不同剂量X射线全身照射后胸腺细胞游离钙浓度的变化时程
作者：谢风 苏旭 刘树铮
单位：谢风 苏旭 刘树铮 (长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室 130021)
关键词：低剂量辐射；Ca2+；信号传递；Fura-2AM
中华放射医学与防护杂志980514 目的 研究X射线全身照射后胸腺细胞游离钙浓度的变化时程，以揭示低剂量辐射免疫增强效应的分子机理。方法 应用Fura-2AM荧光探针，采用荧光分光光度法检测了小鼠胸腺细胞内游离钙浓度。结果 75mGy全身照射后可使细胞内游离钙浓度增高，24小时达峰值，72小时回降至对照水平。结论 低剂量辐射可促进T淋巴细胞信号传递。
Time course of intracellular free Ca2+ concentration changes in thymocytes after whole body irradiation with X-rays.
, 百拇医药
Xie Feng,Su Xu， Liu Shuzheng.Radiobiology Research Unit,Ministry of Health, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China.
Objective The purpose of the present study was to look at the possible influence of whole body irradiation (WBI) with X-rays on the intracellular free Ca2+ concentration [Ca2+]i in thymocytes and to elucidate the possible molecular mechanism of immunoenhancement following low dose radiation (LDR).Method [Ca2+]i was assayed by fluoresence spectrophotometry after loading the thymocytes with a fluorescence probe (Fura-2AM).Result It was found that [Ca2+]i increased after WBI with 75mGy X-rays,reaching its peak at 24h and returning to control level within 72h.Conclusion The results indicate that LDR can promote signal transduction of T lymphocytes.
, 百拇医药
Key words Low dose radiation Intracellular free Ca2+ concentration Signal transduction Fluorescence probe
长期以来，人们总是认为辐射对生物机体有害，近年的研究使人们渐渐发现低剂量电离辐射可能对机体产生有益的效应，如提高机体免疫力，诱导机体的适应性反应[1]，促进胸腺和脾淋巴细胞的信号传递过程[2]。为深入探讨低剂量辐射的生物学效应，许多学者设计精密的实验方法，以期从分子水平上阐明低剂量辐射生物效应的本质。本文作者采用Fura-2AM这一荧光探针，观察不同剂量全身照射后胸腺细胞[Ca2+]i的时程变化。
1 材料和方法
1.1 实验动物：雄性昆明种小鼠，体重20±2g；随机分组。胸腺细胞样品为3只动物胸腺细胞的混悬液，重复3～4次。
, http://www.100md.com
1.2 照射条件：按文献[3]的方法，吸收剂量率分别为12.5mGy/min和0.287Gy/min，累积吸收剂量分别为75mGy和2Gy。对照组进行假照射。于照射后0.5，1，2，4，8，12，24，48和72小时断头处死。
1.3 [Ca2+]i检测：采用Fura-2AM(Sigma，终浓度2μmol/L)负载后荧光分光光度法分析，基本按文献[4]的方法。仪器用LS50B型荧光磷光发光分光光度仪(Perkin Elmer)。测定加入刀豆蛋白A(ConA Sigma，终浓度为5μg/ml)刺激后的荧光强度F，由下式计算出[Ca2+]i。
[Ca2+]i=kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)
其中kd为常数224nmol/L，F为不同实验条件下荧光强度，Fmax由加入Triton X-100测得值，Fmin为加入EGTA测得值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 低剂量照射后胸腺细胞[Ca2+]i变化：由表1可见胸腺细胞[Ca2+]i在75mGyX射线全身照射后2小时即开始增高，24小时达到峰值，随时间延长，[Ca2+]i下降，到72小时恢复至正常水平(表1)。
