妊高征患者口服硝苯地平后脐动脉血流的变化
作者：徐明娟 沙金燕 古 航 谢红一 费 梅
单位：第二军医大学长征医院神经外科，上海，200003
关键词：硝苯地平；妊娠高血压综合征；脐动脉；多普勒超声
第二军医大学学报980418 摘要 目的：建立适合混合蛋白质分离分析的高效毛细管电泳方法。方法：采用高效毛细管电泳中自由区带电泳分离模式，以标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶为分析对象，对影响电泳分离的因素进行了考察。结果与结论：通过减少蛋白质管壁吸附、优选缓冲液体系及定性定量信息校正，使细胞色素C与溶菌酶获得了理想的分离，同时成功地应用于磷脂酶A2的优化分离与纯度分析，为蛋白质类生化药物的质量控制提供了简便、快速、有效的检测手段。
中国图书资料分类法分类号 Q51
High performance capillary electrophoresis of proteinaceous products
, http://www.100md.com
Fan Guorong, Hu Jinhong, Lin Mei, An Dengkui (Department of Pharmacy, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective：To establish a high performance capillary electrophoresis (HPCE) method for optimal separation of proteinaceous products. Methods：Cytochrome C and lysozyme were selected as model samples ,and the some factors affecting electrophoretic separation were investigated, based on capillary zone electrophoresis(CZE) mode. Results and Conclusion：Three combined strategies for the optimal separation of cytochrome C and lysozyme were described: the reduction of protein wall adsorption, the optimization for electrophoretic buffer system, and the normalization of HPCE qualitative and quantitative information.Successful application to phospholipase A2 purity analysis was demonstrated.The conclusion was obvious that HPCE should provide a simple, quick and effective analytical tool for proteinaceous drugs quality control.
, 百拇医药
Key words high performance capillary electrophoresis；proteinaceous products；electrophoretic separation
随着现代生物技术的不断发展以及各种新型蛋白质类生化药物的相继问世，传统的SDS-聚丙烯酰胺电泳及常规的液相色谱技术已远远不能适应大规模药物生产过程分析与产品纯度检验的需要。因此，寻找一种高效、快速、简便的质量控制方法已显得越来越重要。
高效毛细管电泳(HPCE)是近年来迅速发展起来的一种新型分离、 分析技术。 1981年， 由于Jorgenson等的出色工作[1]， 为HPCE奠定了理论基础， 展示了毛细管电泳高效、 快速、 简便、 微量的优异特点。 该技术在生物大分子、 无机离子、 光学异构体及有机药物分离、 分析方面获得了广泛的应用[2,3]。
, http://www.100md.com
本文采用HPCE中常用的毛细管区带电泳(CZE)分离模式，以标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶为分析对象，通过减少蛋白质管壁吸附、优选缓冲液体系及定性定量信息的校正等步骤，建立了适合混合蛋白质分离分析的HPCE方法，并成功地应用于磷脂酶A2的优化分离与纯度分析，为蛋白质类生化药物的质量控制提供了简便、快速、有效的检测手段。
