阿霉素水溶液与阿霉素脂质体的抗癌活性和毒性考察
作者：杨铁耀 李红侠 陈 重
单位：深圳南方制药厂， 深圳 518029
关键词：冻干阿霉素脂质体；制备工艺；毒性；抗癌作用
沈阳药科大学学报990310摘 要 简要介绍了冻干霉素脂质体的制备工艺，并进行了毒性和抗癌活性的考察，与游离阿霉素相比，冻干阿霉素脂质体毒性降低，LD50由11.0 mg/kg增大到15.1 mg/kg，并保持或提高了抗癌活性.
分类号 R94
Studies on Freeze-dried Liposomal Doxorubicin
Yang Tieyao,Li Hongxia,Chen Zhong
, 百拇医药
Shenzhen Nanfang Pharmaceutical Factory,Shenzhen 518029
Abstract A preparation method of the freeze-dried doxorubicin liposomal was illustrated in the paper.In addition,the therapeutic effects and toxicity of doxorubicin(DOX)and liposomal doxorubicin(Lip-DOX)were compared.It was found that Lip-DOX was less toxic than DOX after i.v.administration in tumor-bearing animals,and Lip-DOX was therapeutically superior to DOX at equal doses in the S180、U14、P888 tumor model.
, http://www.100md.com
Key words freeze-dried doxorubicin liposome;preparation method;toxicities;antitumor activity
盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)是蒽环类广谱抗肿瘤抗生素，疗效较好，临床上主要用于急慢性白血病、恶性淋巴瘤的治疗.还用于肝癌、胃癌、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等的联合化疗.但阿霉素的毒性较大，除产生恶心、呕吐、骨髓抑制等副作用外，还可引起与剂量有关的心脏毒性〔1，2〕，此毒性是限制其临床应用的主要因素.多年来，人们一直在寻找降低阿霉素毒性的有效方法，如调整给药方案：研制心脏毒性较低的阿霉素类似物；通过合并用药来减轻其心脏毒性等.本世纪70年代末开始研究用脂质体作为蒽环类抗癌药的有效载体〔3～5〕，将抗癌药物以脂质体包裹制成抗癌药物靶向新剂型，静脉给药后，主要分布于网状内皮系统(RES)，减少了阿霉素在心肌的分布，因此可利用脂质体包封阿霉素米降低其心肌毒性，并保持或提高其抗癌活性，为此研制了冻干阿霉素脂质体，并对其制备工艺、毒性与抗癌活性进行了研究.
, 百拇医药
1 试药与材料
阿霉素(Dox.)，购自浙江海门制药厂，临用前加入注射用水溶解即可(批号：880601)，精制豆磷脂，购自上海油脂一厂；胆固醇等为市售品.
昆明种小鼠：体重18～22 g,天津药物研究院动物室提供；DBA近交系小鼠：雌性，体重18～22 g，北京市肿瘤研究所动物室提供.
小鼠肉瘤180(S180)、小鼠宫颈癌14(U14)及白血病388(P388)株均由北京医科院药物研究所提供.
2 方法与结果
2.1 制备工艺
将一定比例的精制豆磷脂、胆固醇和维生素E(2∶1∶0.5)溶于200 mL溶媒中，倒入装有下玻璃珠的500 mL的烧瓶中，于40～50℃减压蒸发干燥，再在真空状态下，以硅胶保干4 h，制得脂质膜.
, 百拇医药
另将阿霉素溶于2 500 mL水中，然后加入到上述制备的脂质膜中，振摇至脂质膜全部溶解，即制得阿霉素脂质体混悬液.
将制得的混悬液加入冻干赋形剂，溶解后分装于西林瓶中，每瓶2.5 mL，冷冻干燥，充N2，压盖即得.
冻干阿霉素脂质体临用前加入注射用水，振摇即重新形成脂质体混悬液.
