蟾蜍灵对HL-60细胞的生长抑制及凋亡诱导作用
作者：徐瑞成 陈小义 陈莉 钱进
单位：徐瑞成 陈小义 陈莉(300162 天津，中国人民武装警察部队医学院)；钱进(国家中医药管理局天津药物研究院)
关键词：细胞系，HL-60；蟾酥；细胞周期；细胞凋亡
中华血液学杂志000706 【摘要】 目的 研究中药蟾酥有效成分蟾蜍灵(bufalin)对人白血病细胞的作用及其机制。方法 应用MTT比色法观察蟾蜍灵对细胞的抑制作用，荧光显微镜和透射电镜观察细胞结构的改变，DNA凝胶电泳、原位缺口标记法和流式细胞术等分析细胞凋亡。结果 ①蟾蜍灵明显抑制HL-60细胞的生长，半数抑制浓度(IC50)约为0.025μmol/L;②典型的细胞形态学改变、DNA片段化和亚G1峰的检出等证实蟾蜍灵能诱导白血病细胞凋亡；③0.010μmol/L 蟾蜍灵作用24h即可明显诱导白血病细胞凋亡，凋亡率呈剂量和时间依赖性；④经蟾蜍灵作用后，细胞阻滞于S期，继而凋亡；⑤蟾蜍灵诱导的细胞凋亡能被核酸内切酶抑制剂氯化锌抑制，而不受蛋白质合成抑制剂放线菌酮的影响。结论 蟾蜍灵对白血病细胞有极强的诱导凋亡作用，主要作用于S期细胞，该作用不受蛋白质合成抑制剂的影响。
, 百拇医药
The mechanisms of inhibitory effect of bufalin on human leukemia cells
XU Ruicheng, CHEN Xiaoyi, CHEN Li, et al.
(Department of Cell Biology, Medical College of the Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300163，China)
【Abstract】 Objective To study the mechanism of bufalin on human leukemia cell inhibition. Methods HL-60 cells were treated with bufalin at different concentrations. The growth inhibition was analysed by MTT assay, cell apoptosis by light microscopy, transmission electron microscopy, flow cytometry, TUNEL labeling method and agarose gel electrophoresis. Results ①Treatment of HL-60 cells with bufalin remarkably inhibited the cell growth, the IC50 value of bufalin for HL-60 cells was 0.025μmol/L. ②Apoptosis of HL-60 cells could be efficiently induced by bufalin at concentration of 0.010μmol/L or higher. ③Bufalin induced apoptosis of HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. ④With G1 phase cells decreasing, S phase cells increased, and then apoptotic cells increased with a diminution of S phase cells. ⑤Bufalin-induced apoptosis of HL-60 cells was inhibited by ZnCl2, an inhibitor of endonuclease, but not by cycloheximide, an inhibitor of protein synthesis. Conclusion Bufalin could efficiently induce apoptosis of HL-60 cells, especially the S phase cells.
, http://www.100md.com
【Key words】 Leukemia, HL-60; Venenum bufonis; Cell cycle； Apoptosis
蟾蜍灵(bufalin)是传统中药蟾酥成分中的蟾毒配基之一，相对分子质量为386，属强心甙类物质。已有研究证实蟾蜍灵能诱导多种白血病细胞分化[1-3]，也有人报道蟾蜍灵是细胞拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)的抑制剂，联用维甲酸或顺铂抗白血病效应增强[4]。我们以蟾蜍灵单体作用HL-60细胞株，进一步研究该物质抑制白血病细胞生长的机制，现报道如下。
材料和方法
