线粒体DNA缺失突变在氨基糖甙类抗生素耳毒易感中的作用
作者：孔维佳 刘俊 董继华
单位：孔维佳(430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科)；刘俊(430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科)；董继华(实验中心)
关键词：DNA；线粒体；；突变；；迷路；；阿霉素；；卡那霉素
中华耳鼻咽喉科杂志000205 【摘要】 目的 建立大鼠线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺失突变模型，探讨mtDNA缺失突变在氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotics，AmAn)耳毒易感性中的作用。方法 取Wistar大鼠随机分为A、B两组，每组15只。其中A组大鼠以皮下注射阿霉素(doxorubicin,DOX)2 mg/kg体重，每周2次共3个月，B组则以生理盐水取代DOX。然后A、B组均连续腹腔注射卡那霉素(kanamycin, KM)每日500 mg/kg体重共10 d。用药前、后测试听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)阈，并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术对大鼠内耳膜迷路mtDNA 4 834bp缺失突变进行检测。结果 ①A、B两组大鼠用KM前、后，ABR反应阈提高，均值(
±s)分别为(67.08±8.59) dB peSPL和(12.71± 4.42)dB peSPL，二组均数间差异有显著性意义(P<0.01)；②大鼠内耳组织mtDNA检测发现：A组有9/15只存在4 834 bp片段缺失，而在B组未检测到4 834 bp片段缺失。结论 DOX可诱导大鼠内耳组织mtDNA缺失突变。大鼠内耳组织mtDNA缺失突变可增加其对AmAn耳毒作用的敏感性。
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The role of mtDNA deletion in the sensitivity to aminoglycoside antibiotic induced deafness
KONG Weijia, LIU Jun, DONG Jihua.
(Department of Otorhinolaryngology, Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022,China)
Corresponding author: KONG Weijia(Email：weijiak@public.wh.hb.cn)
【Abstract】 Objective To establish an animal model of mitochondrial DNA(mtDNA) deletion and investigate the possible role of mtDNA deletion in aminoglycoside antibiotic induced deafness. Methods Thirty wistar rats (4 months) were randomly divided into group A and B. Doxorubicin (DOX) was subcutaneously injected at doses of 2 mg/kg twice per week for 3 months in group A and then kanamycin (KM) was intraperitoneally injected 500 mg/kg per day for 10 consecutive days. The treatments of group B were identical to group A, except normal saline was substituted for DOX. The thresholds of auditory brainstem response (ABR) were measured before and after the drug administrations. The inner ear membranous labyrinthine tissue was harvested and mtDNA was amplified to identify 4 834bp deletion by PCR technique. Results The elevation of the mean ABR thresholds in group A(67.08±8.59) dB peSPL was significantly higher than that in group B (12.71±4.42)dB peSPL after KM administration(P<0.001). In group A, 9 of the 15 rats demonstrated 4 834 bp mtDNA deletion. However, mtDNA 4 834 bp deletion was negative in group B animals. Conclusion DOX can induce mtDNA deletion in the inner ear tissue of the rat. mtDNA deletion in the inner ear may play an important role in the hypersensitivity to aminoglycoside antibiotic ototoxicity.