2.2 阿霉素脂质体对小鼠急性毒性试验
体重18～22 g小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，分别静脉注射给予阿霉素脂质体或阿霉素，观察一次给药15天内小鼠的死亡时间和产生的毒性反应情况.并采用bliss法测定其半数致死量(LD50).
阿霉素脂质体：小鼠于第4天开始出现死亡，死亡主要在第5～7天；动物呈现行走不稳、静卧、呼吸急促，最后死亡，尸体解剖经肉眼观察除心脏呈苍白色并处于松驰状态外其它主要脏器无异常变化，LD50为15.1(95%置信限为13.8～16.4)mg/kg(见表1).
, 百拇医药
Tab.1 Acute toxicity to mice by iv Dox-lip or Dox on one time Drug
Dose/
mg.kg-1
Log dose/
logX
Number of
animals
Number of
death
Death rate
, 百拇医药
/%
Probility
bit
LD50/mg.kg-1
(95%Reliability)
Dox-lip
18.0
1.26
10
8
80
, 百拇医药
5.84
16.2
1.21
10
6
60
5.25
15.1
14.4
1.16
10
4
40
, 百拇医药
4.75
(13.8～16.4)
13.0
1.11
10
3
30
4.48
11.5
1.06
10
1
10
, 百拇医药
3.72
Dox
15.0
1.18
10
10
100
7.40
13.5
1.13
10
8
80
, http://www.100md.com
5.84
11.0
12.0
1.08
10
6
60
5.52
(10.2～11.3)
10.8
1.03
10
5
, 百拇医药
50
5.00
9.6
0.98
10
3
30
4.48
8.6
0.93
10
1
10
, 百拇医药 3.72
阿霉素：小鼠于第2天开始出现死亡，死亡主要分布在3～5天；动物呈现行走不稳、静卧、呼吸急促，最后死亡，尸体解剖经肉眼观察除心脏呈苍白色并处于松驰状态外其它主要脏器无异常变化，LD50为11.0(95%置信限为10.2～11.8)mg/kg(见表1).
两药的LD50经U-检查比较有非常显著差异(P<0.01)，表明阿霉素脂质体急性毒性明显小于阿霉素.
2.3 阿霉素脂质体导致心肌损害及其超微结构变化
雄性小鼠30只，随机分成3组，每组10只.分别静注射生理盐水(0.1 mg/10 g)，阿霉素脂质体(4 mg/kg)、阿霉素(4 mg/kg)，每天一次，连续3天，于未次给药后第一天和第五天，每组取5只断头处死，迅速开胸取出左心室心尖，置于2%戊二醛二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)固定液中，用1%锇酸固定后，酒精系列脱水，环氧树脂Epon 812浸透包埋，超薄切片机切片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，在Hitachi H-600透射电镜下进行观察.
, 百拇医药
2.3.1 正常对照组
胞浆中可见少量散在的糖原颗粒和囊泡状的滑面内质网；胞核呈长杆状，少量异染色体附着于内层核膜上；线粒体含量丰富，板状嵴排列紧密；肌原纤维的肌节结构可清晰地分辩出明带、暗带、z线、H带和M带.
2.3.2 阿霉素脂质体组
停药第一天：线粒体含量较丰富，嵴排列较规则、密集，约30%左右的线粒体可见部分(区域)嵴断裂，少许线粒体呈现泡样变化；心肌纤维中可见较典型的肌节结构，偶见肌丝分离现象，可见正常结构之闰板.
停药第五天：线粒体含量丰富，部分线粒体可见轻一中度嵴断裂，偶见泡样变化；心肌纤维中肌原纤维结构未见明显异常.
2.3.3 阿霉素组
停药第一天：肌浆中线粒体含量丰富，呈弥散性肿涨扩张样变化，主要表现为，外形饱满，电子密度减低，嵴疏松和嵴断裂直至泡样变；肌纤维中肌节结构较清晰，z线、M线、H带粗细肌丝等结构均可辨认，少许肌原纤维中可见肌丝分离现象；心肌间质中的毛细血管可见较多的红细胞(淤积).
