MTT法评价国产氧氟沙星对兔角膜上皮细胞体外毒性的初步研究
作者：成 旋 张 舒1
单位：(成都市第六人民医院眼科，成都 610051)
关键词：MTT法；氧氟沙星；兔角膜上皮细胞；毒性
MTT法评价国产氧氟沙星对兔角膜 上皮细胞体外毒性的初步研究
摘要 目的：探讨氧氟沙星眼科用药的毒性,为临床应用此药物提供参考。方法：体外原代培养兔角膜上皮细胞，于培养d4加入不同浓度氧氟沙星继续培养4 h，用MTT法测定细胞抑制百分率。结果：氧氟沙星对原代培养兔角膜上皮细胞的半数抑制浓度为11.9 mg/ml。结论：现临床上使用的氧氟沙星眼科制剂的浓度对兔角膜上皮细胞是安全的。
PRELIMINARY STUDY ON IN VITRO TOXICITY OF OFLOXACIN IN CORNEAL
, 百拇医药
EPITHELIAL CELLS OF RABBIT BY MTT ASSAY
Cheng Xuan,Zhang Shu
(Department of Ophthalmology,The 6th Hospital of Chengdu City,Chengdu 610051)
ABSTRACT OBJECTIVE：To explore the in vitro toxicity of ofloxcin ophthalmic preparation in corneal epithelial cells of rabbit by MTT assay.METHODS:The corneal epithelial cells of rabbit were exposed to ofloxacin solutions of different concentration for 4 h at the fourth day of culture and the inhibition rates of cells were determined by MTT assay.RESULTS:The IC50(mean inhibtory concentration)of ofloxacin in corneal eptihelial cells of rabbit was 11.9 mg/ml.CONCLUSION:the ofloxacin ophthalmic preparations used in clinical practice are safe for corneal epithelial cells of rabbit.
, 百拇医药
KEY WORDS MTT assay;Ofloxacin;Primary rabbit corneal epithetial cells;Toxicological effect
本文利用溴化四唑蓝(MTT)法就国产氧氟沙星对兔角膜上皮细胞体外毒性作一初步探讨，为临床应用此药提供参考。
材料和方法
1 试剂与药品
细胞培养液DMEM(SIGMA, No.D6046),胎牛血清(FCS,GibcoBRL,No.16000-044)，MTT(SIGMA,No.M5655)用生理盐水稀释成5 mg/ml,0.25%胰酶-EDTA溶液(SIGMA,No.T4049),二甲基亚砜(DMSO,分析纯,成都化学试剂厂)。氧氟沙星原料药(湖北宜昌制药厂,批号:921205,含量为99.90%), 实验前用饱和NaHCO3液溶解,然后用DMEM(含10%FCS)液配成相应浓度。
, 百拇医药
2 兔角膜上皮细胞的制备
参照谢立信等[1]的方法，健康大白兔2只，雌雄不限，处死后立即摘除双侧眼球，置1%庆大霉素生理盐水液中浸泡30 min。在超净工作台内将眼球置培养皿中，仔细剪取完整角膜，用4＃针头在上皮面划痕,0.25%胰酶-EDTA溶液消化10 min,最后用消毒打孔器(Φ 6 mm)取相同面积角膜片7片。
3 兔角膜上皮细胞的培养及毒性实验
2块24孔板(Corning Co.)(1#板、2#板),每天使用2块板的1个纵行,共8个孔。d1将7片角膜片分别放入1#板的第1纵行的4个孔(A1,B1,C1,D1孔)和2#板第1纵行的3个孔(A1,B1,C1孔),角膜上皮面向下,紧贴孔底,加DMEM培养液(含10%FCS)0.5 ml/孔,在37℃，5% CO2培养箱内培养24 h,d 2将7片角膜移入第2纵行,如此每天移走角膜片并接种角膜片在下1纵行,连续6 d,以后每天每纵行的处理均依次按第1纵行进行。
, 百拇医药
移走角膜片的第1纵行每孔加DMEM培养液(含10%FCS)1ml继续培养至第48 h,d3用DMEM培养液(不含10%FCS)轻轻冲洗,然后加DMEM(含10%FCS)1 ml继续培养至第72h,d4用DMEM(不含10%FCS)冲洗后,加含氧氟沙星的DMEM培养液(含10%FCS)2 ml,使每孔终浓度分别为10 000 μg/ml(A1孔)、1 000 μg/ml(B1孔)、100 μg/ml
(C1孔)、10 μg/ml(D1孔) 、1 μg/ml(2#板A1孔),2#板的B,C行作空白对照(不作药物处理),D行作调零对照(检测时只加DMSO液)。
4 MTT法测定