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【Key words】 DNA, mitochoudrial； Mutation； Labyrinth； Doxorubicin, Kanamycin
氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotics, AmAn)耳毒性作用的机制尚未完全阐明。近年来研究报道，部分有母系遗传家族史患者对AmAn耳毒性作用高度敏感，并与线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)12S rRNA基因1 555位A→G点突变有关[1]。然而，多数散发的AmAn耳毒性聋的患者并不存在mtDNA 1 555G点突变[2]，尚有AmAn致聋家系中呈1 555G点突变阴性的报道[3]。此外，在临床和动物实验中存在一个重要现象，即老龄人和老龄动物对AmAn耳毒作用的敏感性远大于青壮年。老龄机体对AmAn耳毒作用高敏感性的机制尚不清楚。mtDNA突变有3种类型：点突变、缺失突变和重组突变。近来研究提示mtDNA缺失突变亦与许多疾病相关[4]。Seidman等[5]报道老龄大鼠内耳存在mtDNA 4 834bp缺失突变，而Bai等[6]在老年人颞骨标本中也检出mtDNA 4 977bp缺失突变，并认为它们与老年性聋有关。本实验旨在建立一种大鼠mtDNA缺失突变模型，并探讨大鼠mtDNA片段缺失在AmAn致聋易感中的作用。
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材料与方法
一、实验动物及步骤
耳廓反应灵敏的4个月龄Wistar大鼠(同济医科大学动物实验中心提供)30只，雌雄不限，随机分A、B两组各15只。A组：皮下注射阿霉素(doxorubicin,DOX；浙江海门制药厂，批号135501)2 mg/kg体重，每周2次共3个月，再连续腹腔注射卡那霉素(kanamycin,KM；江苏前进制药厂，批号971224)每日500 mg/kg体重共10 d。B组用药方法同A组，但用生理盐水替代DOX。注射DOX或生理盐水前以及KM前、后分别按本室建立的方法检测听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)的反应阈，使用SpiritTM诱发电位仪检测，电极安放及刺激参数和记录方法详见参考文献[7]，然后取出内耳膜迷路组织，提取内耳组织mtDNA，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增4 834bp缺失后断裂融合基因片段并作电泳分析。
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二、内耳膜迷路mtDNA的提取
动物在2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉下最后一次检测ABR反应阈后迅速断头，取出两侧听泡及部分脑组织，置于预冷4℃的充氧无钙镁细胞外液中(0.1 mol/L PBS,pH 7.4)。在体视显微镜下解剖出血管纹、Corti器和蜗轴、椭圆囊、球囊及壶腹嵴。每只动物两侧内耳相同组织合在一起，置入匀浆管中加TE缓冲液[10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，pH8.0]200 μL匀浆，加细胞裂解液1 000 μL[10 mmol/L Tris (pH 8.0), 50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA，2% 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)]，最后加1%胰蛋白酶(终质量浓度1～2.5 μg/ml)，37℃温水浴中消化24 h。
采用酚-氯仿-异戊醇标准法稍加改良提取DNA，基本步骤如下：①经胰蛋白酶消化的组织混悬液中加等体积饱和酚离心，取上清液；②加等体积酚∶氯仿(25∶24)分离细胞碎屑、蛋白质及核DNA；③用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提去除残存酚；④乙酸钠及无水乙醇沉淀DNA；⑤预冷的70%乙醇及无水乙醇分别洗涤DNA，空气干燥，20 μL TE缓冲液溶解核酸沉淀；⑥DNA质量浓度测定：UV-240紫外分光光度仪 (Shimadyu,日本) 测定A260nm、A280nm吸光度，估计DNA浓度及纯度：DNA纯度要求为A260 nm/A280 nm> 1.7； DNA质量浓度(μg/ μL)＝(DNA的A260 nm×50×DNA稀释倍数)/1 000。
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三、PCR扩增
参照Seidman等[5]报道的核苷酸序列设计引物，特异扩增mtDNA 4 834bp片段丢失后断裂融合基因的引物核苷酸序列(上海生工公司合成)如下：
P1:5′-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3′-7701
P2:5′-AGTGAGATAAGGAGGCCTGC-3′-13110
PCR反应体系按常规方法配制,终浓度为：MgCl 1.5 mmol/L,dNTPs 200 μmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.25 U，模板mtDNA 100～300 ng，总体积为40 μL。扩增条件：首次94℃变性3 min；循环：94℃变性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸1 min，共循环35次；末次72℃延伸10 min。PCR扩增产物于加有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中电泳分析。