表1 75mGy X射线全身照射后不同时间[Ca2+]i变化(
±s) 照射后时间
(小时)
[Ca2+]i(nmol/L)
, 百拇医药
假照组
照射组
0.5
120.18± 6.03
128.32± 9.06
1
116.71± 5.47
108.14± 7.12
2
119.84± 9.31
125.39± 8.48
4
, 百拇医药
112.03± 7.62
169.01±16.51*
8
104.98± 6.94
189.12±18.93**
12
128.87±16.04
287.91±12.03**
24
114.32±13.21
292.87±10.74**
, http://www.100md.com
48
122.04± 6.06
160.98± 10.43*
72
124.37±11.02
126.93±14.82
注：n=3～4；与假照组比*P<0.05；**P<0.01
2.2 大剂量照射后胸腺细胞[Ca2+]i变化：2Gy X射线全身照射后，由表2结果可见，胸腺细胞[Ca2+]i在照射后2小时高于假照组水平，随后下降，12小时达最低值，到72小时尚未恢复到正常水平(表2)。
, 百拇医药
3 讨论
Fura-2AM是80年代发展起来的新一代Ca2+荧光指示剂，其荧光强度高，对Ca2+选择性好，测定灵敏，是国外研究Ca2+在生命科学中生理、生化功能的重要手段之一。本实验应用荧光分光光度法检测电离辐射后小鼠胸腺细胞游离钙浓度的结果表明：75mGy全身照射可使细胞内钙浓度增高，照射后72小时内出现明显的时程变化，而2Gy全身照射后2小时[Ca2+]i有轻度上调，随后迅速下降，这与我室以往研究低剂量辐射增强免疫反应，且多数免疫功能指标在75mGy全身照射后反应最为明显是一致的。已知免疫细胞的活化必须经过信号传递过程，其中[Ca2+]i的增高和蛋白激酶C(PKC)的激活是T细胞活化的重要环节。曾报道75mGy全身照射后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的PKC活性数小时即开始增高，T淋巴细胞的PKC活性于照射后12小时达峰值，随后逐渐下降，到第7天降至对照水平以下[3]。用Fluo-3AM负载和流式细胞术分析证明：75mGy全身照射后4小时胸腺细胞TCR和CD3的表达开始超过对照，于24小时达非常显著的水平；丝裂原或表面抗原单抗作用下动员[Ca2+]i的反应增强[5]，其时程变化也是照射后4小时即开始显现[Ca2+]i动员反应增强，在24小时内逐步升幅。这与本实验结果是相吻合的，进一步说明低剂量照射可促进T细胞信号传递，使DNA合成加快，促进细胞的增殖。本实验结果对分析低剂量辐射增殖免疫的机制具有重要意义。
, 百拇医药
表2 2Gy X射线全身照射后不同时间[Ca2+]i变化
(±s) 照射后时间
(小时)
[Ca2+]i(nmol/L)
假照组
照射组
0.5
106.49±7.42
115.87±9.63
, 百拇医药 1
118.80±9.28
120.46±6.90
2
109.71±8.32
131.09±9.27*
4
116.64±10.21
90.11±6.50*
8
121.40±10.46
68.41±9.61**
, http://www.100md.com
12
108.32±6.43
56.39±9.43**
24
120.75±9.12
76.13±7.12**
48
108.39±10.02
62.35±4.96*
72
114.39±5.75
, 百拇医药
79.87±9.61*
注：n=3～4；与假照组比*P<0.05，**P<0.01
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39570188)
参考文献
1 刘树铮，刘伟宏，齐进，等.低剂量辐射增强免疫的细胞机制.中华放射医学与防护杂志，1992，12：299.
2 Liu Shuzheng,Su Xu,Zhang Yingchun,et al.Signal transduction in lymphocytes after low dose radiation.Chin Med J， 1994,107:431.
3 刘树铮，苏旭，韩振波，等.低剂量辐射对T淋巴细胞游离钙和蛋白激酶C的影响.中华医学杂志，1994，74：509.
4 McCormack J G.and Cobbold P H.Cellular calcium:a practial approach.Oxford University Press,1991,33-35.
5 刘树铮，苏旭，张迎春.小剂量X射线全身照射后淋巴细胞TCR/CD3表达和[Ca2+]i的变化.辐射研究与辐射工艺学报，1994，1：61.