1 药品 蟾蜍灵由天津药物研究院制备，用无水乙醇配成母液，用D-Hanks液稀释，乙醇终浓度控制在体积分数<0.1%,预实验表明该浓度的乙醇对细胞没有影响。噻唑蓝(MTT)、放线菌酮、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品，ZnCl2(分析纯)由北京化学试剂公司生产。
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2 细胞培养 HL-60细胞由中国医学科学院血液学研究所细胞室惠赠，培养基为含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640(Gibco公司产品)，并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)，在37℃、体积分数为5%的CO2孵育箱中培养。取对数生长期的细胞进行实验。
3 MTT比色法 将HL-60细胞悬液调整为2×104/ml，接种于96孔培养板，每孔200μl，24h后，实验组分别加入4种不同浓度蟾蜍灵，对照组不加药，另设空白组(只有培养基，无细胞)，每组8个复孔。继续培养48h，加MTT(5mg/ml)20μl，4h后，离心弃上清，加DMSO 200μl，避光振荡5min，用全自动酶标仪(上海三科仪器公司生产)测570nm处的吸光度(A570)值。
, 百拇医药
4 细胞形态学观察 吖啶橙(AO)荧光染色检查细胞染色质和RNA的变化，透射电镜技术观察细胞超微结构的变化。
5 DNA电泳 按常规方法提取DNA，溶于30μl 上样缓冲液，15g/L琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml 溴化乙锭)，50V，电泳4h,紫外灯下照相。
6 原位缺口标记(TUNEL)法 收集不同处理组细胞，分别涂片，用新鲜配制的体积分数为4%的多聚甲醛固定，染色操作方法按Clontech公司试剂盒手册进行，被dUTP-FITC特异性标记(绿色)的细胞为凋亡细胞。
7 流式细胞术(FCM)分析 收集1×106个细胞，经冷PBS洗2次，冰冻的体积分数为70%的乙醇固定，碘化丙锭染色，FCM检测DNA含量。
8 统计学处理 样本均数的比较采用t检验。
, 百拇医药
结果
1 蟾蜍灵抑制白血病细胞生长 由表1可见，0.005μmol/L 蟾蜍灵即可显著抑制HL-60细胞生长，半数抑制浓度(IC50)约为0.025μmol/L。
表1 蟾蜍灵对HL-60细胞生长的影响 组别
样本数
A570
抑制率(%)
对照组
8
0.729±0.062
空白组
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8
0.375±0.021
蟾蜍灵 0.001μmol/L
8
0.705±0.071
6.8
蟾蜍灵 0.005μmol/L
8
0.653±0.073*
21.5
蟾蜍灵 0.025μmol/L
8
, 百拇医药
0.531±0.046＃
56.1
蟾蜍灵 0.100μmol/L
8
0.416±0.036＃
88.4
注：与对照组比较， *P<0.05; #P<0.012 细胞形态学改变 倒置显微镜下可见，对照组细胞大小均一，实验组细胞皱缩变小；AO染色显示，对照组细胞的核黄绿色、较大，胞浆橙红色，而凋亡细胞染色质凝集、碎裂，胞内出现微核样结构，胞浆橙红色变浅；电镜下可见典型的新月形核的凋亡细胞，细胞器变性，但尚保存，细胞变光滑，体积缩小，并可见有的凋亡细胞产生膜完整的凋亡小体。
, 百拇医药
3 蟾蜍灵诱导细胞DNA裂解 如图1所示，0.010，0.100μmol/L 蟾蜍灵作用HL-60细胞24h,琼脂糖凝胶电泳获得清晰的凋亡特征性梯形条带。
1:蟾蜍灵 0.001μmol/L; 2:蟾蜍灵 0.010μmol/L;
3:蟾蜍灵 0.100μmol/L；4:分子量标准(pBR322 DNA/BstN Ⅰ); 5:对照组
图1 蟾蜍灵诱导HL-60细胞DNA裂解的电泳结果4 外源化合物对细胞凋亡的调节作用 蟾蜍灵与放线菌酮或ZnCl2共同作用HL-60细胞，电泳结果显示蛋白质合成抑制剂放线菌酮对蟾蜍灵诱导的凋亡没有影响，说明凋亡的发生不需要新的蛋白质的合成，而核酸内切酶抑制剂ZnCl2抑制了蟾蜍灵诱导的细胞凋亡(图2)。
, 百拇医药
1:蟾蜍灵0.100μmol/L+放线菌酮 20μg/ml; 2，3:蟾蜍灵 0.100μmol/L;
4:分子量标准(385bp); 5:对照组；6:蟾蜍灵 0.100μmol/L+ZnCl2 0.5mmol/L
图2 外源化合物和蟾蜍灵共同作用HL-60细胞的DNA电泳结果
5 TUNEL法检测细胞凋亡率 蟾蜍灵诱导的HL-60细胞凋亡率存在时间和药物浓度依赖性，随药物浓度的增加和作用时间的延长凋亡率也增加(表2)。0.100μmol/L蟾蜍灵作用60h, 细胞几乎全部死亡。
表2 蟾蜍灵诱导HL-60细胞凋亡百分率(%) 浓度
(μmol/L)
, 百拇医药 样本
数
不同时间细胞凋亡率
6h
12h
24h
48h
0
3
1.4±0.1
1.7±0.2
1.7±0.4
2.1±0.4
, 百拇医药
0.010
3
3.3±0.5
6.2±0.8
