斑点免疫金渗滤试验检测泌尿生殖道沙眼衣原体
作者：王启操 张国威 何云志
单位：266071 青岛，空军青岛疗养院皮肤科(王启操)； 第三军医大学新桥医院皮肤科[张国威(导师) 何云志]
关键词：
中国皮肤科杂志980323 泌尿生殖道沙眼衣原体(CT)的快速检测在性病防治中具有重要意义。我们以CT单克隆抗体作为包被抗体，采用胶体金标记及膜渗滤技术，建立了快速检测CT的斑点免 疫金渗滤试验(DIGFA)，现报道如下。
一、资料和方法
(一)研究对象：选择本院性病门诊2周内未用药患者121例，包括淋病28例，非淋菌性尿道炎70例，尖锐湿疣10例及其它性病13例。男85例，女36例；年龄18～56岁，平均27岁。
(二)McCoy细胞株及CT标准株TE55由北京眼科研究所提供，氯金酸(HAuCL4，4H2O)为 广州立新化工厂产品，0.45μm微孔硝酸-醋酸混合纤维素膜为上海新亚净化器材厂产品，CT外膜蛋白单克隆抗体由军事医学科学院五所端青副研究员惠赠。
, http://www.100md.com
(三)方法：
1.标本采集：两根竹杆棉拭子常规取材，标本分别洗入装有1.5ml转运培养基(2-SP)和1. 5ml生理盐水的冻存管内，洗涤时，拭子应充分振荡挤压，前者用于细胞培养法分离CT，后者冻融吹打后于15000r/min离心20分钟，弃上清，留约0.3ml液体，振荡使沉淀悬浮，用于DIGFA。
2.McCoy细胞培养及CT的分离培养，参照文献[1]进行。
3.CT鸡胚卵黄囊接种、抗原提纯和动物免疫参照文献[2]进行，抗体纯化采用硫酸铵盐析和戍二醛交联吸附法，抗体双扩效价1∶16。
4.胶体金制备、标记和纯化参照文献[3]进行。
5.DIGFA，参见文献[4]，检测装置为一镶嵌有混合纤维素膜的塑料小盒，内有吸水垫料 ，外有过滤装置。基本过程包括抗体包被、加样、免疫金染色和洗涤液冲洗等5个步骤，阳性结果在反应孔中央可见一紫红色斑点，斑点形状与抗体包被的形状相同，洗涤液冲洗不退色；阴性结果无明显颜色变化。每组实验均设阳性对照和阴性对照。
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6.敏感性和特异性测定：以CT提纯抗原(5mg/ml)从高浓度依次10倍稀释做DIGFA，检测其阳性的最大稀释倍数；以CT标准株TE55及淋球菌、解脲支原体、乳酸杆菌做DIGFA，检测有无交叉反应。
7.稳定性：将抗体包被、阻断液封闭的检测小盒，室温保存3周做DIGFA，检测其稳定性。
二、结果
1.DIGFA的敏感性和特异性：以DIGFA检测CT标准株TE55为阳性，抗原最小检出量为50ng/ml 。而淋球菌、解脲支原体和乳酸杆菌皆阴性(抗原浓度为5×106ccu/ml或cfu/ml)，CT与其它菌种间无交叉反应。
2.DIGFA的稳定性：抗体包被、阻断液封闭的检测小盒，室温保存3周，不影响检测效果。
3.临床标本检测结果：121例临床标本检测结果，DIGFA阳性35例，细胞培养阳性37例，两种方法同时阳性32例，同时阴性81例，113例检测结果一致，二者的符合率为93.4%。细胞培 养阳性、DIGFA阴性5例，细胞培养阴性、DIGFA阳性3例。若以细胞培养法的结果为“金标准 ”，则DIGFA的敏感性为86.5%、特异性为96.4%、阳性预测值为91.4%、阴性预测值为94 .2%，约登指数0.83。
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在DIGFA检测的35例阳性标本中，淋病4例，占淋病总数的14.3%；非淋菌性尿道炎27例，占该病总数的38.6%；尖锐湿疣2例，占该病总数的20%；其它2例，占15.4%。
三、讨论
我们以CT单克隆抗体作为包被抗体，应用自制的胶体金探针建立了DIGFA。121例临床标本， DIGFA阳性35例，113例检测结果与培养法一致，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为86.5%、96.4%、91.4%、94.2%，可检测50ng/ml CT抗原，而且与支原体、淋球菌 等无交叉反应。由于该实验不需任何复杂仪器，并且可在数分钟内观测结果，因此是一种很有前景的CT快速检测方法。3例DIGFA阳性而细胞培养阴性者，可能是在细胞接种过程中CT已死，也可能为假阳性，5例细胞培养阳性而DIGFA阴性者，可能是标本中CT抗原含量太少的缘故。
参考文献
1 王启操, 张国威, 何云志, 等. 泌尿生殖道沙眼衣原体分离培养 方法探讨. 中华皮肤科杂志, 1996,29∶198-199.
2 魏曦. 衣原体概论. 医用立克次体学. 上海: 上海科学技术出版社, 1984.380- 410.
3 蔡文琴. 免疫金染色. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都: 四川科学 技术出版社, 1994.98-120.
