祛斑止痒膏透皮吸收试验初步研究
作者：张会宗 李成森
单位：辽宁省中医研究院 沈阳 110034
关键词：祛斑止痒膏；透皮吸收；氮酮；蛇床子素；补骨脂素；血竭▲
中草药000123摘 要 首次报道了祛斑止痒膏(QO)中蛇床子素、补骨脂素以及血竭的部分成分能透过NIH系小鼠离体皮肤。并以测定含氮酮及不含氮酮透皮吸收液中蛇床子素含量的方法，考察了氮酮对祛斑止痒膏透皮吸收的影响。结果表明，氮酮能有效促进蛇床子素的透皮吸收，累积透过量提高为2.38倍。
透皮给药系统(Transdermal Drug Delivery, TDD)是药剂学中一个新兴的领域，自1981年首创东莨菪碱透皮吸收贴剂以来国外市场相继有近10个产品上市[1]。因其具有可绕过肝脏首过效应及避免胃肠道破坏，降低药物毒性和刺激性等优点，近年来在国外得到了较快发展。但国内TDD技术在品种开发方面尚处于初级阶段，而在中药研究领域更是如此。祛斑止痒膏为妇科外用膏剂，主药由淫羊藿、蛇床子、补骨脂等中药组成，具有清热祛风、燥湿杀虫之功效。临床主要用于治疗妇科外阴营养不良、外阴瘙痒等病证。为了考察祛斑止痒膏透皮吸收情况及氮酮对透皮吸收的影响，我们以祛斑止痒膏中蛇床子素、补骨脂素及血竭药材作为定量、定性考察指标进行了透皮吸收试验。
, 百拇医药
1 仪器、药品及试药
UV-260型分光光度计(日本岛津)，模拟Keshary-chien改进型franz扩散池(自制)，超级恒温水浴(辽阳市恒温仪器厂)，GSP型磁力搅拌器(江苏泰县姜埝无线电厂)，定量毛细管(美国Drummond scico USA)；蛇床子素、补骨脂素、血竭对照药材(由中国药品生物制品检定所提供)，氮酮(山东省龙口市日化助剂厂)，硅胶G(青岛海洋化工厂)；3%氮酮祛斑止痒膏及不含氮酮祛斑止痒膏由辽宁省中医研究院药剂室提供，1 g生药/g；所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制：精密称取蛇床子素10 mg，于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用(2 mg/mL)。用定量毛细管精密吸取0.0，10，20，30，40，50 μL点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯(30∶3)展开，展距11 cm，于365 nm荧光灯下刮取斑点，另刮取同位置、等面积硅胶G为空白对照于试管中，分别加5 mL甲醇，振摇，离心取上清液于(320±1) nm处测定吸收度，绘制C-A标准曲线，得回归方程C=66.364A+0.099 6，回归系数r=0.999 1，于0～20 μg/mL范围内C-A呈良好线性关系。
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2.2 NIH系小鼠离体透皮吸收实验
2.2.1 透皮吸收实验装置：透皮吸收扩散装置模拟Kenhary-chien改进型franz扩散池，由上下两筒状玻璃筒对合而成，夹于玻璃筒间的皮肤将其分成上下两室，上室为供药室，下室为接受室。在接受室的中部和顶部侧面分别装有一个取液管和排气管，取样管供取样及补充接受液用，排气管用于排除气泡。供药室及接受室直径均为2.0 cm，透皮面积为2.25 cm2，试验中通过电磁搅拌保持接受室内流体动态环境，转速为100 r/min，试验温度为(37±1) ℃，试验过程进行了32 h。
2.2.2 透皮吸收实验：将经BaS脱毛NIH系小鼠2只(20～22 g)处死，取背部皮肤，尽量除去皮下组织，将皮肤固定于供药室与接受室之间，真皮一侧与接受液(0.9%生理盐水)接触，排净气泡，取祛斑止痒膏2 g(含3%氮酮和不含氮酮各1份)均匀涂布于供药室皮肤上成1.5 cm×1.5 cm圆形，在接受室内注入30 mL接受液使其恰与皮肤内层接触，保持(37±1) ℃恒温水浴及恒定转速(100 r/min)，在设定时间内每次取样2 mL，置具塞试管中备用，用0.9%生理盐水补足体积，排除皮下气泡进行透皮吸收试验。
, 百拇医药
2.2.3 透皮吸收液中蛇床子素的含量测定[3]：将每次吸取的2 mL透皮吸收液浓缩近干，用少许甲醇溶解，定量转移至1 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取30 μL样品液于同一硅胶G薄层板上点样，以苯-乙酸乙酯(30∶3)上行展开，展距11 cm，自然晾干，于365 nm荧光灯下检视，分别刮取对应位置蛇床子素斑点或同位置、等面积的空白硅胶G于试管中，加6 mL甲醇振摇2 min，离心，取上清液于(320±5) nm处测定吸收度，结果代入回归方程计算蛇床子素含量。因接受池连续取样，并每次加入空白接受液，测得值较真实值小，故按下式进行校正：
