PTA1酵母双杂交载体的构建
作者：李德敏 金伯泉 刘飞 欧阳为明 张建平 李林
单位：第四军医大学免疫学教研室，西安，710032
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990224血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cellactivation antigenl,PTA1)是一种表达于活化T细胞、NK细胞及血小板表面的白细胞分化抗原和粘附分子，于1997年将其基因克隆成功〔1〕，又被称为DNAX辅助分子1(DNAX accessory molecule 1,DN-AM-1)〔2〕。PTA1参与血小板的活化和混合淋巴细胞反应中杀伤性T细胞的诱导。序列分析表明，PTA1是一种穿膜糖蛋白，全长318aa。其中胞膜外区232aa，包括信号肽和2个Ig样结构域，穿膜区25aa，胞浆区61aa〔1〕。目前，PTA1的研究集中在其配体的寻找及其信号转导通路的阐明。1997年，Lanier等〔2〕发现，结肠癌细胞系Colo 205细胞表面有PTA1配体，但其性质还有待确定。1998年，他们又发现，PTA1活化信号的转导有赖于PKC的活化,但PTA1通过何种途径活化PKC尚不清楚〔3〕。
, 百拇医药
酵母双杂交(yeast two-hybrid)技术，是研究蛋白之间相互作用的一种新方法。为了应用这一技术发现PTA1的配体及其信号转导蛋白，本文将PTA1胞膜外区的两个结构域和胞浆区分别克隆入酵母双杂交表达载体中，经测序表明克隆正确，为下一步通过酵母双杂交技术进行靶蛋白的筛选打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料 含有PTA1全部序列的真核表达载体pEF-BOS-PTA1由本室保存。酵母双杂交表达载体pLexA，由本校生物化学教研室药立波教授提供；克隆载体pBluescriptKS(-)和大肠杆菌DH5α，均由本室保存。限制性内切酶EcoRI；BamHI和T4DNA连接酶，购自大连宝生物工程公司。WizardPlus质粒纯化试剂盒，购自Promega公司，NucleoTrap胶回收试剂盒，购自Clontech公司。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 PCR引物的设计 通过计算机辅助分析，根据PTA1序列，参考表达载体pLexA的读框，分别设计了针对其胞膜外区两个结构域(P1U/P1D,P2U/P2D)和胞浆区(P3U/P3D)的特异性引物，引物的序列为：
P1U：5′CGGAATTCGAAGAGGTGCTTTGG3′
P1D：5′CGGAATCCAAAACTATCGTACTG3′
P2U：5′CGGAATTCTTTGAGGCAGCTGTG3′
P2D：5′GCGGATCCAGTCAATCTCATCACGAAGG3′
P3U：5′CGGAATTCCCACACCAAACAGAAGGAGAAGG3′
P3D：5′CGGGATCCTTAAACTCTAGTCTTTGG3′
, http://www.100md.com
每个上游引物加入EcoRI酶切位点，下游引物加入BamHI酶切位点。由于胞浆区较小，所以在P3U启始处加了3个刚性氨基酸-脯氨酸残基密码子。
1.2.2 PCR扩增PTA1各个片段 以含有PTA1全长的真核表达载体pEF-BOS-PTA1为模板，分别以P1U/P1D，P2U/P2D，P1U/P2D和P3U/P3D引物扩增PTA1胞膜外区的第一、二个结构域、胞膜外区全长和胞浆区。反应条件为：94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 90s，进行30个循环。
1.2.3 PCR产物的克隆 将PCR产物加两倍体积乙醇和1/10体积的乙酸铵沉淀后，溶于27μl去离子水中。加3μl10×bufferK，1μlEcoRI(10U)和1μlBamHI(10U)酶切，琼脂糖电泳回收酶切片段。克隆载体pBluescriptKS(-)同样酶切回收后，按片段∶载体为3∶1的比例，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。取连接产物2μl，转化感受态DH5α，37℃培养16h，挑取菌落，以碱裂解小量法提取质粒，进行EcoRI/BamHI双酶切及PCR鉴定。鉴定正确后，送大连宝生物工程公司测序。
, 百拇医药
1.2.4 pLexA表达载体的构建 将含有PTA1各个片段的pBluescriptKS(-)载体纯化后，用EcoRI/BamHI双酶切，回收切下的小片段。用EcoRI/BamHI双酶切pLexA载体，回收后与PTA1各个小片段连接，连接产物转化感受态DH5α。培养出菌落后，小量提质粒，用EcoRI/BamHI双酶切和PCR鉴定。
2 结果