, 百拇医药
停药第五天：线粒体广泛性电子密度减低、嵴疏松、嵴断裂和泡样变化；心肌纤维部分变化状如停药第一天，但主要变化为出现较明显的(程度不一的)肌丝分离乃至断裂现象，肌节结构显得不清晰，H带常不可分辨，然而闰板结构未见异常；间质毛细管血中可见较多红细胞.
从上述结果可以看出：连续静脉注射阿霉素脂质体(4 mg/kg/3)，主要表现为线粒体的轻-中度退变，随着停药时间延长程度有所减轻：阿霉素主要表现为广泛性线粒体肿胀、扩张、泡样变，停药第五天病变显著重于停药第一天；两药相比，阿霉素脂质体对心肌的损害轻于阿霉素.
2.4 阿霉素脂质体抗肿瘤作用
按照全国肿化疗会议制定的抗癌药物体内药效试验规程的要求进行.每次实验均设下列各组：生理盐水对照组，脂质体对照组，阿霉素脂质体3个剂量组，阿霉素3个剂量组.
2.4.1 阿霉素脂质体对S180的影响
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在无菌条件下取接种后约7天，肿瘤生长旺盛的瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，消毒操作部位皮肤，选择无环死右液化的癌组织，按1∶4加无菌生理盐水，用组织均浆器制成瘤细胞悬液，于右前肢腋下皮下接种0.2 mL/只，随种后24 h随机分组，每组10只(均为雌性)，每组小鼠的平均体重相差不超过1 g,并开始给药，采用尾静脉注射0.2 mL脂质体溶液，在首次给药后第8天处死动物，剥离肿瘤，称取瘤重、体重，按下列公式计算肿瘤抑制率.肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%
实验数据采用T检验进行统计学处理，结果见表2.从表2可以看出：静脉给予0.5、1、2 mg/kg阿霉素脂质体对S180均有明显的抑制作用，强于同剂量阿霉素，并且随剂量加大其抑瘤作用增强.
2.4.2 阿霉素脂质体对U14的影响
方法同“2.4.1”项.不同处是在首次给药后第10于处死动物，计算抑制率.结果见表2.可以看出：静脉给予阿霉素脂质体对U14呈剂量相关性抑制，其抑瘤作用强于同剂量阿霉素.
, 百拇医药
Tab.2 Inhibitory activity of Dox-lip of Dox to S180、U14、P388 Tumor
Drug
Dose/
mg.kg-1
Num of animals
initial end
Body weight/g
initial end
Tumor weight/g
, 百拇医药
X±SD
Inhibitory rate/
%
S180
NS
10
10
21.0
23.6
1.50±0.62
Lip
10
10
, http://www.100md.com
21.0
24.8
1.66±0.54
-10.7
Dox-Lip
0.5
10
10
21.0
21.5
1.02±0.48
32.0
Dox-Lip
, 百拇医药
1.0
10
10
21.0
21.3
0.49±0.14
67.3
Dox-Lip
2.0
10
10
21.0
21.8
, 百拇医药
0.46±0.17
69.3
Dox
0.5
10
10
21.0
22.5
1.40±0.33
6.7
Dox
1.0
10
, 百拇医药
10
21.0
22.6
1.28±0.69
14.7
Dox
2.0
10
10
21.0
22.4
0.72±0.35
52.0
, http://www.100md.com
U14
NS
10
10
21.0
20.6
2.94±0.40
Lip
10
10
21.0
20.2
2.91±0.38
, http://www.100md.com
1.0
Dox-Lip
0.5
10
10
21.0
22.0
2.73±0.66
7.1
Dox-Lip
1.0
