补益中药调整应激模型动物免疫细胞受抑及其可能机制
作者：钱瑞琴 孟勇
单位：钱瑞琴(北京医科大学 中西医结合研究室，北京 100083)；孟勇(北京医科大学 中西医结合研究室，北京 100083)
关键词：应激；免疫细胞增殖；补益中药
中国中药杂志000315 摘 要：目的：观察补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。方法：建立小鼠应激模型。观察菟丝子、川断、女贞子、枸杞子等补益中药对应激小鼠免疫细胞增殖过程中胞浆内Ca2+浓度、细胞膜流动性、IL-2，IL-2R以及细胞周期的影响。结果：补益类中药均可增强应激小鼠脾淋巴细胞的增殖功能；降低胞浆内Ca2+浓度，恢复细胞膜的流动性，增强IL-2的活性、提高IL-2R阳性细胞数，与应激组比较有显著性差异(P<0.01)。而四药合用的结果更佳，可促进细胞进入DNA合成期，减少细胞滞留在G。/G1期(P<0.01)，接近正常对照组水平。结论：补益类中药可调整应激小鼠脾淋巴细胞的增殖功能，缓解应激对机体的不利反应。
, http://www.100md.com
Modulation of Tonic Herbs on the Immune Cell Inhibition in
Stressed Model Animal and Its Possible Mechanism
QIAN Rui-qin,MENG Yong
(Department of Integration of Chinese and Western Medicine,Beijing Medical University,Beijing 100083，China)
Abstract：Objective:To observe the effect of tonic herbs on the immune cell proliferation in stressed mice.Methods:A model of stressed mice was built to observe the effect of such tonic herbs as Tusizi,Chuanduan;Nüzhenzi, Gouqizi on the calcium concentration in cytoplasm in the process of immune cell reproduction,as well as on the membrane fluidity of splenetic lymphocytes,IL-2,IL-2R and cell period.Results:The tonic herbs could improve the proliferation ability of spleen lymphocyte in the stressed mice,reduce the calcium concentration,and recover the fluidity of cell membrane.They could also improve the activity of IL-2 and increase the amount of IL-2R cell(P<0.01).The combination of the four tonic herbs proved more effective, facilitating the cell into DNA synthetic period and reducing the retentionperiod in G0/G1(P<0.01).Conclusion:Tonic herbs can modulate the reproductive function of the spleen lymphocyte and relieve the unfavorable response of the stress on the organism.
, 百拇医药
Key words：stress; reproduction immune cell; tonic herbs▲
持续性应激可使机体免疫功能紊乱，并诱发和加重机体多种疾病的发生，如感染性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤等[1]。因此，缓解、降低应激的不利反应，对临床多种疾病的治疗有积极的意义。祖国医学对持续性应激(七情、六淫)的临床治疗效果非常显著，且多数补益中药均有免疫增强作用，为此，本文用补益中药及其复方观察对应激小鼠脾淋巴细胞受抑的影响及其调整机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 6～8周龄的BALB/c雄性小鼠，由本校医学动物部提供，将动物随机分为对照组、应激模型组、给药组。