11.0±0.8
19.6±1.2
0.100
3
9.8±1.1
16.7±2.0
36.2±2.5
68.3±7.1
, 百拇医药
6 蟾蜍灵对细胞周期的影响 由表3可见，HL-60细胞经0.100μmol/L 蟾蜍灵处理6h, 随着G1期细胞小幅度下降，S期细胞有所升高；作用12h，S期细胞阻滞；作用24h，亚G1期细胞增多(亚G1峰显著)，S期和G2/M期细胞都下降，提示蟾蜍灵主要作用于S期细胞。表3 0.100μmol/L蟾蜍灵对HL-60细胞周期的影响(%) 组别
亚G1期
G1/G0期
S期
G2/M期
对照组
1.3
, http://www.100md.com
54.6
28.2
15.9
实验组
6h
5.7
51.7
30.4
12.2
12h
14.0
20.4
41.0
, http://www.100md.com
24.6
24h
31.3
34.6
18.3
15.8
讨论 以往的研究结果表明，低浓度(0.001μmol/L)蟾蜍灵可诱导白血病细胞分化[1，2]，下调c-myb和c-myc的表达，诱发c-fos和Egr-1的转录[2]；在人血浆中发现的内源类蟾蜍灵物质，也能诱导白血病细胞分化[3]。Hashimoto等[4]报道蟾蜍灵下调HL-60细胞Topo Ⅱ基因表达，Topo Ⅱ的活性显著下降，并检测到DNA片段化。本研究结果从多方面证实，0.010μmol/L 蟾蜍灵就能有效诱导白血病细胞凋亡，比其他药物诱导HL-60细胞凋亡所需的浓度要低得多[5]。
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细胞周期分析显示，蟾蜍灵主要作用于S期细胞，支持其为TopoⅡ抑制剂的结论，一般认为Topo Ⅱ抑制剂促进拓扑异构酶与DNA形成稳定的切割复合物，该复合物与S期DNA复制叉“碰撞”(collision)，导致细胞凋亡[6]。蟾蜍灵诱导的细胞凋亡不受蛋白质合成抑制剂放线菌酮的抑制，说明该过程不需要合成新的蛋白质，同是Topo Ⅱ抑制剂，阿霉素、阿那霉素诱导的P388白血病细胞凋亡能被放线菌酮抑制，说明抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的途径存在细胞特异性[7]。
志谢：感谢中国医学科学院血液学研究所应红光主任、何一心先生的支持和帮助
参 考 文 献
1，Zhang L,Nakaya K,Yoshida T,et al.Induction of bufalin of differentiation of human leukemia cells HL-60,U937,and ML1 toward macrophage /monocyte-like cells and its potent synergistic effect on the differentiation of human leukemia cells in combination with other inducers.Cancer Res,1992,52:4634-4642.
, 百拇医药
2，Numazawa S,Inoue N,Nukura H,et al.A cardiotonic steroid bufalin-induced differentiation of THP-1 cells. Biochem Pharmacol,1996,52:321-329.
3，Numazawa S,Honma Y,Yamamoto T,et al. A cardiotonic steroid bufalin-like factor in human plasma induces leukemia cell differentiation. Leuk Res,1995,19:945-953.
4，Hashimoto S,Jing Y,Kawazoe N,et al. Bufalin reduces the level of topoisomerase Ⅱ in human leukemia cells and affects the cytotoxicity of anticancer drugs. Leuk Res,1997,21:875-883.
, 百拇医药
5，Martin SJ,Lennon SV,Bonham AM,et al.Induction of apoptosis (programmed cell death) in human leukemic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis. J Immunol,1990,145:1859-1867.
6，Hsiang YH,Lihou MG,Liu LF, et al. Arrest of replication fork by drug-stabilized topoisomerase DNA cleavage complexes as a mechanism of cell killing by camptothecin. Cancer Res,1989,49:5077-5082.