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四、统计学处理
ABR反应阈移分析采用t检验。各组用药前后ABR阈移采用配对t检验，A组mtDNA4 834 bp缺失阳性及阴性动物之间注射KM前后ABR阈移分析采用两个样本间的显著性检验。
结果
一、ABR测试结果
A组：15只动物(24耳)用DOX前ABR反应阈均值为40.21±4.54(dB peSPL,±s,下同),用KM前、后其ABR反应阈均值分别为：50.42±6.90和117.50±4.42，用KM后ABR反应阈提高均值为67.08±8.59。均数间差异有显著性意义(P<0.01)。B组15只动物(24耳)用生理盐水前后ABR反应阈均值为40.42±4.64和42.18±6.27，均数间差异无显著性意义；而注射KM后ABR反应阈均值达55.13±6.89，ABR反应阈均值提高12.05±4.16 dB，均数间差异有显著性意义(P<0.01)。A、B组大鼠用KM后ABR反应阈提高以A组为甚，两组间差异有显著性意义(P<0.001)。
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二、内耳组织mtDNA缺失突变
按特异性设计的引物，若存在大鼠mtDNA 4 834bp缺失，则PCR扩增4 834bp丢失后断裂融合基因片段长度为597bp，PCR产物经电泳鉴定：在标准标记核酸695bp和515bp之间有1条清晰的DNA条带，即目的DNA片段(图1), 提示存在约 4 000～5 000bp的 mtDNA 片段缺失。若无缺失存在，因较短的延伸时间，不足以扩增合成近5 000 bp的片段，将无片段产生。另外，从A组和B组各随机采集了5只大鼠的脑组织标本，A组大鼠脑组织 mtDNA 存在该4 000～5 000 bp 缺失突变(5/5)，而 B 组大鼠脑组织检测阴性(0/5)。
本实验A组内耳组织4 834bp缺失突变共9只，阳性率为60%，B组内耳组织4 834bp缺失突变均为阴性。
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1 核酸标准分子量标记物；2～4 分别为A组大鼠脑组织、血管纹和囊斑，示597 bp条带；
5 B组大鼠血管纹PCR扩增阴性
图1 大鼠内耳mtDNA PCR扩增产物电泳分析
讨论
一、DOX诱导大鼠内耳膜迷路mtDNA缺失突变
线粒体DNA是哺乳动物细胞内的核外遗传物质。大鼠mtDNA是由16 298 bp组成的闭环双链状分子，编码13种mRNAs，12S和16S两种rRNAs、以及翻译所需的22种tRNAs，这13种mRNA编码的多肽链亚单位与核基因编码的蛋白质共同组成氧化磷酸化必需的5种酶复合物[8]。近年来的研究提示，mtDNA突变与多种退行性疾病关系密切。已证实与数种疾病如Leber遗传性神经病、慢性进行性眼外肌麻痹、Kearns-Sayre综合征、母系遗传的糖尿病及耳聋和mtDNA 1 555G阳性的家庭遗传性AmAn耳毒性聋等疾病的发生有关[4]。因此，建立内耳mtDNA突变的动物模型对探讨某些内耳疾病的发生和发展机理及其防治方法等有着极重要的价值。本实验采用DOX诱导动物内耳mtDNA突变。DOX是一种高效的抗肿瘤药,Adachi等[9]报道DOX能引起小鼠心肌mtDNA发生约4 000 bp的缺失突变。本研究慢性应用DOX后，在60%的实验大鼠内耳组织中检测到mtDNA 4 000～5 000bp缺失突变，而在对照组(B组)未检测到这种突变，研究结果表明，DOX可诱导大鼠内耳mtDNA缺失突变。
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DOX诱导内耳mtDNA缺失突变的机制尚不清楚。与核DNA(nDNA)相比，mtDNA无组蛋白保护，易受活性氧等自由基损害。线粒体是细胞内自由基的主要来源，在线粒体基质中存在较高浓度的自由基等氧化磷酸化反应副产物。氧自由基包括羟自由基(OH-)和超氧阴离子(O-2)等，在生理条件下，O-2被超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)所破坏，而SOD酶活性易受各种因素影响，使一些O-2逃脱SOD的破坏，并与过氧化物反应产生活性更强的羟自由基(OH-)。Doroshow等[10]报道，DOX可增加心肌内自由基的形成。DOX诱导大鼠内耳mtDNA缺失突变，可能是通过增加氧自由基对mtDNA的损伤而造成的。
二、线粒体DNA缺失突变与AmAn耳毒作用易感性的关系
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Prezant等[1]和Fischel-Ghodsian等[2]研究提示mtDNA 1 555A→G点突变者对AmAn耳毒作用高度敏感，其作用机制亦得到揭示[11]。但大多数无家族史的AmAn中毒性聋患者呈mtDNA 1 555G突变阴性。这些人群AmAn耳中毒作用机制至今尚未彻底阐明。本研究在建立大鼠内耳mtDNA缺失突变模型的基础上，观察mtDNA缺失突变动物对AmAn耳中毒作用的敏感性。实验发现用DOX诱导mtDNA缺失突变的动物组在施用KM后，其ABR平均反应阈显著提高；而对照组在施用KM后，其ABR平均反应阈仅轻度提高，且该组mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检出率为零。结果提示内耳mtDNA缺失突变可能与内耳对AmAn耳中毒作用的敏感性有关。
大鼠mtDNA 4 000～5 000 bp缺失核苷酸位nt7701-13110之间，其基因编码涉及呼吸链酶复合物Ⅰ的亚单位ND3、ND4、ND4L、ND5，细胞色素C氧化酶亚单位COIII，ATP合成酶亚单位6及5种tRNAs。该片段缺失后可使呼吸链酶蛋白合成发生障碍，线粒体氧化磷酸化功能下降，ATP生成减少[4]；而ATP对毛细胞和血管纹等维持内耳离子平衡和内环境稳定非常重要。故内耳ATP生成减少可导致蜗内离子失平衡、内环境紊乱，从而非特异性地增加机体对AmAn耳毒性作用的敏感性。