式中： Cr为校正浓度；Cn为测定浓度；V为接受池内溶液体积
结果见表1及图1。
表1 蛇床子素的累积透过量(×102 μg/30 mL，
±s) 软膏
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不同时间(h)累积透过量
0.5
1
2
8
14
20
26
32
Ⅰ
1.218±0.093
2.856±0.103
3.262±0.112
, 百拇医药
3.593±0.089
3.912±0.121
4.903±0.118
5.172±0.128
5.185±0.093
Ⅱ
2.014±0.078
5.427±0.131
7.764±0.170
8.562±0.134
9.960±0.102
, 百拇医药
11.703±0.432
12.144±0.240
12.342±0.095
n=5 Ⅰ-含3%氮酮祛斑止痒膏 Ⅱ-不含氮酮祛斑止痒膏
△-含3%氮酮祛斑止痒膏透皮吸收液
□-不含氮酮祛斑止痒膏透皮吸收液
图1 透皮吸收液中蛇床子素累
积透过量随时间变化曲线
2.3 祛斑止痒膏透皮吸收液的定性鉴别
, 百拇医药
2.3.1 样品液的制备：取含氮酮的祛斑止痒膏1 g，加20 mL氯仿回流提取2次，每次1 h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至约10 mL备用(A1)；残渣用5 mL水饱和正丁醇溶液溶解，滤过，滤液浓缩至约2 mL备用(B1)；将祛斑止痒膏透皮吸收液10 mL(32 h液)浓缩近干，同上述方法加氯仿回流及水饱和正丁醇溶液萃取得供试品溶液(A2，B2)备用。
2.3.2 祛斑止痒膏透皮吸收液的定性鉴别：吸收上述氯仿萃取液(A1，A2)少许，分别点于同一10 cm×20 cm硅胶G板上，点少许蛇床子素、补骨脂素及血竭药材作对照，经苯-乙酸乙酯(30∶3)为展开系统，上行展开，展距15 cm。取出自然晾干，于365 nm紫外灯下观察荧光。吸取上述水饱和正丁醇萃取液(B1，B2)少许，于同一硅胶G薄层板上点样，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂上行展开，于365 nm荧光下观察，结果见图2。
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A-氯仿提取 B-水饱和正丁醇提取
1-祛斑止痒膏供试品液 2-祛斑止痒膏透皮吸收液
3-蛇床子素 4-补骨脂素 5-血竭对照药材
a-砖红色 b-紫色荧光 c-淡黄色 d-蓝色荧光 e-淡紫色荧光 f-紫色 g-淡红褐色 h-亮蓝紫色荧光 i-黄色荧光 j-蓝紫色荧光 k-淡黄色荧光
图2 祛斑止痒膏薄层色谱图
3 讨论
试验结果表明祛斑止痒膏中蛇床子素、补骨脂素及血竭药材部分成分能透过NIH系小鼠离体皮肤。且脂溶性成分较水溶性成分透过性好。通过TCL-荧光色谱观察发现，透皮吸收液较原供试品液缺少一个荧光斑点，说明并非所有药物成分均能透过小鼠离体皮肤，其为何种成分尚有待进一步研究。
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通过蛇床子素累积透过量对时间曲线表明，透皮吸收32 h累积透过量基本达到峰值，为临床给药时间提供参考数据；并证实氮酮能起到透皮吸收促进剂作用，32 h蛇床子素的累积透过量含3%氮酮为不含氮酮的2.38倍。
蛇床子素含量测定过程中发现蛇床子素于320 nm处吸收峰出现短移，是否受到分子缔合、官能团取代、pH值等因素影响，尚有待进一步研究；在蛇床子素的定性、定量过程中，参考了有关文献[2，3]，并对文献的展开系统进行了调整，认为本实验所选用的苯-乙酸乙酯(30∶3)展开系统，重现性及分离效果均较好。■
辽宁省科委资助课题
张会宗：Address: Zhang Huizong, Liaoning Academy of Traditional Chinese Medicine, Shenyang
参考文献
1，郑俊民.经皮给药新剂型(M).北京：人民卫生出版社，1997：107
2，中华人民共和国药典.一部.北京：人民卫生出版社，1995：276
3，程大敦，等.中国药学杂志，1990，25(3)：164
(1999-08-30 收稿), http://www.100md.com
单位：辽宁省中医研究院 沈阳 110034
关键词：祛斑止痒膏；透皮吸收；氮酮；蛇床子素；补骨脂素；血竭▲