2.1 PTA1各片段的PCR扩增 以含有PTA1全长的真核表达载体pEF-BOS-PTA1为模板，分别扩增PTA1胞膜外区的第一、二个结构域、胞膜外区全长和胞浆区。经琼脂糖电泳后，可分别见到长度为352bp，362bp，695bp和211bp的片段，分别命名为A1-1，A1-2，A1-12和A1-3(图1-A)。
, 百拇医药
图1 PTA1酵母双杂交载体的构建
(A)PTA1各个片段的PCR结果；(B) pBluescript KS(-)与PTA1各片段重组质粒的酶切鉴定；(C)pLexA与PTA1各片段重组质粒的酶切鉴定
1: A1-1; 2: A1-2; 3: A1-12; 4: A1-3; 5: Biolabs 100 bp ladder
2.2 PTA1各片段向pBluescript KS(-)的克隆 PTA1各片段用EcoRI/BamHI双酶切后，与同样，双酶切的pBluescriptKS(-)载体连接，转化DH5α，筛选得到含有插入片段的阳性克隆。小量法提质粒后，用EcoRI/BamHI双酶切，可切下相应大小的片段(图1-C)。测序结果表明，序列正确(测序结果略)。
2.3 PTA1各片段由pBluescript KS(-)向pLexA的亚克隆 将含有插入片段的pBluescript KS(-)载体用EcoRI/BamH I双酶切后，回收切下的PTA1片段，与同样双酶切的pLexA载体连接，转化DH5α，筛选得到含有插入片段的阳性克隆。小量法提质粒后，用EcoRI/BamHI双酶切，可切下相应大小的片段(图1-B)。
, http://www.100md.com
3 讨 论
酵母双杂交技术是90年代兴起的一种研究蛋白质之间相互作用的新技术〔4〕。依据真核转录因子的DNA结构域与活化域分离的特性，将靶蛋白和钓饵蛋白分别与二者结合。只有靶蛋白与钓饵蛋白可相互作用时，转录因子所调控的报告基因才能表达。所以依据报告基因表达与否，即可判断靶蛋白与钓饵蛋白之间是否作用。采用这种技术，不但可以验证已知蛋白之间的相互作用，也可以通过筛选靶蛋白表达文库来寻找与靶蛋白结合的新的蛋白。所以应用酵母双杂交技术，对寻找PTA1的配体及其信号转导蛋白是一条新的技术路线。
PTA1的胞膜外区由两个Ig样结构域组成，目前还没有任何证据表明，是哪一个结构域与配体结合，也许两个结构域均可与配体结合，或者两个结构域分别与不同的配体结合。所以在设计双杂交载体时，应将PTA1胞膜外区两个结构域分别及全部克隆入表达载体。这样，如果筛选到阳性结果，将可同时了解到与该配体结合的结构域。酵母属真核细胞，相对于原核细胞的表达而言，其表达产物更接近于天然。我们采用Clontech公司的MACTHMAKER LexA酵母双杂交系统，蛋白表达量高，具有双重报告基因，因而敏感性更高。但其与其它蛋白表达系统一样，酵母中蛋白的表达也具有一定的不确定性，只有待所构建的载体在酵母中转化并表达后，才能确定所插入的片段是否正确表达。
, http://www.100md.com
作者简介：李德敏，男，29岁，博士生。西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374531
参考文献
[1]Sherrington PD, Scott JL, Jin B, et al. TLiSA1(PTA1) activation antigen implicated in T cell differentiation and platelet activation is a member of the immunoglobulin superfamily exhibiting distinctive regulation of expression. J Biol Chem， 1997;272(35):21735
[2] Shibuya A, Campbell D, Hannum C, et al. DNAM-1, a novel adhesion molecule involved in the cytolitic function of T lymphocytes. Immunity, 1997; 4:573～582
, http://www.100md.com
[3]Shibuya A, Lanier LL， Phillips JH. Protein Kinase C is involved in the regulation of both signaling and adhesion mediated by DNAX accessory Molecule 1 receptor. J Immunol，1998; 161:1671～1676
[4] Fields S, Sternglanz R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interaction. Traned Genet, 1994; 10:286～292
[5]金冬雁，黎孟枫,译.分子克隆实验指南.北京科学出版社，第2版.1992:1～74
收稿：1999-01-22