(收稿：1997-01-20 修回：1997-06-09), http://www.100md.com
单位：谢风 苏旭 刘树铮 (长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室 130021)
关键词：低剂量辐射；Ca2+；信号传递；Fura-2AM
中华放射医学与防护杂志980514 目的 研究X射线全身照射后胸腺细胞游离钙浓度的变化时程，以揭示低剂量辐射免疫增强效应的分子机理。方法 应用Fura-2AM荧光探针，采用荧光分光光度法检测了小鼠胸腺细胞内游离钙浓度。结果 75mGy全身照射后可使细胞内游离钙浓度增高，24小时达峰值，72小时回降至对照水平。结论 低剂量辐射可促进T淋巴细胞信号传递。
Time course of intracellular free Ca2+ concentration changes in thymocytes after whole body irradiation with X-rays.
, 百拇医药
Xie Feng,Su Xu， Liu Shuzheng.Radiobiology Research Unit,Ministry of Health, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China.
Objective The purpose of the present study was to look at the possible influence of whole body irradiation (WBI) with X-rays on the intracellular free Ca2+ concentration [Ca2+]i in thymocytes and to elucidate the possible molecular mechanism of immunoenhancement following low dose radiation (LDR).Method [Ca2+]i was assayed by fluoresence spectrophotometry after loading the thymocytes with a fluorescence probe (Fura-2AM).Result It was found that [Ca2+]i increased after WBI with 75mGy X-rays,reaching its peak at 24h and returning to control level within 72h.Conclusion The results indicate that LDR can promote signal transduction of T lymphocytes.
, 百拇医药
Key words Low dose radiation Intracellular free Ca2+ concentration Signal transduction Fluorescence probe
长期以来，人们总是认为辐射对生物机体有害，近年的研究使人们渐渐发现低剂量电离辐射可能对机体产生有益的效应，如提高机体免疫力，诱导机体的适应性反应[1]，促进胸腺和脾淋巴细胞的信号传递过程[2]。为深入探讨低剂量辐射的生物学效应，许多学者设计精密的实验方法，以期从分子水平上阐明低剂量辐射生物效应的本质。本文作者采用Fura-2AM这一荧光探针，观察不同剂量全身照射后胸腺细胞[Ca2+]i的时程变化。
1 材料和方法
1.1 实验动物：雄性昆明种小鼠，体重20±2g；随机分组。胸腺细胞样品为3只动物胸腺细胞的混悬液，重复3～4次。
, http://www.100md.com
1.2 照射条件：按文献[3]的方法，吸收剂量率分别为12.5mGy/min和0.287Gy/min，累积吸收剂量分别为75mGy和2Gy。对照组进行假照射。于照射后0.5，1，2，4，8，12，24，48和72小时断头处死。
1.3 [Ca2+]i检测：采用Fura-2AM(Sigma，终浓度2μmol/L)负载后荧光分光光度法分析，基本按文献[4]的方法。仪器用LS50B型荧光磷光发光分光光度仪(Perkin Elmer)。测定加入刀豆蛋白A(ConA Sigma，终浓度为5μg/ml)刺激后的荧光强度F，由下式计算出[Ca2+]i。
[Ca2+]i=kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)
其中kd为常数224nmol/L，F为不同实验条件下荧光强度，Fmax由加入Triton X-100测得值，Fmin为加入EGTA测得值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 低剂量照射后胸腺细胞[Ca2+]i变化：由表1可见胸腺细胞[Ca2+]i在75mGyX射线全身照射后2小时即开始增高，24小时达到峰值，随时间延长，[Ca2+]i下降，到72小时恢复至正常水平(表1)。