1 材料和方法
1.1 仪器与试药 美国Bio-RadHPE-100型高效毛细管电泳仪，日本岛津C-R6A色谱数据处理机，上海大华自动平衡记录仪，上海雷磁pHs-25酸度计。石英毛细管涂渍柱(20cm×25μm)由美国Bio-Rad公司提供，普通石英毛细管柱(30cm×50μm)购自河北永年光导纤维厂。标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶由中国药科大学生物工程中心提供。猪胰腺磷脂酶A2由中国药科大学生物化学教研室提供，在SDS-PAGE凝胶电泳中呈单一区带，相对分子质量约14.3万。羟丙甲基纤维素(E4MP,USPHPMC2910)由上海延安制药厂提供。磷酸氢二钠、柠檬酸、醋酸、盐酸、氢氧化钠等均为国产分析纯，水为重蒸馏水。
, 百拇医药
1.2 实验方法 按要求配制实验所需各种缓冲溶液，使用前用0.45 μm微孔滤膜过滤。细胞色素C与溶菌酶及磷脂酶A2样品液均用重蒸镏水溶解而成，浓度约为100 μg/ml。石英毛细管涂渍柱使用前分别用重蒸馏水和所用缓冲液清洗5～10 min。新装普通石英毛细管柱则应依次用0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L HCl液和重蒸馏水各清洗5～10 min。电泳分离前各操作缓冲液需动态平衡5 min，每次分析之后用缓冲液冲洗毛细管1～2 min。每次电泳操作运行电压8 kV，电动进样2 kV×4 s，柱上200 nm检测。室温：(16+1)℃。
2 结果与讨论
2.1 电泳分离过程中蛋白质吸附的控制 蛋白质HPCE分离最主要的问题是毛细管内壁的吸附。文献报道采用多种方法加以解决，其中在毛细管内壁涂以不带电荷的亲水性聚合物，可以减小甚至于消除电渗流，从而使蛋白质在管壁上的吸附减小到最低程度[4]。本实验结果发现，在pH 2.5磷酸盐缓冲液条件下细胞色素C与溶菌酶在普通石英毛细管柱、石英毛细管涂渍柱中的电迁移过程呈现不同的分离特征。细胞色素C与溶菌酶是碱性蛋白质，在pH2.5酸性缓冲液中呈正电荷粒子，即使石英毛细管硅醇基此时几乎不电离，但混合蛋白质依然受到普通石英毛细管柱壁的强烈吸附；而选择石英毛细管涂渍柱分离碱性混合蛋白质，其电泳谱图中峰宽与峰拖尾都明显减小。同时，用毛细管两次进样间的缓冲液冲洗措施，不仅可去除管内潴留的干扰杂质，更重要的是有助于保持管壁表面状态的恒定。表1列举了细胞色素C与溶菌酶在pH2.5磷酸盐缓冲液条件下HPCE分离的特征。可见，选择石英毛细管涂渍柱，采用低pH值的缓冲液且注意两次进样间隔清洗毛细管，可使混合蛋白质电泳分离达到分离效能高、定量重现性好的目的。
, 百拇医药
表 1 标准蛋白质电泳分离的柱效和迁移时间重现性
Tab 1 Column efficiency and migration reproducibility for standard protein electrophoretic separation Protein
Voltage (U/kV)
Column efficiency (pl/m)
Migration time RSD (%, n=5)
Coated△
Uncoated△
Washed▲
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Unwashed▲
Cytochrome C
6
273 000
87 000
1.37
2.34
8
307 000
105 000
1.23
2.81
, 百拇医药
10
285 000
68 000
1.44
2.55
Lysozyme
6
261 000
71 000
1.31
1.79
8
286 000
, http://www.100md.com
93 000
1.46
2.38
10
275 000
84 000
1.34
2.27
△Electrophoretic separations were carried out in coated/uncoated capillary；▲Coated capillary was prewashed/unwashed between runs,using acidic buffer solution
, 百拇医药