修回：1999-03-04, http://www.100md.com
单位：第四军医大学免疫学教研室，西安，710032
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990224血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cellactivation antigenl,PTA1)是一种表达于活化T细胞、NK细胞及血小板表面的白细胞分化抗原和粘附分子，于1997年将其基因克隆成功〔1〕，又被称为DNAX辅助分子1(DNAX accessory molecule 1,DN-AM-1)〔2〕。PTA1参与血小板的活化和混合淋巴细胞反应中杀伤性T细胞的诱导。序列分析表明，PTA1是一种穿膜糖蛋白，全长318aa。其中胞膜外区232aa，包括信号肽和2个Ig样结构域，穿膜区25aa，胞浆区61aa〔1〕。目前，PTA1的研究集中在其配体的寻找及其信号转导通路的阐明。1997年，Lanier等〔2〕发现，结肠癌细胞系Colo 205细胞表面有PTA1配体，但其性质还有待确定。1998年，他们又发现，PTA1活化信号的转导有赖于PKC的活化,但PTA1通过何种途径活化PKC尚不清楚〔3〕。
, 百拇医药
酵母双杂交(yeast two-hybrid)技术，是研究蛋白之间相互作用的一种新方法。为了应用这一技术发现PTA1的配体及其信号转导蛋白，本文将PTA1胞膜外区的两个结构域和胞浆区分别克隆入酵母双杂交表达载体中，经测序表明克隆正确，为下一步通过酵母双杂交技术进行靶蛋白的筛选打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料 含有PTA1全部序列的真核表达载体pEF-BOS-PTA1由本室保存。酵母双杂交表达载体pLexA，由本校生物化学教研室药立波教授提供；克隆载体pBluescriptKS(-)和大肠杆菌DH5α，均由本室保存。限制性内切酶EcoRI；BamHI和T4DNA连接酶，购自大连宝生物工程公司。WizardPlus质粒纯化试剂盒，购自Promega公司，NucleoTrap胶回收试剂盒，购自Clontech公司。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 PCR引物的设计 通过计算机辅助分析，根据PTA1序列，参考表达载体pLexA的读框，分别设计了针对其胞膜外区两个结构域(P1U/P1D,P2U/P2D)和胞浆区(P3U/P3D)的特异性引物，引物的序列为：
P1U：5′CGGAATTCGAAGAGGTGCTTTGG3′
P1D：5′CGGAATCCAAAACTATCGTACTG3′
P2U：5′CGGAATTCTTTGAGGCAGCTGTG3′
P2D：5′GCGGATCCAGTCAATCTCATCACGAAGG3′
P3U：5′CGGAATTCCCACACCAAACAGAAGGAGAAGG3′
P3D：5′CGGGATCCTTAAACTCTAGTCTTTGG3′
, http://www.100md.com
每个上游引物加入EcoRI酶切位点，下游引物加入BamHI酶切位点。由于胞浆区较小，所以在P3U启始处加了3个刚性氨基酸-脯氨酸残基密码子。
1.2.2 PCR扩增PTA1各个片段 以含有PTA1全长的真核表达载体pEF-BOS-PTA1为模板，分别以P1U/P1D，P2U/P2D，P1U/P2D和P3U/P3D引物扩增PTA1胞膜外区的第一、二个结构域、胞膜外区全长和胞浆区。反应条件为：94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 90s，进行30个循环。
1.2.3 PCR产物的克隆 将PCR产物加两倍体积乙醇和1/10体积的乙酸铵沉淀后，溶于27μl去离子水中。加3μl10×bufferK，1μlEcoRI(10U)和1μlBamHI(10U)酶切，琼脂糖电泳回收酶切片段。克隆载体pBluescriptKS(-)同样酶切回收后，按片段∶载体为3∶1的比例，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。取连接产物2μl，转化感受态DH5α，37℃培养16h，挑取菌落，以碱裂解小量法提取质粒，进行EcoRI/BamHI双酶切及PCR鉴定。鉴定正确后，送大连宝生物工程公司测序。
, 百拇医药
1.2.4 pLexA表达载体的构建 将含有PTA1各个片段的pBluescriptKS(-)载体纯化后，用EcoRI/BamHI双酶切，回收切下的小片段。用EcoRI/BamHI双酶切pLexA载体，回收后与PTA1各个小片段连接，连接产物转化感受态DH5α。培养出菌落后，小量提质粒，用EcoRI/BamHI双酶切和PCR鉴定。
2 结果