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在DOX预处理的A组动物中,有6只大鼠未检测出mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变。将A组大鼠内耳mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检测阳性和检测阴性动物注射KM前后ABR反应阈移进行分析发现，A组动物内耳mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检测阳性(9只)和阴性(6只) 大鼠ABR反应阈移分别为(70.71±7.56) dB和(62.00±7.53) dB，前者高于后者，均数间差异有显著性意义(t检验, P<0.05)。A 组动物内耳 mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检测阴性大鼠ABR反应阈提高的可能机理是：其它因素如mtDNA非4 000～5 000 bp缺失突变或核DNA突变等亦可能存在。因为本实验仅设计检测了mtDNA突变率较高的4 834 bp缺失突变，而DOX可能通过增加氧自由基对内耳组织DNA造成多种损伤。文献[12]报道尚有多种形式的mtDNA突变存在的可能。
参考文献
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1，Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness.Nat Genet， 1993,4:289-294.
2，Fishel-Ghodsian N, Prezant TR,Bu X,et al. Mitochondrial ribosomal RNA gene mutation in a patient with sporadic aminoglycoside ototoxicity. Am J Otolaryngol, 1993,14: 399-403.
3，袁慧军，姜泗长，杨伟炎. 氨基糖甙类抗生素致聋家系线粒体DNA 1 555G点突变分析. 中华耳鼻咽喉科杂志，1998,33:67-70.
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4，Grossman LI, Shoubridge EA. Mitochondrial genetics and human disease. Bioessays, 1996,18:983-991.
5，Seidman MD, Bai U, Khan MJ, et al. Mitochondrial DNA deletion associated with aging and presbyacusis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1997,123:1039-1045.
6，Bai U, Seidman MD, Hinojosa R,et al. Mitochondrial DNA deletions associated with aging and possibly presbycusis: a human archival temporal bone study. Am J Otol, 1997,18:449-453.
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7，孔维佳，汪吉宝，钟乃川. 豚鼠耳蜗电图及听觉脑干电位同步记录法的探讨. 临床耳鼻咽喉科杂志，1989,3:148-152.
8，Gadaleta G, Pepe G, De Candia G, et al. The complete nucleotide sequence of the Rattus norvegicus mitochondrial genome: cryptic signals revealed by comparative analysis between vertebrates. J Mol Evol, 1989,28:497-516.
9，Adachi K, Fujiura Y, Mayumi F, et al. A deletion of mitochondrial DNA in murine doxorubicin-induced cardiotoxicity. Biochem Biophys Res Commun, 1993,195:945-951.
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10，Doroshow JH. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart. Cancer Res, 1983, 43:460-472.
11，Inoue K, Takai D, Soejima A, et al. Mutant mtDNA at 1 555 A to G in 12S rRNA gene and hypersusceptibility of mitochondrial translation to streptomycin can be co-transferred to rho 0 HeLa cells.Biochem Biophys Res Commun,1996,223:496-501.
12，Van Tuyle GC,Gudikote JP,Hurt VR,et al.M ultiple,large deletions in rat mitochondrial DNA:evidence for a major hot spot.Mutat Res,1996,349:95-107.