给药培养48 h后,加MTT 200 μl/孔,继续培养4 h后,仔细吸完待测孔的培养液,加DMSO 1 ml/孔,于DG-3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)测各孔的OD570值。
, http://www.100md.com
5 数据的处理
细胞抑制率用6复孔的平均OD值来计算,细胞抑制率(%)=[(空白对照孔的平均OD值-药物处理孔的平均OD值)/空白对照孔的平均OD值]×100%。半数抑制浓度用Bliss方法计算,软件由中国毒理学会提供,IBM-586型微机处理。
结 果
24孔板原代培养兔角膜上皮细胞,设5种浓度氧氟沙星,每一浓度设6复孔,每次检测均设2孔空白对照和1孔调零对照,经MTT法检测10 000，1 000，100，10，1 μg/ml 五种浓度的氧氟沙星对兔角膜上皮细胞体外抑制率分别为：57.91%，35.69%，0.67%，-1.68%，-5.05%，尔后算出相关直线回归方程Y=-8.15+14.26 lgC;体外能使半数兔角膜上皮细胞受到抑制的氧氟沙星的浓度IC50=11.9 mg/ml,量效相关系数r=0.9126。
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讨 论
MTT法最早用于白介素-2活性测定,以后用于细胞毒的检测。该法简单、快速、经济、安全、重复性好, 在一般条件下易于开展。
在进行细胞毒性的体外实验中,受试细胞的密度是非常重要的因素。我们通过控制接种的角膜面积以及增加重复实验的次数来克服原代细胞培养的局限性，实验中，每一孔浓度的OD值均在2倍6个复孔均数的标准差范围内，提示采用该法可间接达到控制细胞密度的目的。
氧氟沙星系第三代喹诺酮类抗菌药,其靶点是细菌的DNA拓扑异构酶Ⅱ,通过抑制此酶的A亚单位,从而抑制细菌DNA的复制和转录,达到抗菌的目的。氧氟沙星对常见病原菌的MIC一般均在0.062～0.5 mg/L之间，对金葡菌的MIC50和MIC90分别为0.25 mg/L和0.5 mg/L,对肺炎球菌和化脓性链球菌的MIC90为1.91 mg/L和1.26 mg/L[2]。目前临床上使用的氧氟沙星眼膏和滴眼液的浓度为0.3%, 已达到有效抑菌浓度, 我们的实验提示,现有的氧氟沙星眼科制剂的浓度对兔角膜上皮细胞是安全的。
参考文献
1 谢立信，董晓光，张德茹，等.兔角膜组织培养的技术改进.中华眼科杂志,1990,26(4)∶237
2 Fujimoto T,Mitsuhashi S.In vitro antibacterial activity of DR-3355,the S-(-)-isomer of ofloxacin.Chemotherapy (Basel)，1990,36(4)∶268
(收稿：1998-12-30 修回：1999-04-09), 百拇医药(成 旋 张 舒1)
单位：(成都市第六人民医院眼科，成都 610051)
关键词：MTT法；氧氟沙星；兔角膜上皮细胞；毒性
MTT法评价国产氧氟沙星对兔角膜 上皮细胞体外毒性的初步研究
摘要 目的：探讨氧氟沙星眼科用药的毒性,为临床应用此药物提供参考。方法：体外原代培养兔角膜上皮细胞，于培养d4加入不同浓度氧氟沙星继续培养4 h，用MTT法测定细胞抑制百分率。结果：氧氟沙星对原代培养兔角膜上皮细胞的半数抑制浓度为11.9 mg/ml。结论：现临床上使用的氧氟沙星眼科制剂的浓度对兔角膜上皮细胞是安全的。
PRELIMINARY STUDY ON IN VITRO TOXICITY OF OFLOXACIN IN CORNEAL
, 百拇医药
EPITHELIAL CELLS OF RABBIT BY MTT ASSAY
Cheng Xuan,Zhang Shu
(Department of Ophthalmology,The 6th Hospital of Chengdu City,Chengdu 610051)
ABSTRACT OBJECTIVE：To explore the in vitro toxicity of ofloxcin ophthalmic preparation in corneal epithelial cells of rabbit by MTT assay.METHODS:The corneal epithelial cells of rabbit were exposed to ofloxacin solutions of different concentration for 4 h at the fourth day of culture and the inhibition rates of cells were determined by MTT assay.RESULTS:The IC50(mean inhibtory concentration)of ofloxacin in corneal eptihelial cells of rabbit was 11.9 mg/ml.CONCLUSION:the ofloxacin ophthalmic preparations used in clinical practice are safe for corneal epithelial cells of rabbit.