2.1 PTA1各片段的PCR扩增 以含有PTA1全长的真核表达载体pEF-BOS-PTA1为模板，分别扩增PTA1胞膜外区的第一、二个结构域、胞膜外区全长和胞浆区。经琼脂糖电泳后，可分别见到长度为352bp，362bp，695bp和211bp的片段，分别命名为A1-1，A1-2，A1-12和A1-3(图1-A)。
, 百拇医药
图1 PTA1酵母双杂交载体的构建
(A)PTA1各个片段的PCR结果；(B) pBluescript KS(-)与PTA1各片段重组质粒的酶切鉴定；(C)pLexA与PTA1各片段重组质粒的酶切鉴定
1: A1-1; 2: A1-2; 3: A1-12; 4: A1-3; 5: Biolabs 100 bp ladder
2.2 PTA1各片段向pBluescript KS(-)的克隆 PTA1各片段用EcoRI/BamHI双酶切后，与同样，双酶切的pBluescriptKS(-)载体连接，转化DH5α，筛选得到含有插入片段的阳性克隆。小量法提质粒后，用EcoRI/BamHI双酶切，可切下相应大小的片段(图1-C)。测序结果表明，序列正确(测序结果略)。
2.3 PTA1各片段由pBluescript KS(-)向pLexA的亚克隆 将含有插入片段的pBluescript KS(-)载体用EcoRI/BamH I双酶切后，回收切下的PTA1片段，与同样双酶切的pLexA载体连接，转化DH5α，筛选得到含有插入片段的阳性克隆。小量法提质粒后，用EcoRI/BamHI双酶切，可切下相应大小的片段(图1-B)。
, http://www.100md.com
3 讨 论
酵母双杂交技术是90年代兴起的一种研究蛋白质之间相互作用的新技术〔4〕。依据真核转录因子的DNA结构域与活化域分离的特性，将靶蛋白和钓饵蛋白分别与二者结合。只有靶蛋白与钓饵蛋白可相互作用时，转录因子所调控的报告基因才能表达。所以依据报告基因表达与否，即可判断靶蛋白与钓饵蛋白之间是否作用。采用这种技术，不但可以验证已知蛋白之间的相互作用，也可以通过筛选靶蛋白表达文库来寻找与靶蛋白结合的新的蛋白。所以应用酵母双杂交技术，对寻找PTA1的配体及其信号转导蛋白是一条新的技术路线。
PTA1的胞膜外区由两个Ig样结构域组成，目前还没有任何证据表明，是哪一个结构域与配体结合，也许两个结构域均可与配体结合，或者两个结构域分别与不同的配体结合。所以在设计双杂交载体时，应将PTA1胞膜外区两个结构域分别及全部克隆入表达载体。这样，如果筛选到阳性结果，将可同时了解到与该配体结合的结构域。酵母属真核细胞，相对于原核细胞的表达而言，其表达产物更接近于天然。我们采用Clontech公司的MACTHMAKER LexA酵母双杂交系统，蛋白表达量高，具有双重报告基因，因而敏感性更高。但其与其它蛋白表达系统一样，酵母中蛋白的表达也具有一定的不确定性，只有待所构建的载体在酵母中转化并表达后，才能确定所插入的片段是否正确表达。
, http://www.100md.com
作者简介：李德敏，男，29岁，博士生。西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374531
参考文献
[1]Sherrington PD, Scott JL, Jin B, et al. TLiSA1(PTA1) activation antigen implicated in T cell differentiation and platelet activation is a member of the immunoglobulin superfamily exhibiting distinctive regulation of expression. J Biol Chem， 1997;272(35):21735
[2] Shibuya A, Campbell D, Hannum C, et al. DNAM-1, a novel adhesion molecule involved in the cytolitic function of T lymphocytes. Immunity, 1997; 4:573～582
, http://www.100md.com
[3]Shibuya A, Lanier LL， Phillips JH. Protein Kinase C is involved in the regulation of both signaling and adhesion mediated by DNAX accessory Molecule 1 receptor. J Immunol，1998; 161:1671～1676
[4] Fields S, Sternglanz R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interaction. Traned Genet, 1994; 10:286～292
[5]金冬雁，黎孟枫,译.分子克隆实验指南.北京科学出版社，第2版.1992:1～74
收稿：1999-01-22
修回：1999-03-04, http://www.100md.com