1.1.2 束缚性应激动物模型[2] 将小鼠装入自制圆柱形小筒，后肢固定，禁食水，室温下24 h过夜。
, 百拇医药
1.1.3 中药 菟丝子、川断、女贞子、枸杞子等药购自北京医科大学第三临床医院，并组成不同复方：菟丝子、川断组(简称丝断)；女贞子、枸杞子组(简称贞杞)；菟丝子、川断、女贞子、枸杞子组(简称合剂)。以上复方按1∶1比例，制成100%水煎剂，4℃保存备用。灌胃给药，每只小鼠每日0.4 ml(约含0.4 g生药)，应激小鼠在应激前连续给药1周，对照组灌服等量自来水。
1.1.4 主要试剂 RPMI-1640，MTT，DPH等为Sigma公司产品。Fura-2/AM为中国医学科学院药物研究所产品。
1.2 检测方法
1.2.1 小鼠脾淋巴细胞的增殖反应 参见文献[3]方法。
1.2.2 细胞胞浆游离钙的测定 参见文献[4]方法。
1.2.3 淋巴细胞膜流动性测定 参见文献[5]方法。
, 百拇医药
1.2.4 白细胞介素-2(IL-2)测定 参见文献[3]方法。
1.2.5 白细胞介素-2受体(IL-2R)及细胞增殖周期测定 参见文献[6]方法。
1.3 统计学方法 试验数据采用SPSS软件t检验法。
2 结果
2.1 补益中药对应激后小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 从表1可见应激后小鼠淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应低下，与对照组比较明显下降(P<0.01)，灌服中药后均可提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，其增加百分率分别是18%，21%，39%。丝断组与贞杞组两组之间无明显差异，合剂组有增强的趋势。从表1还可见应激后小鼠对LPS诱导的脾淋巴细胞增殖无明显影响，提示应激可抑制T淋巴细胞的增殖，而对B淋巴细胞的增殖则无明显影响。
表1 补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 组别
, 百拇医药
刺激指数
ConA
LPS
对照组
3.98±0.14
2.58±0.16
应激组
2.81±0.311)
2.08±0.21
丝断组
3.60±0.052)
2.14±0.10
, 百拇医药
贞杞组
3.74±0.082)
2.38±0.19
合剂组
4.06±0.112)
2.31±0.21
注：①x±s ②n=6 1)与对照组比P<0.01 2)与应激组比P<0.01
2.2 补益中药对应激后小鼠脾淋巴细胞胞浆内钙离子的影响 从表2可见应激后小鼠脾淋巴细胞胞浆内Ca2+浓度与对照组比较增加36%(P<0.05)，灌服各药组均可降低细胞胞浆内Ca2+浓度，其中合剂组作用最好，接近正常对照组水平(P<0.05)。
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表2 补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞胞浆游离钙的影响 组别
1×105.ml-1脾细胞中Ca2+含量/nmol.L-1
对照组
68.64± 8.47
应激组
93.10±17.581)
丝断组
52.56± 9.172)
贞杞组
, 百拇医药
54.63±14.432)
合剂组
61.84±12.352)
注：①x±s ②n=6 1)与对照组比P<0.05 2)与应激组比P<0.01
2.3 补益中药对应激后小鼠脾淋巴细胞膜的流动性的影响 从表3可见应激后小鼠脾淋巴细胞膜的荧光偏振度(P)明显降低(P<0.01)，提示膜流动性增高，而灌服中药后均可使P值显著增高(P<0.05)，合剂组的P值接近正常对照组水平(P>0.05)。表明补益中药对细胞膜有保护作用。
表3 中药对应激后小鼠脾淋巴细胞膜流动性的影响 组别
荧光偏振度/P
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对照组
0.323±0.022
应激组
0.254±0.0401)
丝断组
0.302±0.0292)