中草药000123摘 要 首次报道了祛斑止痒膏(QO)中蛇床子素、补骨脂素以及血竭的部分成分能透过NIH系小鼠离体皮肤。并以测定含氮酮及不含氮酮透皮吸收液中蛇床子素含量的方法，考察了氮酮对祛斑止痒膏透皮吸收的影响。结果表明，氮酮能有效促进蛇床子素的透皮吸收，累积透过量提高为2.38倍。
透皮给药系统(Transdermal Drug Delivery, TDD)是药剂学中一个新兴的领域，自1981年首创东莨菪碱透皮吸收贴剂以来国外市场相继有近10个产品上市[1]。因其具有可绕过肝脏首过效应及避免胃肠道破坏，降低药物毒性和刺激性等优点，近年来在国外得到了较快发展。但国内TDD技术在品种开发方面尚处于初级阶段，而在中药研究领域更是如此。祛斑止痒膏为妇科外用膏剂，主药由淫羊藿、蛇床子、补骨脂等中药组成，具有清热祛风、燥湿杀虫之功效。临床主要用于治疗妇科外阴营养不良、外阴瘙痒等病证。为了考察祛斑止痒膏透皮吸收情况及氮酮对透皮吸收的影响，我们以祛斑止痒膏中蛇床子素、补骨脂素及血竭药材作为定量、定性考察指标进行了透皮吸收试验。
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1 仪器、药品及试药
UV-260型分光光度计(日本岛津)，模拟Keshary-chien改进型franz扩散池(自制)，超级恒温水浴(辽阳市恒温仪器厂)，GSP型磁力搅拌器(江苏泰县姜埝无线电厂)，定量毛细管(美国Drummond scico USA)；蛇床子素、补骨脂素、血竭对照药材(由中国药品生物制品检定所提供)，氮酮(山东省龙口市日化助剂厂)，硅胶G(青岛海洋化工厂)；3%氮酮祛斑止痒膏及不含氮酮祛斑止痒膏由辽宁省中医研究院药剂室提供，1 g生药/g；所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制：精密称取蛇床子素10 mg，于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用(2 mg/mL)。用定量毛细管精密吸取0.0，10，20，30，40，50 μL点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯(30∶3)展开，展距11 cm，于365 nm荧光灯下刮取斑点，另刮取同位置、等面积硅胶G为空白对照于试管中，分别加5 mL甲醇，振摇，离心取上清液于(320±1) nm处测定吸收度，绘制C-A标准曲线，得回归方程C=66.364A+0.099 6，回归系数r=0.999 1，于0～20 μg/mL范围内C-A呈良好线性关系。
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2.2 NIH系小鼠离体透皮吸收实验
2.2.1 透皮吸收实验装置：透皮吸收扩散装置模拟Kenhary-chien改进型franz扩散池，由上下两筒状玻璃筒对合而成，夹于玻璃筒间的皮肤将其分成上下两室，上室为供药室，下室为接受室。在接受室的中部和顶部侧面分别装有一个取液管和排气管，取样管供取样及补充接受液用，排气管用于排除气泡。供药室及接受室直径均为2.0 cm，透皮面积为2.25 cm2，试验中通过电磁搅拌保持接受室内流体动态环境，转速为100 r/min，试验温度为(37±1) ℃，试验过程进行了32 h。
2.2.2 透皮吸收实验：将经BaS脱毛NIH系小鼠2只(20～22 g)处死，取背部皮肤，尽量除去皮下组织，将皮肤固定于供药室与接受室之间，真皮一侧与接受液(0.9%生理盐水)接触，排净气泡，取祛斑止痒膏2 g(含3%氮酮和不含氮酮各1份)均匀涂布于供药室皮肤上成1.5 cm×1.5 cm圆形，在接受室内注入30 mL接受液使其恰与皮肤内层接触，保持(37±1) ℃恒温水浴及恒定转速(100 r/min)，在设定时间内每次取样2 mL，置具塞试管中备用，用0.9%生理盐水补足体积，排除皮下气泡进行透皮吸收试验。
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2.2.3 透皮吸收液中蛇床子素的含量测定[3]：将每次吸取的2 mL透皮吸收液浓缩近干，用少许甲醇溶解，定量转移至1 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取30 μL样品液于同一硅胶G薄层板上点样，以苯-乙酸乙酯(30∶3)上行展开，展距11 cm，自然晾干，于365 nm荧光灯下检视，分别刮取对应位置蛇床子素斑点或同位置、等面积的空白硅胶G于试管中，加6 mL甲醇振摇2 min，离心，取上清液于(320±5) nm处测定吸收度，结果代入回归方程计算蛇床子素含量。因接受池连续取样，并每次加入空白接受液，测得值较真实值小，故按下式进行校正：