2.2 标准蛋白质优化分离缓冲液体系的选择 电泳缓冲液体系中不同缓冲对的选择，在一定程度上可以改善HPCE的分离效果。本文选择常用的磷酸盐缓冲液(pKa1 2.12, pKa2 7.21, pKa3 12.32)、柠檬酸盐缓冲液(pKa1 3.06, pKa2 4.74, pKa3 5.40)及醋酸盐缓冲液(pKa 4.75)，来考察不同缓冲液对标准蛋白质电迁移与分离度的影响，结果列于表2。显而易见，选择在0.05 mol/L，pH2.5条件下大体积、低电荷、较强缓冲能力的柠檬酸盐缓冲液，可以使标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶获得满意的分离效果，其典型电泳谱图如图1所示。
2.3 HPCE定性定量信息的校正 HPCE定性、定量重现性的好坏直接关系到一个分析方法的可靠程度。HPCE作为新兴的分离、分析技术，其分离重现性一直是人们普遍关注的一个问题。在毛细管电泳中，荷电粒子的迁移速度由电场作用下毛细管内电渗流与电泳流共同决定。其定性信息迁移时间tm[6]：
, 百拇医药
表 2 缓冲液种类对电泳分离的影响
Tab 2 The effects of buffer type on
electrophoretic separations(n=5,
±s, t/min) Protein
Migration time△
Phosphate
Citrate
Acetate
Cytochrome C
2.513±0.031
, 百拇医药
2.473±0.035
2.318±0.034
Lysozyme
2.672±0.039
2.784±0.039
2.432±0.032
PV▲[5]
0.9634
1.000
0.9447
△Electrophoretic separations were carried out in Bio-Rad coated capillary,using 0.05 mol/L buffer solution at pH2.5； ▲The minimum resolution PV =1-V/H as Lin BS et al adopted in [5]
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图 1 标准蛋白质细胞色素C和溶菌酶优化分离电泳图谱
Fig 1 Typical electrophoregram of cytochrome C and
lysozyme under the optimum electrophoretic conditions
Cytochrome C tm 2.475 min; Lysozyme tm 2.798 min;
Aspartame (Is) tm 4.617 min
式中：l为毛细管的有效长度；η为缓冲液的粘度；ε为缓冲液的介电常数；E为电场强度；ξc为毛细管内壁的ξ电位；ξ为荷电粒子在毛细管中ξ电位；K为荷电粒子双电层厚度的倒数；a为荷电粒子的半径。
, 百拇医药
而电泳分离的定量信息峰面积(Ai)则反映了电迁移的进样量大小Q[7]，那么：
又荷电粒子的表观淌度μa[8]：
式中：μe为电泳淌度；μeo为电渗淌度；Vi为进样电压；π为圆周率常数； r为毛细管的半径；c为荷电粒子的浓度；ti为进样时间；L为毛细管总长度；tm为荷电粒子的迁移时间；V为运行电压。
由(1)，(4)式可知，表征HPCE定性、定量信息的迁移时间tm、峰面积Ai与每次分离中的电场强度、进样电压、进样时间等可控参数和毛细管内壁表面状态、缓冲液粘度、介电常数等模糊参数有关，其中任一参数的变化都会不同程度地影响电泳分离的重现性。
, 百拇医药
如果选择一合适的物质作为内标(Is)，与分析溶质(i)在同一电泳过程中进行分离、分析，并以相对迁移时间tmi/tmIs(溶质迁移时间/内标迁移时间)和相对峰面积Ai/Ais(溶质峰面积/内标峰面积)作为HPCE定性、定量分析的指标，那么：
显然，采用内标法处理HPCE迁移时间与峰面积，理论上有助于消除可控参数，并一定程度上控制模糊参数对电泳分离重现性的影响。实验结果也表明，选择合适的内标阿司帕坦，以相对迁移时间校正标准蛋白质的绝对迁移时间，连续8次进样分析的RSD从1.50%减少至0.75%；以相对峰面积校正标准蛋白质的绝对峰面积，同样连续8次进样分析的RSD从4.26%减少至2.04%，具体数据见表3。
表 3 标准蛋白质电泳分离数据及内标校正结果
, 百拇医药
Tab 3 Electrophoretic data and normalization by internal standard in protein electrophoretic separation No.