收稿日期：1999-10-18, http://www.100md.com
单位：孔维佳(430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科)；刘俊(430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科)；董继华(实验中心)
关键词：DNA；线粒体；；突变；；迷路；；阿霉素；；卡那霉素
中华耳鼻咽喉科杂志000205 【摘要】 目的 建立大鼠线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺失突变模型，探讨mtDNA缺失突变在氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotics，AmAn)耳毒易感性中的作用。方法 取Wistar大鼠随机分为A、B两组，每组15只。其中A组大鼠以皮下注射阿霉素(doxorubicin,DOX)2 mg/kg体重，每周2次共3个月，B组则以生理盐水取代DOX。然后A、B组均连续腹腔注射卡那霉素(kanamycin, KM)每日500 mg/kg体重共10 d。用药前、后测试听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)阈，并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术对大鼠内耳膜迷路mtDNA 4 834bp缺失突变进行检测。结果 ①A、B两组大鼠用KM前、后，ABR反应阈提高，均值(
±s)分别为(67.08±8.59) dB peSPL和(12.71± 4.42)dB peSPL，二组均数间差异有显著性意义(P<0.01)；②大鼠内耳组织mtDNA检测发现：A组有9/15只存在4 834 bp片段缺失，而在B组未检测到4 834 bp片段缺失。结论 DOX可诱导大鼠内耳组织mtDNA缺失突变。大鼠内耳组织mtDNA缺失突变可增加其对AmAn耳毒作用的敏感性。, http://www.100md.com
The role of mtDNA deletion in the sensitivity to aminoglycoside antibiotic induced deafness
KONG Weijia, LIU Jun, DONG Jihua.
(Department of Otorhinolaryngology, Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022,China)
Corresponding author: KONG Weijia(Email：weijiak@public.wh.hb.cn)
【Abstract】 Objective To establish an animal model of mitochondrial DNA(mtDNA) deletion and investigate the possible role of mtDNA deletion in aminoglycoside antibiotic induced deafness. Methods Thirty wistar rats (4 months) were randomly divided into group A and B. Doxorubicin (DOX) was subcutaneously injected at doses of 2 mg/kg twice per week for 3 months in group A and then kanamycin (KM) was intraperitoneally injected 500 mg/kg per day for 10 consecutive days. The treatments of group B were identical to group A, except normal saline was substituted for DOX. The thresholds of auditory brainstem response (ABR) were measured before and after the drug administrations. The inner ear membranous labyrinthine tissue was harvested and mtDNA was amplified to identify 4 834bp deletion by PCR technique. Results The elevation of the mean ABR thresholds in group A(67.08±8.59) dB peSPL was significantly higher than that in group B (12.71±4.42)dB peSPL after KM administration(P<0.001). In group A, 9 of the 15 rats demonstrated 4 834 bp mtDNA deletion. However, mtDNA 4 834 bp deletion was negative in group B animals. Conclusion DOX can induce mtDNA deletion in the inner ear tissue of the rat. mtDNA deletion in the inner ear may play an important role in the hypersensitivity to aminoglycoside antibiotic ototoxicity.