, 百拇医药
KEY WORDS MTT assay;Ofloxacin;Primary rabbit corneal epithetial cells;Toxicological effect
本文利用溴化四唑蓝(MTT)法就国产氧氟沙星对兔角膜上皮细胞体外毒性作一初步探讨，为临床应用此药提供参考。
材料和方法
1 试剂与药品
细胞培养液DMEM(SIGMA, No.D6046),胎牛血清(FCS,GibcoBRL,No.16000-044)，MTT(SIGMA,No.M5655)用生理盐水稀释成5 mg/ml,0.25%胰酶-EDTA溶液(SIGMA,No.T4049),二甲基亚砜(DMSO,分析纯,成都化学试剂厂)。氧氟沙星原料药(湖北宜昌制药厂,批号:921205,含量为99.90%), 实验前用饱和NaHCO3液溶解,然后用DMEM(含10%FCS)液配成相应浓度。
, 百拇医药
2 兔角膜上皮细胞的制备
参照谢立信等[1]的方法，健康大白兔2只，雌雄不限，处死后立即摘除双侧眼球，置1%庆大霉素生理盐水液中浸泡30 min。在超净工作台内将眼球置培养皿中，仔细剪取完整角膜，用4＃针头在上皮面划痕,0.25%胰酶-EDTA溶液消化10 min,最后用消毒打孔器(Φ 6 mm)取相同面积角膜片7片。
3 兔角膜上皮细胞的培养及毒性实验
2块24孔板(Corning Co.)(1#板、2#板),每天使用2块板的1个纵行,共8个孔。d1将7片角膜片分别放入1#板的第1纵行的4个孔(A1,B1,C1,D1孔)和2#板第1纵行的3个孔(A1,B1,C1孔),角膜上皮面向下,紧贴孔底,加DMEM培养液(含10%FCS)0.5 ml/孔,在37℃，5% CO2培养箱内培养24 h,d 2将7片角膜移入第2纵行,如此每天移走角膜片并接种角膜片在下1纵行,连续6 d,以后每天每纵行的处理均依次按第1纵行进行。
, 百拇医药
移走角膜片的第1纵行每孔加DMEM培养液(含10%FCS)1ml继续培养至第48 h,d3用DMEM培养液(不含10%FCS)轻轻冲洗,然后加DMEM(含10%FCS)1 ml继续培养至第72h,d4用DMEM(不含10%FCS)冲洗后,加含氧氟沙星的DMEM培养液(含10%FCS)2 ml,使每孔终浓度分别为10 000 μg/ml(A1孔)、1 000 μg/ml(B1孔)、100 μg/ml
(C1孔)、10 μg/ml(D1孔) 、1 μg/ml(2#板A1孔),2#板的B,C行作空白对照(不作药物处理),D行作调零对照(检测时只加DMSO液)。
4 MTT法测定
给药培养48 h后,加MTT 200 μl/孔,继续培养4 h后,仔细吸完待测孔的培养液,加DMSO 1 ml/孔,于DG-3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)测各孔的OD570值。
, http://www.100md.com
5 数据的处理
细胞抑制率用6复孔的平均OD值来计算,细胞抑制率(%)=[(空白对照孔的平均OD值-药物处理孔的平均OD值)/空白对照孔的平均OD值]×100%。半数抑制浓度用Bliss方法计算,软件由中国毒理学会提供,IBM-586型微机处理。
结 果
24孔板原代培养兔角膜上皮细胞,设5种浓度氧氟沙星,每一浓度设6复孔,每次检测均设2孔空白对照和1孔调零对照,经MTT法检测10 000，1 000，100，10，1 μg/ml 五种浓度的氧氟沙星对兔角膜上皮细胞体外抑制率分别为：57.91%，35.69%，0.67%，-1.68%，-5.05%，尔后算出相关直线回归方程Y=-8.15+14.26 lgC;体外能使半数兔角膜上皮细胞受到抑制的氧氟沙星的浓度IC50=11.9 mg/ml,量效相关系数r=0.9126。
, http://www.100md.com
讨 论
MTT法最早用于白介素-2活性测定,以后用于细胞毒的检测。该法简单、快速、经济、安全、重复性好, 在一般条件下易于开展。
在进行细胞毒性的体外实验中,受试细胞的密度是非常重要的因素。我们通过控制接种的角膜面积以及增加重复实验的次数来克服原代细胞培养的局限性，实验中，每一孔浓度的OD值均在2倍6个复孔均数的标准差范围内，提示采用该法可间接达到控制细胞密度的目的。
氧氟沙星系第三代喹诺酮类抗菌药,其靶点是细菌的DNA拓扑异构酶Ⅱ,通过抑制此酶的A亚单位,从而抑制细菌DNA的复制和转录,达到抗菌的目的。氧氟沙星对常见病原菌的MIC一般均在0.062～0.5 mg/L之间，对金葡菌的MIC50和MIC90分别为0.25 mg/L和0.5 mg/L,对肺炎球菌和化脓性链球菌的MIC90为1.91 mg/L和1.26 mg/L[2]。目前临床上使用的氧氟沙星眼膏和滴眼液的浓度为0.3%, 已达到有效抑菌浓度, 我们的实验提示,现有的氧氟沙星眼科制剂的浓度对兔角膜上皮细胞是安全的。
参考文献
1 谢立信，董晓光，张德茹，等.兔角膜组织培养的技术改进.中华眼科杂志,1990,26(4)∶237
2 Fujimoto T,Mitsuhashi S.In vitro antibacterial activity of DR-3355,the S-(-)-isomer of ofloxacin.Chemotherapy (Basel)，1990,36(4)∶268
(收稿：1998-12-30 修回：1999-04-09), 百拇医药(成 旋 张 舒1)