Aspartame
Cytochrome C
Lysozyme
tIs(t/min)
AIs
tm(t/min)
A
tm/tIs
, 百拇医药
A/AIs
tm(t/min)
A
tm/tIs
A/AIs
1
4.603
51 771
2.409
36 144
0.5234
, 百拇医药
0.6982
2.731
74 514
0.5933
1.439
2
4.541
51 943
2.431
36 989
0.5353
0.7121
2.727
, 百拇医药
75 381
0.6005
1.451
3
4.660
54 132
2.487
39 021
0.5337
0.7208
2.785
81 005
0.5976
, 百拇医药
1.496
4
4.714
53 968
2.521
38 545
0.5348
0.7142
2.828
78 317
0.5999
1.451
5
, http://www.100md.com
4.676
54 887
2.478
39 642
0.5299
0.7222
2.819
82 819
0.6029
1.509
6
4.635
52 243
, http://www.100md.com
2.451
35 798
0.5288
0.6852
2.803
76 652
0.6047
1.467
7
4.617
54 419
2.475
38 786
, 百拇医药
0.5361
0.7127
2.798
81 896
0.6060
1.505
8
4.644
54 613
2.429
38 906
0.5230
0.7124
, 百拇医药
2.764
82 681
0.5952
1.514
X
4.636
53 497
2.460
37 979
0.5306
0.7097
2.782
79 158
, 百拇医药
0.6000
1.479
RSD(%)
1.12
2.41
1.50
3.83
0.99
1.73
1.37
4.26
0.75
2.04
, 百拇医药
2.4 猪胰腺磷脂酶A2的优化分离与纯度分析 磷脂酶A2是目前研究生物膜和脂蛋白结构与功能的一种重要工具酶。依据上述确立的混合蛋白质毛细管电泳分离、分析步骤，以CZE分离模式，通过添加一定量的线性高分子聚合物0.1% HPMC，利用其潜在的分子筛分作用，磷脂酶A2与其酶原获得了理想的分离效果(图2)，同时由筛分机制可确定迁移时间长的峰为酶原峰。
图 2 磷脂酶A2毛细管电泳分离图谱
Fig 2 Capillary electrophoregram of phospholipase A2
Buffer 0.05 mol/L phosphate solution containing 0.1% HPMC
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(pH2.5); Run voltage 8kV(+)→(-); Load 2kV×4s; On-line
UV detection 200nm; Phospholipase A2 tm 4.510 min;
Zymogen tm 5.075 min
毛细管电泳的高效分离，是以带电粒子的淌度差异为基础的。但是，强电场下毛细管内不同淌度的粒子以不同的迁移速率通过检测窗口，导致了即使浓度相同、紫外吸收一致的分离样品，迁移时间长的粒子明显地比迁移时间短的粒子绝对峰面积要大。因此，文献建议采用峰面积除以迁移时间值(A/tm)来表征样品的定量信息，并成功地应用于多种药物的纯度检查[9]。表4为磷脂酶A2在其优选的HPCE电泳条件下的电泳色谱峰面积与迁移时间数据及纯度分析结果。峰面积百分比与校正峰面积百分比的差别，说明了在一定程度上以A/tm作为定量信息更能反映分析样品的真实纯度。
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表 4 磷脂酶A2的纯度分析
Tab 4 Purity analysis of phospholipase A2(n=3) Criteria
Phospholipase A2
Zymogen
Mean peak area (A/mV*s)
142 353
100 457
Migration time(t/min)
4.510
, 百拇医药
5.075
Total area(%)
58.6
41.4
Normalised peak area
(A/mV*s)
31 564
19 794
Total normalised area(%)
61.5
38.5
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Jorgenson JW, Lukacs KD. Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries. Anal Chem ,1981,53(8):1298
2 Claire RLS. Capillary electrophoresis. Anal Chem, 1996, 68(12):569R