表1 75mGy X射线全身照射后不同时间[Ca2+]i变化(
±s) 照射后时间(小时)
[Ca2+]i(nmol/L)
, 百拇医药
假照组
照射组
0.5
120.18± 6.03
128.32± 9.06
1
116.71± 5.47
108.14± 7.12
2
119.84± 9.31
125.39± 8.48
4
, 百拇医药
112.03± 7.62
169.01±16.51*
8
104.98± 6.94
189.12±18.93**
12
128.87±16.04
287.91±12.03**
24
114.32±13.21
292.87±10.74**
, http://www.100md.com
48
122.04± 6.06
160.98± 10.43*
72
124.37±11.02
126.93±14.82
注：n=3～4；与假照组比*P<0.05；**P<0.01
2.2 大剂量照射后胸腺细胞[Ca2+]i变化：2Gy X射线全身照射后，由表2结果可见，胸腺细胞[Ca2+]i在照射后2小时高于假照组水平，随后下降，12小时达最低值，到72小时尚未恢复到正常水平(表2)。
, 百拇医药
3 讨论
Fura-2AM是80年代发展起来的新一代Ca2+荧光指示剂，其荧光强度高，对Ca2+选择性好，测定灵敏，是国外研究Ca2+在生命科学中生理、生化功能的重要手段之一。本实验应用荧光分光光度法检测电离辐射后小鼠胸腺细胞游离钙浓度的结果表明：75mGy全身照射可使细胞内钙浓度增高，照射后72小时内出现明显的时程变化，而2Gy全身照射后2小时[Ca2+]i有轻度上调，随后迅速下降，这与我室以往研究低剂量辐射增强免疫反应，且多数免疫功能指标在75mGy全身照射后反应最为明显是一致的。已知免疫细胞的活化必须经过信号传递过程，其中[Ca2+]i的增高和蛋白激酶C(PKC)的激活是T细胞活化的重要环节。曾报道75mGy全身照射后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的PKC活性数小时即开始增高，T淋巴细胞的PKC活性于照射后12小时达峰值，随后逐渐下降，到第7天降至对照水平以下[3]。用Fluo-3AM负载和流式细胞术分析证明：75mGy全身照射后4小时胸腺细胞TCR和CD3的表达开始超过对照，于24小时达非常显著的水平；丝裂原或表面抗原单抗作用下动员[Ca2+]i的反应增强[5]，其时程变化也是照射后4小时即开始显现[Ca2+]i动员反应增强，在24小时内逐步升幅。这与本实验结果是相吻合的，进一步说明低剂量照射可促进T细胞信号传递，使DNA合成加快，促进细胞的增殖。本实验结果对分析低剂量辐射增殖免疫的机制具有重要意义。
, 百拇医药
表2 2Gy X射线全身照射后不同时间[Ca2+]i变化
(
±s) 照射后时间(小时)
[Ca2+]i(nmol/L)
假照组
照射组
0.5
106.49±7.42
115.87±9.63
, 百拇医药 1
118.80±9.28
120.46±6.90
2
109.71±8.32
131.09±9.27*
4
116.64±10.21
90.11±6.50*
8
121.40±10.46
68.41±9.61**
, http://www.100md.com
12
108.32±6.43
56.39±9.43**
24
120.75±9.12
76.13±7.12**
48
108.39±10.02
62.35±4.96*
72
114.39±5.75
, 百拇医药
79.87±9.61*
注：n=3～4；与假照组比*P<0.05，**P<0.01
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39570188)
参考文献
1 刘树铮，刘伟宏，齐进，等.低剂量辐射增强免疫的细胞机制.中华放射医学与防护杂志，1992，12：299.
2 Liu Shuzheng,Su Xu,Zhang Yingchun,et al.Signal transduction in lymphocytes after low dose radiation.Chin Med J， 1994,107:431.
3 刘树铮，苏旭，韩振波，等.低剂量辐射对T淋巴细胞游离钙和蛋白激酶C的影响.中华医学杂志，1994，74：509.
4 McCormack J G.and Cobbold P H.Cellular calcium:a practial approach.Oxford University Press,1991,33-35.
5 刘树铮，苏旭，张迎春.小剂量X射线全身照射后淋巴细胞TCR/CD3表达和[Ca2+]i的变化.辐射研究与辐射工艺学报，1994，1：61.
(收稿：1997-01-20 修回：1997-06-09), http://www.100md.com