贞杞组
0.296±0.0212)
合剂组
0.320±0.0252)
注：①x±s ②n=6 1)与对照组比P<0.01 2)与应激组比较P<0.05
, 百拇医药
2.4 合剂对应激后小鼠脾淋巴细胞增殖周期的影响 对照组、应激组、合剂组各组小鼠脾淋巴细胞在增殖过程中进入S期(DNA合成期)的细胞百分比分别为13.72±2.23，4.72±0.81及9.76±1.97。G2/M(DNA合成后期，有丝分裂)期分别为4.48±1.44，8.24±1.42及4.74±1.84。G0/G1(DNA合成准备期)分别为81.08±2.45，87.06±1.53及85.48±2.38。进入DNA合成期的细胞百分比，模型组明显低于正常对照组(P<0.05)，DNA合成后期及DNA合成准备期，模型组与对照组比较相对增多(P<0.05)。灌服中药后进入DNA合成期细胞增多，滞留在DNA合成后期及DNA合成准备期的细胞相对减少。
2.5 合剂组对应激后小鼠脾淋巴细胞IL-2活性、IL-2R阳性细胞的影响 对照组、模型组、合剂组脾淋巴细胞IL-2活性分别为8.62±0.21，4.81±0.29，6.53±0.36 U*ml-1。IL-2R阳性细胞分别为18.66±2.91，9.39±1.67及13.93±3.01。与对照组比较模型小鼠脾淋巴细胞合成的IL-2活性下降，IL-2R阳性细胞减少(P<0.01)，合剂组可促进脾淋巴细胞IL-2的合成(P<0.05)，增加IL-2R阳性细胞(P<0.01)。
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3 讨论
现代医学对应激的研究进展较深入，偏重于基础理论的探讨，但如何减少和缓解应激对机体的不利的影响，报道甚少。祖国医学根据“阴平阳秘，精神乃治”的整体治疗观点，对各种应激(七情、六淫)所致疾病的治疗，采用调整机体阴阳失调，多收到较好疗效。为更深入、系统探讨中医药缓解应激、提高免疫功能的作用机理，本文观察了补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞增殖过程中IL-2，IL-2R、细胞周期、胞浆内钙离子浓度、细胞膜流动性等的影响。本课题采用束缚性应激方法，表明应激后小鼠脾淋巴细胞增殖能力下降，胞浆内钙离子浓度增加、IL-2产生的活性降低、IL-2R阳性细胞表达减少、细胞膜流动性增强，细胞增殖周期中进入S期细胞减少，滞留于G2/M与G0/G1期的细胞相对增多。灌服菟丝子、川断及女贞子、枸杞子及四药合剂后可使上述状况改善，均可恢复或接近正常对照组水平。
据报道菟丝子、川断、女贞子、枸杞子各药，对机体造血系统、细胞与体液免疫功能有调整功能，并有较广泛的药理作用[7]。为此本试验选用这两组药。试验结果表明补阳类药菟丝子、川断与补阴类药女贞子、枸杞子两组药均可改善对应激小鼠免疫细胞的影响，而两组之间无明显差异，但四药合剂的作用较强，与正常组水平接近。提示中医在组方治疗应激所致疾病时，补阴药与补阳药相互配伍，可以提高疗效。结合本试验，表明上述补益中药对应激小鼠免疫细胞的调整作用机理是多环节，初步认为可对抗应激后小鼠淋巴细胞细胞胞浆内Ca2+亢进，恢复细胞膜流动性，增加白细胞介素-2受体阳性细胞，提高白细胞介素-2合成，调整细胞增殖周期，从而可缓解和降低应激对机体的不利反应。但应激对免疫细胞的影响是多方面的，本课题正在作进一步的研究。
, 百拇医药
基金项目：卫生部科研基金资助课题(94-1-227)
参考文献：
[1]许贤豪.神经免疫学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.81.
[2]查宏斌，徐红，翟清竹，等.束缚应激大鼠血清淋巴细胞转化抑制因子的研究.生理学报，1991，43(1)：31.
[3]周道洪.测定淋巴细胞转化和IL-2活性的新方法——MTT比色分析法.中国免疫学杂志，1986，2(1)：39.
[4]张均田，李锡明，石成璋，等.用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方法.中国药学杂志，1991，26(11)：655.
[5]陈泽涛，顾振东.中药对淋巴细胞型白血病小鼠细胞膜流动性的影响.中西医结合杂志，1991，11(1)：39.
[6]宋平根，李素文.流式细胞的原理和应用.北京：北京师范大学出版社，1992.82.
[7]李广勋.中药药理毒理和临床.天津：天津科技出版公司，1992.282，368，389，392.