3 傅若农. 毛细管电泳近年的进展. 国外分析仪器，1998,1：1
4 康经武，陆豪杰，欧庆瑜. 毛细管电泳涂层柱技术的进展. 色谱, 1998，16(1):26
5 林彬生， 李浩春，卢佩章. 气相色谱最佳操作条件选择的方法——计算机人工智能谱图模拟法. 色谱，1986，4(4):193
, 百拇医药 6 王 磊， 陈 农，张玉奎. 高效毛细管电泳迁移重复性的考察. 色谱，1993，11(4):207
7 Jorgenson JW, Luckacs KD. Capillary zone electrophoresis. Science, 1983, 222(4621):266
8 McLaughlin GM, Nolan JA, Lindahl JL， et al. Pharmaceutical drug separations by HPCE: practical guidelines. J Liq Chromatogr, 1992，15(6/7):961
9 Altria KD. Essential peak area normalisation for quantitation impurity content determination by capillary electrophoresis. Chromatographia, 1993, 35(3/4)：177
(1997-11-10收稿, 1998-05-29修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长征医院神经外科，上海，200003
关键词：硝苯地平；妊娠高血压综合征；脐动脉；多普勒超声
第二军医大学学报980418 摘要 目的：建立适合混合蛋白质分离分析的高效毛细管电泳方法。方法：采用高效毛细管电泳中自由区带电泳分离模式，以标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶为分析对象，对影响电泳分离的因素进行了考察。结果与结论：通过减少蛋白质管壁吸附、优选缓冲液体系及定性定量信息校正，使细胞色素C与溶菌酶获得了理想的分离，同时成功地应用于磷脂酶A2的优化分离与纯度分析，为蛋白质类生化药物的质量控制提供了简便、快速、有效的检测手段。
中国图书资料分类法分类号 Q51
High performance capillary electrophoresis of proteinaceous products
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Fan Guorong, Hu Jinhong, Lin Mei, An Dengkui (Department of Pharmacy, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective：To establish a high performance capillary electrophoresis (HPCE) method for optimal separation of proteinaceous products. Methods：Cytochrome C and lysozyme were selected as model samples ,and the some factors affecting electrophoretic separation were investigated, based on capillary zone electrophoresis(CZE) mode. Results and Conclusion：Three combined strategies for the optimal separation of cytochrome C and lysozyme were described: the reduction of protein wall adsorption, the optimization for electrophoretic buffer system, and the normalization of HPCE qualitative and quantitative information.Successful application to phospholipase A2 purity analysis was demonstrated.The conclusion was obvious that HPCE should provide a simple, quick and effective analytical tool for proteinaceous drugs quality control.
, 百拇医药
Key words high performance capillary electrophoresis；proteinaceous products；electrophoretic separation