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【Key words】 DNA, mitochoudrial； Mutation； Labyrinth； Doxorubicin, Kanamycin
氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotics, AmAn)耳毒性作用的机制尚未完全阐明。近年来研究报道，部分有母系遗传家族史患者对AmAn耳毒性作用高度敏感，并与线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)12S rRNA基因1 555位A→G点突变有关[1]。然而，多数散发的AmAn耳毒性聋的患者并不存在mtDNA 1 555G点突变[2]，尚有AmAn致聋家系中呈1 555G点突变阴性的报道[3]。此外，在临床和动物实验中存在一个重要现象，即老龄人和老龄动物对AmAn耳毒作用的敏感性远大于青壮年。老龄机体对AmAn耳毒作用高敏感性的机制尚不清楚。mtDNA突变有3种类型：点突变、缺失突变和重组突变。近来研究提示mtDNA缺失突变亦与许多疾病相关[4]。Seidman等[5]报道老龄大鼠内耳存在mtDNA 4 834bp缺失突变，而Bai等[6]在老年人颞骨标本中也检出mtDNA 4 977bp缺失突变，并认为它们与老年性聋有关。本实验旨在建立一种大鼠mtDNA缺失突变模型，并探讨大鼠mtDNA片段缺失在AmAn致聋易感中的作用。
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材料与方法
一、实验动物及步骤
耳廓反应灵敏的4个月龄Wistar大鼠(同济医科大学动物实验中心提供)30只，雌雄不限，随机分A、B两组各15只。A组：皮下注射阿霉素(doxorubicin,DOX；浙江海门制药厂，批号135501)2 mg/kg体重，每周2次共3个月，再连续腹腔注射卡那霉素(kanamycin,KM；江苏前进制药厂，批号971224)每日500 mg/kg体重共10 d。B组用药方法同A组，但用生理盐水替代DOX。注射DOX或生理盐水前以及KM前、后分别按本室建立的方法检测听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)的反应阈，使用SpiritTM诱发电位仪检测，电极安放及刺激参数和记录方法详见参考文献[7]，然后取出内耳膜迷路组织，提取内耳组织mtDNA，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增4 834bp缺失后断裂融合基因片段并作电泳分析。
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二、内耳膜迷路mtDNA的提取
动物在2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉下最后一次检测ABR反应阈后迅速断头，取出两侧听泡及部分脑组织，置于预冷4℃的充氧无钙镁细胞外液中(0.1 mol/L PBS,pH 7.4)。在体视显微镜下解剖出血管纹、Corti器和蜗轴、椭圆囊、球囊及壶腹嵴。每只动物两侧内耳相同组织合在一起，置入匀浆管中加TE缓冲液[10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，pH8.0]200 μL匀浆，加细胞裂解液1 000 μL[10 mmol/L Tris (pH 8.0), 50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA，2% 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)]，最后加1%胰蛋白酶(终质量浓度1～2.5 μg/ml)，37℃温水浴中消化24 h。
采用酚-氯仿-异戊醇标准法稍加改良提取DNA，基本步骤如下：①经胰蛋白酶消化的组织混悬液中加等体积饱和酚离心，取上清液；②加等体积酚∶氯仿(25∶24)分离细胞碎屑、蛋白质及核DNA；③用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提去除残存酚；④乙酸钠及无水乙醇沉淀DNA；⑤预冷的70%乙醇及无水乙醇分别洗涤DNA，空气干燥，20 μL TE缓冲液溶解核酸沉淀；⑥DNA质量浓度测定：UV-240紫外分光光度仪 (Shimadyu,日本) 测定A260nm、A280nm吸光度，估计DNA浓度及纯度：DNA纯度要求为A260 nm/A280 nm> 1.7； DNA质量浓度(μg/ μL)＝(DNA的A260 nm×50×DNA稀释倍数)/1 000。
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三、PCR扩增
参照Seidman等[5]报道的核苷酸序列设计引物，特异扩增mtDNA 4 834bp片段丢失后断裂融合基因的引物核苷酸序列(上海生工公司合成)如下：
P1:5′-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3′-7701
P2:5′-AGTGAGATAAGGAGGCCTGC-3′-13110
PCR反应体系按常规方法配制,终浓度为：MgCl 1.5 mmol/L,dNTPs 200 μmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.25 U，模板mtDNA 100～300 ng，总体积为40 μL。扩增条件：首次94℃变性3 min；循环：94℃变性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸1 min，共循环35次；末次72℃延伸10 min。PCR扩增产物于加有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中电泳分析。