10
10
, http://www.100md.com
21.0
22.3
1.71±0.43
41.8
Dox-Lip
2.0
10
10
21.0
22.7
0.48±0.19
83.7
Dox
, http://www.100md.com
0.5
10
10
21.0
20.8
2.81±0.42
4.4
Dox
1.0
10
10
21.0
21.6
, 百拇医药
2.44±0.61
17.0
Dox
2.0
10
10
21.0
22.1
1.42±0.39
52.0
Days of live/X±SD
Life delay rate/
, http://www.100md.com
%
P388
NS
10
10
12.2±1.4
Lip
10
10
12.0±1.3
-1.6
Dox-Lip
0.13
, 百拇医药
10
10
19.3±2.8
58.2
Dox-Lip
0.25
10
10
25.9±2.1
112.3
Dox-Lip
0.50
10
, 百拇医药
10
22.8±2.4
86.9
Dox
0.13
10
10
17.8±3.6
45.9
Dox
0.25
10
10
, http://www.100md.com
25.0±2.3
104.9
Dox
0.50
10
10
20.5±2.5
68.0
2.4.3 阿霉素脂质体对P388的影响
取接种于DBA/2小鼠后约7天健康较好的动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤，抽取腹水，配成瘤细胞悬液，活细胞数为106/mL腹腔注射于DBA/2小鼠，每只小鼠注射0.1 mL(含P388细胞105个)，每批实验均用雌性小鼠，于接种后24 h将动物按体重分组，每组10只(第2批实验每组12只)，并开始给药，采用尾静脉注射给药，每天一次，连续3天，容积均为0.2 mL/20 g，对照组分别静脉注0.2 mL生理盐水，脂质体对照组静脉注0.2 mL脂质体溶液，记录死亡天数，按下列公式计算生命延长率.生命延长率=(给药组平均生存天数-对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数×100
, http://www.100md.com
结果见表2.从表2可以看出：静脉给予0.13、0.25、0.5 mg/kg阿霉素脂质体对P388均有明显的抑制作用，其抑瘤作用和同剂量阿霉素相当.
3 讨论
自1988年以来，作者在总结国内外大量文献基础上〔6～11〕，对比研究了多种制备方法，分别以冻干前和冻干后的阿霉素包封率、稳定性和脂质体颗粒大小为指标进行考查，确定了最佳制备工艺.磷脂与胆固醇、维生素E的量和比例以及溶媒的选择对冻干前包封率影响较大，冻干赋形剂的量与比例如乳糖、甘露醇、海藻糖对冻干后的包封率有很大影响.胆固醇的加入，降低了脂质体磷脂膜的流动性，使包封药物不易渗漏出去，即增加了膜稳定性.维生素E的加入，是为了阻滞磷脂和胆固醇的氧化，从而增加脂质体的稳定性〔12〕.
对于抗肿瘤药物，决定性的评判标准就是低毒、高效，一般的抗肿瘤药物，都具有极强的抑瘤活性，降低药物毒性，则显得尤为重要.作者对制得的冻干阿霉素脂质体的毒性及抗癌活性与游离阿霉素进行了比较研究，两药的LD50经U-检验比较有非常显著差异(P<0.01)，表明阿霉素脂质体急性毒性明显小于阿霉素；心脏毒性实验证明：阿霉素脂质体对心脏线粒体有轻度的损伤，停药时间延长逐步恢复；而阿霉素对心肌线粒体有严重损伤，对肌原纤维亦有一定程度的损伤，而且停药时间延长没有减轻，抗肿瘤实验表明：阿霉素脂质体对S188、U14、P388均有明显的抑制作用，其作用强于等剂量的阿霉素.
, 百拇医药
这一结果为冻干阿霉素脂质体进入临床验证提供了可喜依据.
致谢 天津药物研究院药理二室对研究结予支持和帮助，特此致谢.