随着现代生物技术的不断发展以及各种新型蛋白质类生化药物的相继问世，传统的SDS-聚丙烯酰胺电泳及常规的液相色谱技术已远远不能适应大规模药物生产过程分析与产品纯度检验的需要。因此，寻找一种高效、快速、简便的质量控制方法已显得越来越重要。
高效毛细管电泳(HPCE)是近年来迅速发展起来的一种新型分离、 分析技术。 1981年， 由于Jorgenson等的出色工作[1]， 为HPCE奠定了理论基础， 展示了毛细管电泳高效、 快速、 简便、 微量的优异特点。 该技术在生物大分子、 无机离子、 光学异构体及有机药物分离、 分析方面获得了广泛的应用[2,3]。
, http://www.100md.com
本文采用HPCE中常用的毛细管区带电泳(CZE)分离模式，以标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶为分析对象，通过减少蛋白质管壁吸附、优选缓冲液体系及定性定量信息的校正等步骤，建立了适合混合蛋白质分离分析的HPCE方法，并成功地应用于磷脂酶A2的优化分离与纯度分析，为蛋白质类生化药物的质量控制提供了简便、快速、有效的检测手段。
1 材料和方法
1.1 仪器与试药 美国Bio-RadHPE-100型高效毛细管电泳仪，日本岛津C-R6A色谱数据处理机，上海大华自动平衡记录仪，上海雷磁pHs-25酸度计。石英毛细管涂渍柱(20cm×25μm)由美国Bio-Rad公司提供，普通石英毛细管柱(30cm×50μm)购自河北永年光导纤维厂。标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶由中国药科大学生物工程中心提供。猪胰腺磷脂酶A2由中国药科大学生物化学教研室提供，在SDS-PAGE凝胶电泳中呈单一区带，相对分子质量约14.3万。羟丙甲基纤维素(E4MP,USPHPMC2910)由上海延安制药厂提供。磷酸氢二钠、柠檬酸、醋酸、盐酸、氢氧化钠等均为国产分析纯，水为重蒸馏水。
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1.2 实验方法 按要求配制实验所需各种缓冲溶液，使用前用0.45 μm微孔滤膜过滤。细胞色素C与溶菌酶及磷脂酶A2样品液均用重蒸镏水溶解而成，浓度约为100 μg/ml。石英毛细管涂渍柱使用前分别用重蒸馏水和所用缓冲液清洗5～10 min。新装普通石英毛细管柱则应依次用0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L HCl液和重蒸馏水各清洗5～10 min。电泳分离前各操作缓冲液需动态平衡5 min，每次分析之后用缓冲液冲洗毛细管1～2 min。每次电泳操作运行电压8 kV，电动进样2 kV×4 s，柱上200 nm检测。室温：(16+1)℃。
2 结果与讨论
2.1 电泳分离过程中蛋白质吸附的控制 蛋白质HPCE分离最主要的问题是毛细管内壁的吸附。文献报道采用多种方法加以解决，其中在毛细管内壁涂以不带电荷的亲水性聚合物，可以减小甚至于消除电渗流，从而使蛋白质在管壁上的吸附减小到最低程度[4]。本实验结果发现，在pH 2.5磷酸盐缓冲液条件下细胞色素C与溶菌酶在普通石英毛细管柱、石英毛细管涂渍柱中的电迁移过程呈现不同的分离特征。细胞色素C与溶菌酶是碱性蛋白质，在pH2.5酸性缓冲液中呈正电荷粒子，即使石英毛细管硅醇基此时几乎不电离，但混合蛋白质依然受到普通石英毛细管柱壁的强烈吸附；而选择石英毛细管涂渍柱分离碱性混合蛋白质，其电泳谱图中峰宽与峰拖尾都明显减小。同时，用毛细管两次进样间的缓冲液冲洗措施，不仅可去除管内潴留的干扰杂质，更重要的是有助于保持管壁表面状态的恒定。表1列举了细胞色素C与溶菌酶在pH2.5磷酸盐缓冲液条件下HPCE分离的特征。可见，选择石英毛细管涂渍柱，采用低pH值的缓冲液且注意两次进样间隔清洗毛细管，可使混合蛋白质电泳分离达到分离效能高、定量重现性好的目的。
, 百拇医药
表 1 标准蛋白质电泳分离的柱效和迁移时间重现性
Tab 1 Column efficiency and migration reproducibility for standard protein electrophoretic separation Protein
Voltage (U/kV)
Column efficiency (pl/m)
Migration time RSD (%, n=5)
Coated△
Uncoated△
Washed▲
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Unwashed▲
Cytochrome C
6
273 000
87 000
1.37
2.34
8
307 000
105 000
1.23
2.81
, 百拇医药
10
285 000
68 000
1.44
2.55
Lysozyme
6
261 000
71 000
1.31
1.79
8
286 000
, http://www.100md.com
93 000
1.46
2.38
10
275 000
84 000
1.34
2.27