7，Ling YH,Priebe W,Perez-Soler R. Apoptosis induced by anthracycline antibiotics in P388 patient and multidrug-resistant cells. Cancer Res,1993,53:1845-1852.
(收稿日期：1999-09-20), 百拇医药
单位：徐瑞成 陈小义 陈莉(300162 天津，中国人民武装警察部队医学院)；钱进(国家中医药管理局天津药物研究院)
关键词：细胞系，HL-60；蟾酥；细胞周期；细胞凋亡
中华血液学杂志000706 【摘要】 目的 研究中药蟾酥有效成分蟾蜍灵(bufalin)对人白血病细胞的作用及其机制。方法 应用MTT比色法观察蟾蜍灵对细胞的抑制作用，荧光显微镜和透射电镜观察细胞结构的改变，DNA凝胶电泳、原位缺口标记法和流式细胞术等分析细胞凋亡。结果 ①蟾蜍灵明显抑制HL-60细胞的生长，半数抑制浓度(IC50)约为0.025μmol/L;②典型的细胞形态学改变、DNA片段化和亚G1峰的检出等证实蟾蜍灵能诱导白血病细胞凋亡；③0.010μmol/L 蟾蜍灵作用24h即可明显诱导白血病细胞凋亡，凋亡率呈剂量和时间依赖性；④经蟾蜍灵作用后，细胞阻滞于S期，继而凋亡；⑤蟾蜍灵诱导的细胞凋亡能被核酸内切酶抑制剂氯化锌抑制，而不受蛋白质合成抑制剂放线菌酮的影响。结论 蟾蜍灵对白血病细胞有极强的诱导凋亡作用，主要作用于S期细胞，该作用不受蛋白质合成抑制剂的影响。
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The mechanisms of inhibitory effect of bufalin on human leukemia cells
XU Ruicheng, CHEN Xiaoyi, CHEN Li, et al.
(Department of Cell Biology, Medical College of the Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300163，China)
【Abstract】 Objective To study the mechanism of bufalin on human leukemia cell inhibition. Methods HL-60 cells were treated with bufalin at different concentrations. The growth inhibition was analysed by MTT assay, cell apoptosis by light microscopy, transmission electron microscopy, flow cytometry, TUNEL labeling method and agarose gel electrophoresis. Results ①Treatment of HL-60 cells with bufalin remarkably inhibited the cell growth, the IC50 value of bufalin for HL-60 cells was 0.025μmol/L. ②Apoptosis of HL-60 cells could be efficiently induced by bufalin at concentration of 0.010μmol/L or higher. ③Bufalin induced apoptosis of HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. ④With G1 phase cells decreasing, S phase cells increased, and then apoptotic cells increased with a diminution of S phase cells. ⑤Bufalin-induced apoptosis of HL-60 cells was inhibited by ZnCl2, an inhibitor of endonuclease, but not by cycloheximide, an inhibitor of protein synthesis. Conclusion Bufalin could efficiently induce apoptosis of HL-60 cells, especially the S phase cells.
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【Key words】 Leukemia, HL-60; Venenum bufonis; Cell cycle； Apoptosis
蟾蜍灵(bufalin)是传统中药蟾酥成分中的蟾毒配基之一，相对分子质量为386，属强心甙类物质。已有研究证实蟾蜍灵能诱导多种白血病细胞分化[1-3]，也有人报道蟾蜍灵是细胞拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)的抑制剂，联用维甲酸或顺铂抗白血病效应增强[4]。我们以蟾蜍灵单体作用HL-60细胞株，进一步研究该物质抑制白血病细胞生长的机制，现报道如下。
材料和方法
1 药品 蟾蜍灵由天津药物研究院制备，用无水乙醇配成母液，用D-Hanks液稀释，乙醇终浓度控制在体积分数<0.1%,预实验表明该浓度的乙醇对细胞没有影响。噻唑蓝(MTT)、放线菌酮、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品，ZnCl2(分析纯)由北京化学试剂公司生产。