参考文献
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6 Storm G,Steerenberg PA,Ennen F.Release of doxorubicin from peritoneal macrrrrrophages exposed in vivo to doxorbuicln-containing liposomes.Biochimica et Biophysia Acta,1988，965：136～141
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12 Anthony C,Sue Tsany α-Tocopherol retards autoxidation and prolongs the shelf-life of liposomes.Int J Pharm,1981，8：101～110
收稿日期:1998-02-01, 百拇医药
单位：深圳南方制药厂， 深圳 518029
关键词：冻干阿霉素脂质体；制备工艺；毒性；抗癌作用
沈阳药科大学学报990310摘 要 简要介绍了冻干霉素脂质体的制备工艺，并进行了毒性和抗癌活性的考察，与游离阿霉素相比，冻干阿霉素脂质体毒性降低，LD50由11.0 mg/kg增大到15.1 mg/kg，并保持或提高了抗癌活性.
分类号 R94
Studies on Freeze-dried Liposomal Doxorubicin
Yang Tieyao,Li Hongxia,Chen Zhong
, 百拇医药
Shenzhen Nanfang Pharmaceutical Factory,Shenzhen 518029
Abstract A preparation method of the freeze-dried doxorubicin liposomal was illustrated in the paper.In addition,the therapeutic effects and toxicity of doxorubicin(DOX)and liposomal doxorubicin(Lip-DOX)were compared.It was found that Lip-DOX was less toxic than DOX after i.v.administration in tumor-bearing animals,and Lip-DOX was therapeutically superior to DOX at equal doses in the S180、U14、P888 tumor model.
, http://www.100md.com
Key words freeze-dried doxorubicin liposome;preparation method;toxicities;antitumor activity
盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)是蒽环类广谱抗肿瘤抗生素，疗效较好，临床上主要用于急慢性白血病、恶性淋巴瘤的治疗.还用于肝癌、胃癌、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等的联合化疗.但阿霉素的毒性较大，除产生恶心、呕吐、骨髓抑制等副作用外，还可引起与剂量有关的心脏毒性〔1，2〕，此毒性是限制其临床应用的主要因素.多年来，人们一直在寻找降低阿霉素毒性的有效方法，如调整给药方案：研制心脏毒性较低的阿霉素类似物；通过合并用药来减轻其心脏毒性等.本世纪70年代末开始研究用脂质体作为蒽环类抗癌药的有效载体〔3～5〕，将抗癌药物以脂质体包裹制成抗癌药物靶向新剂型，静脉给药后，主要分布于网状内皮系统(RES)，减少了阿霉素在心肌的分布，因此可利用脂质体包封阿霉素米降低其心肌毒性，并保持或提高其抗癌活性，为此研制了冻干阿霉素脂质体，并对其制备工艺、毒性与抗癌活性进行了研究.
, 百拇医药
1 试药与材料
阿霉素(Dox.)，购自浙江海门制药厂，临用前加入注射用水溶解即可(批号：880601)，精制豆磷脂，购自上海油脂一厂；胆固醇等为市售品.
昆明种小鼠：体重18～22 g,天津药物研究院动物室提供；DBA近交系小鼠：雌性，体重18～22 g，北京市肿瘤研究所动物室提供.
小鼠肉瘤180(S180)、小鼠宫颈癌14(U14)及白血病388(P388)株均由北京医科院药物研究所提供.
2 方法与结果
2.1 制备工艺
将一定比例的精制豆磷脂、胆固醇和维生素E(2∶1∶0.5)溶于200 mL溶媒中，倒入装有下玻璃珠的500 mL的烧瓶中，于40～50℃减压蒸发干燥，再在真空状态下，以硅胶保干4 h，制得脂质膜.
, 百拇医药
另将阿霉素溶于2 500 mL水中，然后加入到上述制备的脂质膜中，振摇至脂质膜全部溶解，即制得阿霉素脂质体混悬液.
将制得的混悬液加入冻干赋形剂，溶解后分装于西林瓶中，每瓶2.5 mL，冷冻干燥，充N2，压盖即得.