△Electrophoretic separations were carried out in coated/uncoated capillary；▲Coated capillary was prewashed/unwashed between runs,using acidic buffer solution
, 百拇医药
2.2 标准蛋白质优化分离缓冲液体系的选择 电泳缓冲液体系中不同缓冲对的选择，在一定程度上可以改善HPCE的分离效果。本文选择常用的磷酸盐缓冲液(pKa1 2.12, pKa2 7.21, pKa3 12.32)、柠檬酸盐缓冲液(pKa1 3.06, pKa2 4.74, pKa3 5.40)及醋酸盐缓冲液(pKa 4.75)，来考察不同缓冲液对标准蛋白质电迁移与分离度的影响，结果列于表2。显而易见，选择在0.05 mol/L，pH2.5条件下大体积、低电荷、较强缓冲能力的柠檬酸盐缓冲液，可以使标准蛋白质细胞色素C与溶菌酶获得满意的分离效果，其典型电泳谱图如图1所示。
2.3 HPCE定性定量信息的校正 HPCE定性、定量重现性的好坏直接关系到一个分析方法的可靠程度。HPCE作为新兴的分离、分析技术，其分离重现性一直是人们普遍关注的一个问题。在毛细管电泳中，荷电粒子的迁移速度由电场作用下毛细管内电渗流与电泳流共同决定。其定性信息迁移时间tm[6]：
, 百拇医药
表 2 缓冲液种类对电泳分离的影响
Tab 2 The effects of buffer type on
electrophoretic separations(n=5,
±s, t/min) ProteinMigration time△
Phosphate
Citrate
Acetate
Cytochrome C
2.513±0.031
, 百拇医药
2.473±0.035
2.318±0.034
Lysozyme
2.672±0.039
2.784±0.039
2.432±0.032
PV▲[5]
0.9634
1.000
0.9447
△Electrophoretic separations were carried out in Bio-Rad coated capillary,using 0.05 mol/L buffer solution at pH2.5； ▲The minimum resolution PV =1-V/H as Lin BS et al adopted in [5]
, http://www.100md.com
图 1 标准蛋白质细胞色素C和溶菌酶优化分离电泳图谱
Fig 1 Typical electrophoregram of cytochrome C and
lysozyme under the optimum electrophoretic conditions
Cytochrome C tm 2.475 min; Lysozyme tm 2.798 min;
Aspartame (Is) tm 4.617 min
式中：l为毛细管的有效长度；η为缓冲液的粘度；ε为缓冲液的介电常数；E为电场强度；ξc为毛细管内壁的ξ电位；ξ为荷电粒子在毛细管中ξ电位；K为荷电粒子双电层厚度的倒数；a为荷电粒子的半径。
, 百拇医药
而电泳分离的定量信息峰面积(Ai)则反映了电迁移的进样量大小Q[7]，那么：
又荷电粒子的表观淌度μa[8]：
式中：μe为电泳淌度；μeo为电渗淌度；Vi为进样电压；π为圆周率常数； r为毛细管的半径；c为荷电粒子的浓度；ti为进样时间；L为毛细管总长度；tm为荷电粒子的迁移时间；V为运行电压。
由(1)，(4)式可知，表征HPCE定性、定量信息的迁移时间tm、峰面积Ai与每次分离中的电场强度、进样电压、进样时间等可控参数和毛细管内壁表面状态、缓冲液粘度、介电常数等模糊参数有关，其中任一参数的变化都会不同程度地影响电泳分离的重现性。
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如果选择一合适的物质作为内标(Is)，与分析溶质(i)在同一电泳过程中进行分离、分析，并以相对迁移时间tmi/tmIs(溶质迁移时间/内标迁移时间)和相对峰面积Ai/Ais(溶质峰面积/内标峰面积)作为HPCE定性、定量分析的指标，那么：
显然，采用内标法处理HPCE迁移时间与峰面积，理论上有助于消除可控参数，并一定程度上控制模糊参数对电泳分离重现性的影响。实验结果也表明，选择合适的内标阿司帕坦，以相对迁移时间校正标准蛋白质的绝对迁移时间，连续8次进样分析的RSD从1.50%减少至0.75%；以相对峰面积校正标准蛋白质的绝对峰面积，同样连续8次进样分析的RSD从4.26%减少至2.04%，具体数据见表3。
表 3 标准蛋白质电泳分离数据及内标校正结果
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Tab 3 Electrophoretic data and normalization by internal standard in protein electrophoretic separation No.
