山榧子、长叶榧子、日本榧子、巴山榧子和云南榧子都有1个吸收峰，而榧子和香榧子无此吸收峰。
2.2 在中性提取液中，7种榧子在 4.0～15.0 min 区间都有较相似的两个吸收峰；在 15.0～20.0 min 区间九龙山榧子、长叶榧子、日本榧子、巴山榧子和云南榧子都有1个吸收峰，而榧子和香榧子无此吸收峰。
2.3 在碱中性提取液中， 九龙山榧子主要在7.61～8.54 min 处有两个吸收峰，榧子与香榧子在 18.00 min 前有相似的吸收峰，但榧子在 18.66 min 处有一吸收峰，而香榧子在 23.65 min 处有一吸收峰；长叶榧子、日本榧子、巴山榧子和云南榧子在 14.00 min 前有相似的吸收峰，但长叶榧子在 20.07 min 有一吸收峰，日本榧子在16.35 min 和 20.47 min 处各有一个吸收峰，巴山榧子在 14.40 min 和 18.55 min 处各有一个吸收峰，而云南榧子只在 19.04 min 处有一吸收峰。
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综合3种提取液所检测的图谱，7种榧子有一些相似的特征峰，又有各自之间的差别，容易加以区别，详见表1和图1，特别是中药榧子与同属其它种子有较大差异。可见，HPCE 可作为中药榧子的鉴别方法。
A-榧子 B-香榧子 C-九龙山榧子 D-长叶榧子
E-日本榧子 F-巴山榧子 G-云南榧子
1-酸性提取物 2-中性提取物 3-碱性提取物
图1 榧属植物种子蛋白HPCE图谱
表1 榧属植物种子蛋白电泳图谱中各峰的迁移时间(min) 名 称
酸性提取液
, 百拇医药
中性提取液
碱性提取液
榧子
5.28，7.38，19.37
5.12，5.68，6.86，7.50～14.00
5.35，5.96，7.43，8.25，8.60，8.70～18.00，18.66
香榧子
5.10，5.60，7.00
5.04，5.58，6.71，7.10～15.00
5.10，5.58，6.83，7.81～18.00，23.65
, 百拇医药
九龙山榧子
7.13，7.33，19.55，22.24
5.50，7.23，7.62，7.97，20.05
7.61，8.54，23.17
长叶榧子
5.27，7.46，19.73
5.28，6.29，7.10～14.80，19.70
5.36，6.51，7.05，7.39，7.45～18.00，20.07
日本榧子
5.38，7.24，7.33，19.71
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5.25，6.14，7.00，7.10～13.80，18.20
5.80，6.57，7.10，7.20～14.00，16.35，20.47
巴山榧子
5.24，7.12，18.70
5.32，6.20，7.08，7.00～15.00，18.25
5.34，6.34，6.84，7.60～14.00，14.40，18.55
云南榧子
5.35，7.23，18.77
4.79，5.47，6.42，7.00～13.80，19.87
, 百拇医药
5.14，6.45，6.9，7.50～14.00，19.04
3 讨论
3.1 HPCE是近年来迅速发展起来的一种重要分离技术，已在多肽、蛋白质、核酸、手性化合物等生物活性物质的分离分析方面显示了极为广阔的前景[4]。1997年胡平等报道提取菟丝子种子植物蛋白用 HPCE 法进行生药鉴定，结果表明不同种间成分和含量上存在明显差异，认为根据种子植物蛋白的电泳图谱，可有效地鉴别菟丝子的来源[5]。1998年张朝晖等报道对12种海马、海龙类药材采用 HPCE 进行鉴别，结果表明种间区别较明显，认为该法速度快，分辨力强、重现性好[6]。
3.2 榧子与同属其它种子的 HPCE 图谱有明显的差异，可有效地加以区别。因此，HPCE 可作为中药榧子的鉴别方法之一。
, 百拇医药 Addr ess:Chen Zhende,Nanfang Hospital of the First Military Medical University ,Guangzho
陈振德 男，博士、副教授、副主任药师、硕士生导师。1984年大学毕业，1998年博士毕业 。曾从事叶绿素主要降解产物紫红素18、二氢卟吩 P6 及其衍生物的制备与肿瘤光生物活 性和保肝作用的研究，此成果正在申请两项发明专利。攻读博士学位期间主要从事中国榧属 植物资源、化学和药理的研究。发表论文20余篇，参编2部专著，已申请发明专利1项，《大 蒜除臭新工艺》获军队科技进步二等奖。《中国榧属植物资源、化学成分和药理活性的研究 》获2000年度国家自然科学基金资助，批准号：39970893。《中药复方防治术后腹膜粘连的 新药研究》获2000年度国家新药研究基金资助，批准号：9690105245。现主要从事中 药材鉴定、资源及天然药物化学等方面的研究工作。
参 考 文 献
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1，中科院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第七卷).北京：科学出版社，1978：456
2，陈振德，等.国外医药*植物药分册，1996，11(4)：150
3，云南省植物研究所.云南经济植物.昆明：云南人民出版社，1974：77
4，胡 平，等.药学学报，1997，32(7)：549
5，李红旗，等.生物工程进展，1995，15(6)：40
6，张朝晖，等.中国中药杂志，1998，23(5)：259
收稿1999-05-19
修回1999-10-15, http://www.100md.com