冻干阿霉素脂质体临用前加入注射用水，振摇即重新形成脂质体混悬液.
2.2 阿霉素脂质体对小鼠急性毒性试验
体重18～22 g小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，分别静脉注射给予阿霉素脂质体或阿霉素，观察一次给药15天内小鼠的死亡时间和产生的毒性反应情况.并采用bliss法测定其半数致死量(LD50).
阿霉素脂质体：小鼠于第4天开始出现死亡，死亡主要在第5～7天；动物呈现行走不稳、静卧、呼吸急促，最后死亡，尸体解剖经肉眼观察除心脏呈苍白色并处于松驰状态外其它主要脏器无异常变化，LD50为15.1(95%置信限为13.8～16.4)mg/kg(见表1).
, 百拇医药
Tab.1 Acute toxicity to mice by iv Dox-lip or Dox on one time Drug
Dose/
mg.kg-1
Log dose/
logX
Number of
animals
Number of
death
Death rate
, 百拇医药
/%
Probility
bit
LD50/mg.kg-1
(95%Reliability)
Dox-lip
18.0
1.26
10
8
80
, 百拇医药
5.84
16.2
1.21
10
6
60
5.25
15.1
14.4
1.16
10
4
40
, 百拇医药
4.75
(13.8～16.4)
13.0
1.11
10
3
30
4.48
11.5
1.06
10
1
10
, 百拇医药
3.72
Dox
15.0
1.18
10
10
100
7.40
13.5
1.13
10
8
80
, http://www.100md.com
5.84
11.0
12.0
1.08
10
6
60
5.52
(10.2～11.3)
10.8
1.03
10
5
, 百拇医药
50
5.00
9.6
0.98
10
3
30
4.48
8.6
0.93
10
1
10
, 百拇医药 3.72
阿霉素：小鼠于第2天开始出现死亡，死亡主要分布在3～5天；动物呈现行走不稳、静卧、呼吸急促，最后死亡，尸体解剖经肉眼观察除心脏呈苍白色并处于松驰状态外其它主要脏器无异常变化，LD50为11.0(95%置信限为10.2～11.8)mg/kg(见表1).
两药的LD50经U-检查比较有非常显著差异(P<0.01)，表明阿霉素脂质体急性毒性明显小于阿霉素.
2.3 阿霉素脂质体导致心肌损害及其超微结构变化
雄性小鼠30只，随机分成3组，每组10只.分别静注射生理盐水(0.1 mg/10 g)，阿霉素脂质体(4 mg/kg)、阿霉素(4 mg/kg)，每天一次，连续3天，于未次给药后第一天和第五天，每组取5只断头处死，迅速开胸取出左心室心尖，置于2%戊二醛二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)固定液中，用1%锇酸固定后，酒精系列脱水，环氧树脂Epon 812浸透包埋，超薄切片机切片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，在Hitachi H-600透射电镜下进行观察.
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2.3.1 正常对照组
胞浆中可见少量散在的糖原颗粒和囊泡状的滑面内质网；胞核呈长杆状，少量异染色体附着于内层核膜上；线粒体含量丰富，板状嵴排列紧密；肌原纤维的肌节结构可清晰地分辩出明带、暗带、z线、H带和M带.
2.3.2 阿霉素脂质体组
停药第一天：线粒体含量较丰富，嵴排列较规则、密集，约30%左右的线粒体可见部分(区域)嵴断裂，少许线粒体呈现泡样变化；心肌纤维中可见较典型的肌节结构，偶见肌丝分离现象，可见正常结构之闰板.
停药第五天：线粒体含量丰富，部分线粒体可见轻一中度嵴断裂，偶见泡样变化；心肌纤维中肌原纤维结构未见明显异常.