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2 细胞培养 HL-60细胞由中国医学科学院血液学研究所细胞室惠赠，培养基为含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640(Gibco公司产品)，并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)，在37℃、体积分数为5%的CO2孵育箱中培养。取对数生长期的细胞进行实验。
3 MTT比色法 将HL-60细胞悬液调整为2×104/ml，接种于96孔培养板，每孔200μl，24h后，实验组分别加入4种不同浓度蟾蜍灵，对照组不加药，另设空白组(只有培养基，无细胞)，每组8个复孔。继续培养48h，加MTT(5mg/ml)20μl，4h后，离心弃上清，加DMSO 200μl，避光振荡5min，用全自动酶标仪(上海三科仪器公司生产)测570nm处的吸光度(A570)值。
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4 细胞形态学观察 吖啶橙(AO)荧光染色检查细胞染色质和RNA的变化，透射电镜技术观察细胞超微结构的变化。
5 DNA电泳 按常规方法提取DNA，溶于30μl 上样缓冲液，15g/L琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml 溴化乙锭)，50V，电泳4h,紫外灯下照相。
6 原位缺口标记(TUNEL)法 收集不同处理组细胞，分别涂片，用新鲜配制的体积分数为4%的多聚甲醛固定，染色操作方法按Clontech公司试剂盒手册进行，被dUTP-FITC特异性标记(绿色)的细胞为凋亡细胞。
7 流式细胞术(FCM)分析 收集1×106个细胞，经冷PBS洗2次，冰冻的体积分数为70%的乙醇固定，碘化丙锭染色，FCM检测DNA含量。
8 统计学处理 样本均数的比较采用t检验。
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结果
1 蟾蜍灵抑制白血病细胞生长 由表1可见，0.005μmol/L 蟾蜍灵即可显著抑制HL-60细胞生长，半数抑制浓度(IC50)约为0.025μmol/L。
表1 蟾蜍灵对HL-60细胞生长的影响 组别
样本数
A570
抑制率(%)
对照组
8
0.729±0.062
空白组
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8
0.375±0.021
蟾蜍灵 0.001μmol/L
8
0.705±0.071
6.8
蟾蜍灵 0.005μmol/L
8
0.653±0.073*
21.5
蟾蜍灵 0.025μmol/L
8
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0.531±0.046＃
56.1
蟾蜍灵 0.100μmol/L
8
0.416±0.036＃
88.4
注：与对照组比较， *P<0.05; #P<0.012 细胞形态学改变 倒置显微镜下可见，对照组细胞大小均一，实验组细胞皱缩变小；AO染色显示，对照组细胞的核黄绿色、较大，胞浆橙红色，而凋亡细胞染色质凝集、碎裂，胞内出现微核样结构，胞浆橙红色变浅；电镜下可见典型的新月形核的凋亡细胞，细胞器变性，但尚保存，细胞变光滑，体积缩小，并可见有的凋亡细胞产生膜完整的凋亡小体。
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3 蟾蜍灵诱导细胞DNA裂解 如图1所示，0.010，0.100μmol/L 蟾蜍灵作用HL-60细胞24h,琼脂糖凝胶电泳获得清晰的凋亡特征性梯形条带。
1:蟾蜍灵 0.001μmol/L; 2:蟾蜍灵 0.010μmol/L;
3:蟾蜍灵 0.100μmol/L；4:分子量标准(pBR322 DNA/BstN Ⅰ); 5:对照组
图1 蟾蜍灵诱导HL-60细胞DNA裂解的电泳结果4 外源化合物对细胞凋亡的调节作用 蟾蜍灵与放线菌酮或ZnCl2共同作用HL-60细胞，电泳结果显示蛋白质合成抑制剂放线菌酮对蟾蜍灵诱导的凋亡没有影响，说明凋亡的发生不需要新的蛋白质的合成，而核酸内切酶抑制剂ZnCl2抑制了蟾蜍灵诱导的细胞凋亡(图2)。
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1:蟾蜍灵0.100μmol/L+放线菌酮 20μg/ml; 2，3:蟾蜍灵 0.100μmol/L;
4:分子量标准(385bp); 5:对照组；6:蟾蜍灵 0.100μmol/L+ZnCl2 0.5mmol/L
图2 外源化合物和蟾蜍灵共同作用HL-60细胞的DNA电泳结果
5 TUNEL法检测细胞凋亡率 蟾蜍灵诱导的HL-60细胞凋亡率存在时间和药物浓度依赖性，随药物浓度的增加和作用时间的延长凋亡率也增加(表2)。0.100μmol/L蟾蜍灵作用60h, 细胞几乎全部死亡。
表2 蟾蜍灵诱导HL-60细胞凋亡百分率(%) 浓度
(μmol/L)
, 百拇医药 样本
数
不同时间细胞凋亡率
6h
12h
24h
48h
0
3
1.4±0.1
1.7±0.2
1.7±0.4
2.1±0.4
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0.010
3
3.3±0.5
6.2±0.8
11.0±0.8
19.6±1.2
0.100
3
9.8±1.1
16.7±2.0
36.2±2.5
68.3±7.1