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四、统计学处理
ABR反应阈移分析采用t检验。各组用药前后ABR阈移采用配对t检验，A组mtDNA4 834 bp缺失阳性及阴性动物之间注射KM前后ABR阈移分析采用两个样本间的显著性检验。
结果
一、ABR测试结果
A组：15只动物(24耳)用DOX前ABR反应阈均值为40.21±4.54(dB peSPL,±s,下同),用KM前、后其ABR反应阈均值分别为：50.42±6.90和117.50±4.42，用KM后ABR反应阈提高均值为67.08±8.59。均数间差异有显著性意义(P<0.01)。B组15只动物(24耳)用生理盐水前后ABR反应阈均值为40.42±4.64和42.18±6.27，均数间差异无显著性意义；而注射KM后ABR反应阈均值达55.13±6.89，ABR反应阈均值提高12.05±4.16 dB，均数间差异有显著性意义(P<0.01)。A、B组大鼠用KM后ABR反应阈提高以A组为甚，两组间差异有显著性意义(P<0.001)。
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二、内耳组织mtDNA缺失突变
按特异性设计的引物，若存在大鼠mtDNA 4 834bp缺失，则PCR扩增4 834bp丢失后断裂融合基因片段长度为597bp，PCR产物经电泳鉴定：在标准标记核酸695bp和515bp之间有1条清晰的DNA条带，即目的DNA片段(图1), 提示存在约 4 000～5 000bp的 mtDNA 片段缺失。若无缺失存在，因较短的延伸时间，不足以扩增合成近5 000 bp的片段，将无片段产生。另外，从A组和B组各随机采集了5只大鼠的脑组织标本，A组大鼠脑组织 mtDNA 存在该4 000～5 000 bp 缺失突变(5/5)，而 B 组大鼠脑组织检测阴性(0/5)。
本实验A组内耳组织4 834bp缺失突变共9只，阳性率为60%，B组内耳组织4 834bp缺失突变均为阴性。
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1 核酸标准分子量标记物；2～4 分别为A组大鼠脑组织、血管纹和囊斑，示597 bp条带；
5 B组大鼠血管纹PCR扩增阴性
图1 大鼠内耳mtDNA PCR扩增产物电泳分析
讨论
一、DOX诱导大鼠内耳膜迷路mtDNA缺失突变
线粒体DNA是哺乳动物细胞内的核外遗传物质。大鼠mtDNA是由16 298 bp组成的闭环双链状分子，编码13种mRNAs，12S和16S两种rRNAs、以及翻译所需的22种tRNAs，这13种mRNA编码的多肽链亚单位与核基因编码的蛋白质共同组成氧化磷酸化必需的5种酶复合物[8]。近年来的研究提示，mtDNA突变与多种退行性疾病关系密切。已证实与数种疾病如Leber遗传性神经病、慢性进行性眼外肌麻痹、Kearns-Sayre综合征、母系遗传的糖尿病及耳聋和mtDNA 1 555G阳性的家庭遗传性AmAn耳毒性聋等疾病的发生有关[4]。因此，建立内耳mtDNA突变的动物模型对探讨某些内耳疾病的发生和发展机理及其防治方法等有着极重要的价值。本实验采用DOX诱导动物内耳mtDNA突变。DOX是一种高效的抗肿瘤药,Adachi等[9]报道DOX能引起小鼠心肌mtDNA发生约4 000 bp的缺失突变。本研究慢性应用DOX后，在60%的实验大鼠内耳组织中检测到mtDNA 4 000～5 000bp缺失突变，而在对照组(B组)未检测到这种突变，研究结果表明，DOX可诱导大鼠内耳mtDNA缺失突变。
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DOX诱导内耳mtDNA缺失突变的机制尚不清楚。与核DNA(nDNA)相比，mtDNA无组蛋白保护，易受活性氧等自由基损害。线粒体是细胞内自由基的主要来源，在线粒体基质中存在较高浓度的自由基等氧化磷酸化反应副产物。氧自由基包括羟自由基(OH-)和超氧阴离子(O-2)等，在生理条件下，O-2被超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)所破坏，而SOD酶活性易受各种因素影响，使一些O-2逃脱SOD的破坏，并与过氧化物反应产生活性更强的羟自由基(OH-)。Doroshow等[10]报道，DOX可增加心肌内自由基的形成。DOX诱导大鼠内耳mtDNA缺失突变，可能是通过增加氧自由基对mtDNA的损伤而造成的。
二、线粒体DNA缺失突变与AmAn耳毒作用易感性的关系
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Prezant等[1]和Fischel-Ghodsian等[2]研究提示mtDNA 1 555A→G点突变者对AmAn耳毒作用高度敏感，其作用机制亦得到揭示[11]。但大多数无家族史的AmAn中毒性聋患者呈mtDNA 1 555G突变阴性。这些人群AmAn耳中毒作用机制至今尚未彻底阐明。本研究在建立大鼠内耳mtDNA缺失突变模型的基础上，观察mtDNA缺失突变动物对AmAn耳中毒作用的敏感性。实验发现用DOX诱导mtDNA缺失突变的动物组在施用KM后，其ABR平均反应阈显著提高；而对照组在施用KM后，其ABR平均反应阈仅轻度提高，且该组mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检出率为零。结果提示内耳mtDNA缺失突变可能与内耳对AmAn耳中毒作用的敏感性有关。
大鼠mtDNA 4 000～5 000 bp缺失核苷酸位nt7701-13110之间，其基因编码涉及呼吸链酶复合物Ⅰ的亚单位ND3、ND4、ND4L、ND5，细胞色素C氧化酶亚单位COIII，ATP合成酶亚单位6及5种tRNAs。该片段缺失后可使呼吸链酶蛋白合成发生障碍，线粒体氧化磷酸化功能下降，ATP生成减少[4]；而ATP对毛细胞和血管纹等维持内耳离子平衡和内环境稳定非常重要。故内耳ATP生成减少可导致蜗内离子失平衡、内环境紊乱，从而非特异性地增加机体对AmAn耳毒性作用的敏感性。