2.3.3 阿霉素组
停药第一天：肌浆中线粒体含量丰富，呈弥散性肿涨扩张样变化，主要表现为，外形饱满，电子密度减低，嵴疏松和嵴断裂直至泡样变；肌纤维中肌节结构较清晰，z线、M线、H带粗细肌丝等结构均可辨认，少许肌原纤维中可见肌丝分离现象；心肌间质中的毛细血管可见较多的红细胞(淤积).
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停药第五天：线粒体广泛性电子密度减低、嵴疏松、嵴断裂和泡样变化；心肌纤维部分变化状如停药第一天，但主要变化为出现较明显的(程度不一的)肌丝分离乃至断裂现象，肌节结构显得不清晰，H带常不可分辨，然而闰板结构未见异常；间质毛细管血中可见较多红细胞.
从上述结果可以看出：连续静脉注射阿霉素脂质体(4 mg/kg/3)，主要表现为线粒体的轻-中度退变，随着停药时间延长程度有所减轻：阿霉素主要表现为广泛性线粒体肿胀、扩张、泡样变，停药第五天病变显著重于停药第一天；两药相比，阿霉素脂质体对心肌的损害轻于阿霉素.
2.4 阿霉素脂质体抗肿瘤作用
按照全国肿化疗会议制定的抗癌药物体内药效试验规程的要求进行.每次实验均设下列各组：生理盐水对照组，脂质体对照组，阿霉素脂质体3个剂量组，阿霉素3个剂量组.
2.4.1 阿霉素脂质体对S180的影响
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在无菌条件下取接种后约7天，肿瘤生长旺盛的瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，消毒操作部位皮肤，选择无环死右液化的癌组织，按1∶4加无菌生理盐水，用组织均浆器制成瘤细胞悬液，于右前肢腋下皮下接种0.2 mL/只，随种后24 h随机分组，每组10只(均为雌性)，每组小鼠的平均体重相差不超过1 g,并开始给药，采用尾静脉注射0.2 mL脂质体溶液，在首次给药后第8天处死动物，剥离肿瘤，称取瘤重、体重，按下列公式计算肿瘤抑制率.肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%
实验数据采用T检验进行统计学处理，结果见表2.从表2可以看出：静脉给予0.5、1、2 mg/kg阿霉素脂质体对S180均有明显的抑制作用，强于同剂量阿霉素，并且随剂量加大其抑瘤作用增强.
2.4.2 阿霉素脂质体对U14的影响
方法同“2.4.1”项.不同处是在首次给药后第10于处死动物，计算抑制率.结果见表2.可以看出：静脉给予阿霉素脂质体对U14呈剂量相关性抑制，其抑瘤作用强于同剂量阿霉素.
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Tab.2 Inhibitory activity of Dox-lip of Dox to S180、U14、P388 Tumor
Drug
Dose/
mg.kg-1
Num of animals
initial end
Body weight/g
initial end
Tumor weight/g
, 百拇医药
X±SD
Inhibitory rate/
%
S180
NS
10
10
21.0
23.6
1.50±0.62
Lip
10
10
, http://www.100md.com
21.0
24.8
1.66±0.54
-10.7
Dox-Lip
0.5
10
10
21.0
21.5
1.02±0.48
32.0
Dox-Lip
, 百拇医药
1.0
10
10
21.0
21.3
0.49±0.14
67.3
Dox-Lip
2.0
10
10
21.0
21.8
, 百拇医药
0.46±0.17
69.3
Dox
0.5
10
10
21.0
22.5
1.40±0.33
6.7
Dox
1.0
10
, 百拇医药
10
21.0
22.6
1.28±0.69
14.7
Dox
2.0
10
10
21.0
22.4
0.72±0.35
52.0
, http://www.100md.com
U14
NS
10
10
21.0
20.6
2.94±0.40
Lip
10
10
21.0
20.2
2.91±0.38
, http://www.100md.com
1.0
Dox-Lip
0.5
10
10
21.0