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6 蟾蜍灵对细胞周期的影响 由表3可见，HL-60细胞经0.100μmol/L 蟾蜍灵处理6h, 随着G1期细胞小幅度下降，S期细胞有所升高；作用12h，S期细胞阻滞；作用24h，亚G1期细胞增多(亚G1峰显著)，S期和G2/M期细胞都下降，提示蟾蜍灵主要作用于S期细胞。表3 0.100μmol/L蟾蜍灵对HL-60细胞周期的影响(%) 组别
亚G1期
G1/G0期
S期
G2/M期
对照组
1.3
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54.6
28.2
15.9
实验组
6h
5.7
51.7
30.4
12.2
12h
14.0
20.4
41.0
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24.6
24h
31.3
34.6
18.3
15.8
讨论 以往的研究结果表明，低浓度(0.001μmol/L)蟾蜍灵可诱导白血病细胞分化[1，2]，下调c-myb和c-myc的表达，诱发c-fos和Egr-1的转录[2]；在人血浆中发现的内源类蟾蜍灵物质，也能诱导白血病细胞分化[3]。Hashimoto等[4]报道蟾蜍灵下调HL-60细胞Topo Ⅱ基因表达，Topo Ⅱ的活性显著下降，并检测到DNA片段化。本研究结果从多方面证实，0.010μmol/L 蟾蜍灵就能有效诱导白血病细胞凋亡，比其他药物诱导HL-60细胞凋亡所需的浓度要低得多[5]。
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细胞周期分析显示，蟾蜍灵主要作用于S期细胞，支持其为TopoⅡ抑制剂的结论，一般认为Topo Ⅱ抑制剂促进拓扑异构酶与DNA形成稳定的切割复合物，该复合物与S期DNA复制叉“碰撞”(collision)，导致细胞凋亡[6]。蟾蜍灵诱导的细胞凋亡不受蛋白质合成抑制剂放线菌酮的抑制，说明该过程不需要合成新的蛋白质，同是Topo Ⅱ抑制剂，阿霉素、阿那霉素诱导的P388白血病细胞凋亡能被放线菌酮抑制，说明抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的途径存在细胞特异性[7]。
志谢：感谢中国医学科学院血液学研究所应红光主任、何一心先生的支持和帮助
参 考 文 献
1，Zhang L,Nakaya K,Yoshida T,et al.Induction of bufalin of differentiation of human leukemia cells HL-60,U937,and ML1 toward macrophage /monocyte-like cells and its potent synergistic effect on the differentiation of human leukemia cells in combination with other inducers.Cancer Res,1992,52:4634-4642.
, 百拇医药
2，Numazawa S,Inoue N,Nukura H,et al.A cardiotonic steroid bufalin-induced differentiation of THP-1 cells. Biochem Pharmacol,1996,52:321-329.
3，Numazawa S,Honma Y,Yamamoto T,et al. A cardiotonic steroid bufalin-like factor in human plasma induces leukemia cell differentiation. Leuk Res,1995,19:945-953.
4，Hashimoto S,Jing Y,Kawazoe N,et al. Bufalin reduces the level of topoisomerase Ⅱ in human leukemia cells and affects the cytotoxicity of anticancer drugs. Leuk Res,1997,21:875-883.
, 百拇医药
5，Martin SJ,Lennon SV,Bonham AM,et al.Induction of apoptosis (programmed cell death) in human leukemic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis. J Immunol,1990,145:1859-1867.
6，Hsiang YH,Lihou MG,Liu LF, et al. Arrest of replication fork by drug-stabilized topoisomerase DNA cleavage complexes as a mechanism of cell killing by camptothecin. Cancer Res,1989,49:5077-5082.
7，Ling YH,Priebe W,Perez-Soler R. Apoptosis induced by anthracycline antibiotics in P388 patient and multidrug-resistant cells. Cancer Res,1993,53:1845-1852.
(收稿日期：1999-09-20), 百拇医药
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