4 兰小鹏, 黄俏佳, 涂向东, 等. 快速斑点免疫金渗滤试验法检测双链DNA抗体. 中 华皮肤科杂志, 1997,30∶49-50., 百拇医药
单位：266071 青岛，空军青岛疗养院皮肤科(王启操)； 第三军医大学新桥医院皮肤科[张国威(导师) 何云志]
关键词：
中国皮肤科杂志980323 泌尿生殖道沙眼衣原体(CT)的快速检测在性病防治中具有重要意义。我们以CT单克隆抗体作为包被抗体，采用胶体金标记及膜渗滤技术，建立了快速检测CT的斑点免 疫金渗滤试验(DIGFA)，现报道如下。
一、资料和方法
(一)研究对象：选择本院性病门诊2周内未用药患者121例，包括淋病28例，非淋菌性尿道炎70例，尖锐湿疣10例及其它性病13例。男85例，女36例；年龄18～56岁，平均27岁。
(二)McCoy细胞株及CT标准株TE55由北京眼科研究所提供，氯金酸(HAuCL4，4H2O)为 广州立新化工厂产品，0.45μm微孔硝酸-醋酸混合纤维素膜为上海新亚净化器材厂产品，CT外膜蛋白单克隆抗体由军事医学科学院五所端青副研究员惠赠。
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(三)方法：
1.标本采集：两根竹杆棉拭子常规取材，标本分别洗入装有1.5ml转运培养基(2-SP)和1. 5ml生理盐水的冻存管内，洗涤时，拭子应充分振荡挤压，前者用于细胞培养法分离CT，后者冻融吹打后于15000r/min离心20分钟，弃上清，留约0.3ml液体，振荡使沉淀悬浮，用于DIGFA。
2.McCoy细胞培养及CT的分离培养，参照文献[1]进行。
3.CT鸡胚卵黄囊接种、抗原提纯和动物免疫参照文献[2]进行，抗体纯化采用硫酸铵盐析和戍二醛交联吸附法，抗体双扩效价1∶16。
4.胶体金制备、标记和纯化参照文献[3]进行。
5.DIGFA，参见文献[4]，检测装置为一镶嵌有混合纤维素膜的塑料小盒，内有吸水垫料 ，外有过滤装置。基本过程包括抗体包被、加样、免疫金染色和洗涤液冲洗等5个步骤，阳性结果在反应孔中央可见一紫红色斑点，斑点形状与抗体包被的形状相同，洗涤液冲洗不退色；阴性结果无明显颜色变化。每组实验均设阳性对照和阴性对照。
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6.敏感性和特异性测定：以CT提纯抗原(5mg/ml)从高浓度依次10倍稀释做DIGFA，检测其阳性的最大稀释倍数；以CT标准株TE55及淋球菌、解脲支原体、乳酸杆菌做DIGFA，检测有无交叉反应。
7.稳定性：将抗体包被、阻断液封闭的检测小盒，室温保存3周做DIGFA，检测其稳定性。
二、结果
1.DIGFA的敏感性和特异性：以DIGFA检测CT标准株TE55为阳性，抗原最小检出量为50ng/ml 。而淋球菌、解脲支原体和乳酸杆菌皆阴性(抗原浓度为5×106ccu/ml或cfu/ml)，CT与其它菌种间无交叉反应。
2.DIGFA的稳定性：抗体包被、阻断液封闭的检测小盒，室温保存3周，不影响检测效果。
3.临床标本检测结果：121例临床标本检测结果，DIGFA阳性35例，细胞培养阳性37例，两种方法同时阳性32例，同时阴性81例，113例检测结果一致，二者的符合率为93.4%。细胞培 养阳性、DIGFA阴性5例，细胞培养阴性、DIGFA阳性3例。若以细胞培养法的结果为“金标准 ”，则DIGFA的敏感性为86.5%、特异性为96.4%、阳性预测值为91.4%、阴性预测值为94 .2%，约登指数0.83。
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在DIGFA检测的35例阳性标本中，淋病4例，占淋病总数的14.3%；非淋菌性尿道炎27例，占该病总数的38.6%；尖锐湿疣2例，占该病总数的20%；其它2例，占15.4%。
三、讨论
我们以CT单克隆抗体作为包被抗体，应用自制的胶体金探针建立了DIGFA。121例临床标本， DIGFA阳性35例，113例检测结果与培养法一致，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为86.5%、96.4%、91.4%、94.2%，可检测50ng/ml CT抗原，而且与支原体、淋球菌 等无交叉反应。由于该实验不需任何复杂仪器，并且可在数分钟内观测结果，因此是一种很有前景的CT快速检测方法。3例DIGFA阳性而细胞培养阴性者，可能是在细胞接种过程中CT已死，也可能为假阳性，5例细胞培养阳性而DIGFA阴性者，可能是标本中CT抗原含量太少的缘故。
参考文献
1 王启操, 张国威, 何云志, 等. 泌尿生殖道沙眼衣原体分离培养 方法探讨. 中华皮肤科杂志, 1996,29∶198-199.
2 魏曦. 衣原体概论. 医用立克次体学. 上海: 上海科学技术出版社, 1984.380- 410.
3 蔡文琴. 免疫金染色. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都: 四川科学 技术出版社, 1994.98-120.
4 兰小鹏, 黄俏佳, 涂向东, 等. 快速斑点免疫金渗滤试验法检测双链DNA抗体. 中 华皮肤科杂志, 1997,30∶49-50., 百拇医药