22.0
2.73±0.66
7.1
Dox-Lip
1.0
10
10
, http://www.100md.com
21.0
22.3
1.71±0.43
41.8
Dox-Lip
2.0
10
10
21.0
22.7
0.48±0.19
83.7
Dox
, http://www.100md.com
0.5
10
10
21.0
20.8
2.81±0.42
4.4
Dox
1.0
10
10
21.0
21.6
, 百拇医药
2.44±0.61
17.0
Dox
2.0
10
10
21.0
22.1
1.42±0.39
52.0
Days of live/X±SD
Life delay rate/
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%
P388
NS
10
10
12.2±1.4
Lip
10
10
12.0±1.3
-1.6
Dox-Lip
0.13
, 百拇医药
10
10
19.3±2.8
58.2
Dox-Lip
0.25
10
10
25.9±2.1
112.3
Dox-Lip
0.50
10
, 百拇医药
10
22.8±2.4
86.9
Dox
0.13
10
10
17.8±3.6
45.9
Dox
0.25
10
10
, http://www.100md.com
25.0±2.3
104.9
Dox
0.50
10
10
20.5±2.5
68.0
2.4.3 阿霉素脂质体对P388的影响
取接种于DBA/2小鼠后约7天健康较好的动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤，抽取腹水，配成瘤细胞悬液，活细胞数为106/mL腹腔注射于DBA/2小鼠，每只小鼠注射0.1 mL(含P388细胞105个)，每批实验均用雌性小鼠，于接种后24 h将动物按体重分组，每组10只(第2批实验每组12只)，并开始给药，采用尾静脉注射给药，每天一次，连续3天，容积均为0.2 mL/20 g，对照组分别静脉注0.2 mL生理盐水，脂质体对照组静脉注0.2 mL脂质体溶液，记录死亡天数，按下列公式计算生命延长率.生命延长率=(给药组平均生存天数-对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数×100
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结果见表2.从表2可以看出：静脉给予0.13、0.25、0.5 mg/kg阿霉素脂质体对P388均有明显的抑制作用，其抑瘤作用和同剂量阿霉素相当.
3 讨论
自1988年以来，作者在总结国内外大量文献基础上〔6～11〕，对比研究了多种制备方法，分别以冻干前和冻干后的阿霉素包封率、稳定性和脂质体颗粒大小为指标进行考查，确定了最佳制备工艺.磷脂与胆固醇、维生素E的量和比例以及溶媒的选择对冻干前包封率影响较大，冻干赋形剂的量与比例如乳糖、甘露醇、海藻糖对冻干后的包封率有很大影响.胆固醇的加入，降低了脂质体磷脂膜的流动性，使包封药物不易渗漏出去，即增加了膜稳定性.维生素E的加入，是为了阻滞磷脂和胆固醇的氧化，从而增加脂质体的稳定性〔12〕.
对于抗肿瘤药物，决定性的评判标准就是低毒、高效，一般的抗肿瘤药物，都具有极强的抑瘤活性，降低药物毒性，则显得尤为重要.作者对制得的冻干阿霉素脂质体的毒性及抗癌活性与游离阿霉素进行了比较研究，两药的LD50经U-检验比较有非常显著差异(P<0.01)，表明阿霉素脂质体急性毒性明显小于阿霉素；心脏毒性实验证明：阿霉素脂质体对心脏线粒体有轻度的损伤，停药时间延长逐步恢复；而阿霉素对心肌线粒体有严重损伤，对肌原纤维亦有一定程度的损伤，而且停药时间延长没有减轻，抗肿瘤实验表明：阿霉素脂质体对S188、U14、P388均有明显的抑制作用，其作用强于等剂量的阿霉素.
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这一结果为冻干阿霉素脂质体进入临床验证提供了可喜依据.
致谢 天津药物研究院药理二室对研究结予支持和帮助，特此致谢.
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收稿日期:1998-02-01, 百拇医药