Aspartame
Cytochrome C
Lysozyme
tIs(t/min)
AIs
tm(t/min)
A
tm/tIs
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A/AIs
tm(t/min)
A
tm/tIs
A/AIs
1
4.603
51 771
2.409
36 144
0.5234
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0.6982
2.731
74 514
0.5933
1.439
2
4.541
51 943
2.431
36 989
0.5353
0.7121
2.727
, 百拇医药
75 381
0.6005
1.451
3
4.660
54 132
2.487
39 021
0.5337
0.7208
2.785
81 005
0.5976
, 百拇医药
1.496
4
4.714
53 968
2.521
38 545
0.5348
0.7142
2.828
78 317
0.5999
1.451
5
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4.676
54 887
2.478
39 642
0.5299
0.7222
2.819
82 819
0.6029
1.509
6
4.635
52 243
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2.451
35 798
0.5288
0.6852
2.803
76 652
0.6047
1.467
7
4.617
54 419
2.475
38 786
, 百拇医药
0.5361
0.7127
2.798
81 896
0.6060
1.505
8
4.644
54 613
2.429
38 906
0.5230
0.7124
, 百拇医药
2.764
82 681
0.5952
1.514
X
4.636
53 497
2.460
37 979
0.5306
0.7097
2.782
79 158
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0.6000
1.479
RSD(%)
1.12
2.41
1.50
3.83
0.99
1.73
1.37
4.26
0.75
2.04
, 百拇医药
2.4 猪胰腺磷脂酶A2的优化分离与纯度分析 磷脂酶A2是目前研究生物膜和脂蛋白结构与功能的一种重要工具酶。依据上述确立的混合蛋白质毛细管电泳分离、分析步骤，以CZE分离模式，通过添加一定量的线性高分子聚合物0.1% HPMC，利用其潜在的分子筛分作用，磷脂酶A2与其酶原获得了理想的分离效果(图2)，同时由筛分机制可确定迁移时间长的峰为酶原峰。
图 2 磷脂酶A2毛细管电泳分离图谱
Fig 2 Capillary electrophoregram of phospholipase A2
Buffer 0.05 mol/L phosphate solution containing 0.1% HPMC
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(pH2.5); Run voltage 8kV(+)→(-); Load 2kV×4s; On-line
UV detection 200nm; Phospholipase A2 tm 4.510 min;
Zymogen tm 5.075 min
毛细管电泳的高效分离，是以带电粒子的淌度差异为基础的。但是，强电场下毛细管内不同淌度的粒子以不同的迁移速率通过检测窗口，导致了即使浓度相同、紫外吸收一致的分离样品，迁移时间长的粒子明显地比迁移时间短的粒子绝对峰面积要大。因此，文献建议采用峰面积除以迁移时间值(A/tm)来表征样品的定量信息，并成功地应用于多种药物的纯度检查[9]。表4为磷脂酶A2在其优选的HPCE电泳条件下的电泳色谱峰面积与迁移时间数据及纯度分析结果。峰面积百分比与校正峰面积百分比的差别，说明了在一定程度上以A/tm作为定量信息更能反映分析样品的真实纯度。
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表 4 磷脂酶A2的纯度分析
Tab 4 Purity analysis of phospholipase A2(n=3) Criteria
Phospholipase A2
Zymogen
Mean peak area (A/mV*s)
142 353
100 457
Migration time(t/min)
4.510
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5.075
Total area(%)
58.6
41.4
Normalised peak area
(A/mV*s)
31 564
19 794
Total normalised area(%)
61.5
38.5
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Jorgenson JW, Lukacs KD. Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries. Anal Chem ,1981,53(8):1298
2 Claire RLS. Capillary electrophoresis. Anal Chem, 1996, 68(12):569R
3 傅若农. 毛细管电泳近年的进展. 国外分析仪器，1998,1：1
4 康经武，陆豪杰，欧庆瑜. 毛细管电泳涂层柱技术的进展. 色谱, 1998，16(1):26
5 林彬生， 李浩春，卢佩章. 气相色谱最佳操作条件选择的方法——计算机人工智能谱图模拟法. 色谱，1986，4(4):193
, 百拇医药 6 王 磊， 陈 农，张玉奎. 高效毛细管电泳迁移重复性的考察. 色谱，1993，11(4):207
7 Jorgenson JW, Luckacs KD. Capillary zone electrophoresis. Science, 1983, 222(4621):266
8 McLaughlin GM, Nolan JA, Lindahl JL， et al. Pharmaceutical drug separations by HPCE: practical guidelines. J Liq Chromatogr, 1992，15(6/7):961
9 Altria KD. Essential peak area normalisation for quantitation impurity content determination by capillary electrophoresis. Chromatographia, 1993, 35(3/4)：177
(1997-11-10收稿, 1998-05-29修回), http://www.100md.com