式中： Cr为校正浓度；Cn为测定浓度；V为接受池内溶液体积
结果见表1及图1。
表1 蛇床子素的累积透过量(×102 μg/30 mL，
±s) 软膏, http://www.100md.com
不同时间(h)累积透过量
0.5
1
2
8
14
20
26
32
Ⅰ
1.218±0.093
2.856±0.103
3.262±0.112
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3.593±0.089
3.912±0.121
4.903±0.118
5.172±0.128
5.185±0.093
Ⅱ
2.014±0.078
5.427±0.131
7.764±0.170
8.562±0.134
9.960±0.102
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11.703±0.432
12.144±0.240
12.342±0.095
n=5 Ⅰ-含3%氮酮祛斑止痒膏 Ⅱ-不含氮酮祛斑止痒膏
△-含3%氮酮祛斑止痒膏透皮吸收液
□-不含氮酮祛斑止痒膏透皮吸收液
图1 透皮吸收液中蛇床子素累
积透过量随时间变化曲线
2.3 祛斑止痒膏透皮吸收液的定性鉴别
, 百拇医药
2.3.1 样品液的制备：取含氮酮的祛斑止痒膏1 g，加20 mL氯仿回流提取2次，每次1 h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至约10 mL备用(A1)；残渣用5 mL水饱和正丁醇溶液溶解，滤过，滤液浓缩至约2 mL备用(B1)；将祛斑止痒膏透皮吸收液10 mL(32 h液)浓缩近干，同上述方法加氯仿回流及水饱和正丁醇溶液萃取得供试品溶液(A2，B2)备用。
2.3.2 祛斑止痒膏透皮吸收液的定性鉴别：吸收上述氯仿萃取液(A1，A2)少许，分别点于同一10 cm×20 cm硅胶G板上，点少许蛇床子素、补骨脂素及血竭药材作对照，经苯-乙酸乙酯(30∶3)为展开系统，上行展开，展距15 cm。取出自然晾干，于365 nm紫外灯下观察荧光。吸取上述水饱和正丁醇萃取液(B1，B2)少许，于同一硅胶G薄层板上点样，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂上行展开，于365 nm荧光下观察，结果见图2。
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A-氯仿提取 B-水饱和正丁醇提取
1-祛斑止痒膏供试品液 2-祛斑止痒膏透皮吸收液
3-蛇床子素 4-补骨脂素 5-血竭对照药材
a-砖红色 b-紫色荧光 c-淡黄色 d-蓝色荧光 e-淡紫色荧光 f-紫色 g-淡红褐色 h-亮蓝紫色荧光 i-黄色荧光 j-蓝紫色荧光 k-淡黄色荧光
图2 祛斑止痒膏薄层色谱图
3 讨论
试验结果表明祛斑止痒膏中蛇床子素、补骨脂素及血竭药材部分成分能透过NIH系小鼠离体皮肤。且脂溶性成分较水溶性成分透过性好。通过TCL-荧光色谱观察发现，透皮吸收液较原供试品液缺少一个荧光斑点，说明并非所有药物成分均能透过小鼠离体皮肤，其为何种成分尚有待进一步研究。
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通过蛇床子素累积透过量对时间曲线表明，透皮吸收32 h累积透过量基本达到峰值，为临床给药时间提供参考数据；并证实氮酮能起到透皮吸收促进剂作用，32 h蛇床子素的累积透过量含3%氮酮为不含氮酮的2.38倍。
蛇床子素含量测定过程中发现蛇床子素于320 nm处吸收峰出现短移，是否受到分子缔合、官能团取代、pH值等因素影响，尚有待进一步研究；在蛇床子素的定性、定量过程中，参考了有关文献[2，3]，并对文献的展开系统进行了调整，认为本实验所选用的苯-乙酸乙酯(30∶3)展开系统，重现性及分离效果均较好。■
辽宁省科委资助课题
张会宗：Address: Zhang Huizong, Liaoning Academy of Traditional Chinese Medicine, Shenyang
参考文献
1，郑俊民.经皮给药新剂型(M).北京：人民卫生出版社，1997：107
2，中华人民共和国药典.一部.北京：人民卫生出版社，1995：276
3，程大敦，等.中国药学杂志，1990，25(3)：164
(1999-08-30 收稿), http://www.100md.com