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在DOX预处理的A组动物中,有6只大鼠未检测出mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变。将A组大鼠内耳mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检测阳性和检测阴性动物注射KM前后ABR反应阈移进行分析发现，A组动物内耳mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检测阳性(9只)和阴性(6只) 大鼠ABR反应阈移分别为(70.71±7.56) dB和(62.00±7.53) dB，前者高于后者，均数间差异有显著性意义(t检验, P<0.05)。A 组动物内耳 mtDNA 4 000～5 000 bp缺失突变检测阴性大鼠ABR反应阈提高的可能机理是：其它因素如mtDNA非4 000～5 000 bp缺失突变或核DNA突变等亦可能存在。因为本实验仅设计检测了mtDNA突变率较高的4 834 bp缺失突变，而DOX可能通过增加氧自由基对内耳组织DNA造成多种损伤。文献[12]报道尚有多种形式的mtDNA突变存在的可能。
参考文献
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1，Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness.Nat Genet， 1993,4:289-294.
2，Fishel-Ghodsian N, Prezant TR,Bu X,et al. Mitochondrial ribosomal RNA gene mutation in a patient with sporadic aminoglycoside ototoxicity. Am J Otolaryngol, 1993,14: 399-403.
3，袁慧军，姜泗长，杨伟炎. 氨基糖甙类抗生素致聋家系线粒体DNA 1 555G点突变分析. 中华耳鼻咽喉科杂志，1998,33:67-70.
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4，Grossman LI, Shoubridge EA. Mitochondrial genetics and human disease. Bioessays, 1996,18:983-991.
5，Seidman MD, Bai U, Khan MJ, et al. Mitochondrial DNA deletion associated with aging and presbyacusis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1997,123:1039-1045.
6，Bai U, Seidman MD, Hinojosa R,et al. Mitochondrial DNA deletions associated with aging and possibly presbycusis: a human archival temporal bone study. Am J Otol, 1997,18:449-453.
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7，孔维佳，汪吉宝，钟乃川. 豚鼠耳蜗电图及听觉脑干电位同步记录法的探讨. 临床耳鼻咽喉科杂志，1989,3:148-152.
8，Gadaleta G, Pepe G, De Candia G, et al. The complete nucleotide sequence of the Rattus norvegicus mitochondrial genome: cryptic signals revealed by comparative analysis between vertebrates. J Mol Evol, 1989,28:497-516.
9，Adachi K, Fujiura Y, Mayumi F, et al. A deletion of mitochondrial DNA in murine doxorubicin-induced cardiotoxicity. Biochem Biophys Res Commun, 1993,195:945-951.
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10，Doroshow JH. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart. Cancer Res, 1983, 43:460-472.
11，Inoue K, Takai D, Soejima A, et al. Mutant mtDNA at 1 555 A to G in 12S rRNA gene and hypersusceptibility of mitochondrial translation to streptomycin can be co-transferred to rho 0 HeLa cells.Biochem Biophys Res Commun,1996,223:496-501.
12，Van Tuyle GC,Gudikote JP,Hurt VR,et al.M ultiple,large deletions in rat mitochondrial DNA:evidence for a major hot spot.Mutat Res,1996,349:95-107.
收稿日期：1999-10-18, http://www.100md.com