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药
单位：钱瑞琴(北京医科大学 中西医结合研究室，北京 100083)；孟勇(北京医科大学 中西医结合研究室，北京 100083)
关键词：应激；免疫细胞增殖；补益中药
中国中药杂志000315 摘 要：目的：观察补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。方法：建立小鼠应激模型。观察菟丝子、川断、女贞子、枸杞子等补益中药对应激小鼠免疫细胞增殖过程中胞浆内Ca2+浓度、细胞膜流动性、IL-2，IL-2R以及细胞周期的影响。结果：补益类中药均可增强应激小鼠脾淋巴细胞的增殖功能；降低胞浆内Ca2+浓度，恢复细胞膜的流动性，增强IL-2的活性、提高IL-2R阳性细胞数，与应激组比较有显著性差异(P<0.01)。而四药合用的结果更佳，可促进细胞进入DNA合成期，减少细胞滞留在G。/G1期(P<0.01)，接近正常对照组水平。结论：补益类中药可调整应激小鼠脾淋巴细胞的增殖功能，缓解应激对机体的不利反应。
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Modulation of Tonic Herbs on the Immune Cell Inhibition in
Stressed Model Animal and Its Possible Mechanism
QIAN Rui-qin,MENG Yong
(Department of Integration of Chinese and Western Medicine,Beijing Medical University,Beijing 100083，China)
Abstract：Objective:To observe the effect of tonic herbs on the immune cell proliferation in stressed mice.Methods:A model of stressed mice was built to observe the effect of such tonic herbs as Tusizi,Chuanduan;Nüzhenzi, Gouqizi on the calcium concentration in cytoplasm in the process of immune cell reproduction,as well as on the membrane fluidity of splenetic lymphocytes,IL-2,IL-2R and cell period.Results:The tonic herbs could improve the proliferation ability of spleen lymphocyte in the stressed mice,reduce the calcium concentration,and recover the fluidity of cell membrane.They could also improve the activity of IL-2 and increase the amount of IL-2R cell(P<0.01).The combination of the four tonic herbs proved more effective, facilitating the cell into DNA synthetic period and reducing the retentionperiod in G0/G1(P<0.01).Conclusion:Tonic herbs can modulate the reproductive function of the spleen lymphocyte and relieve the unfavorable response of the stress on the organism.
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Key words：stress; reproduction immune cell; tonic herbs▲
持续性应激可使机体免疫功能紊乱，并诱发和加重机体多种疾病的发生，如感染性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤等[1]。因此，缓解、降低应激的不利反应，对临床多种疾病的治疗有积极的意义。祖国医学对持续性应激(七情、六淫)的临床治疗效果非常显著，且多数补益中药均有免疫增强作用，为此，本文用补益中药及其复方观察对应激小鼠脾淋巴细胞受抑的影响及其调整机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 6～8周龄的BALB/c雄性小鼠，由本校医学动物部提供，将动物随机分为对照组、应激模型组、给药组。
1.1.2 束缚性应激动物模型[2] 将小鼠装入自制圆柱形小筒，后肢固定，禁食水，室温下24 h过夜。
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1.1.3 中药 菟丝子、川断、女贞子、枸杞子等药购自北京医科大学第三临床医院，并组成不同复方：菟丝子、川断组(简称丝断)；女贞子、枸杞子组(简称贞杞)；菟丝子、川断、女贞子、枸杞子组(简称合剂)。以上复方按1∶1比例，制成100%水煎剂，4℃保存备用。灌胃给药，每只小鼠每日0.4 ml(约含0.4 g生药)，应激小鼠在应激前连续给药1周，对照组灌服等量自来水。
1.1.4 主要试剂 RPMI-1640，MTT，DPH等为Sigma公司产品。Fura-2/AM为中国医学科学院药物研究所产品。
1.2 检测方法
1.2.1 小鼠脾淋巴细胞的增殖反应 参见文献[3]方法。
1.2.2 细胞胞浆游离钙的测定 参见文献[4]方法。
1.2.3 淋巴细胞膜流动性测定 参见文献[5]方法。
, 百拇医药
1.2.4 白细胞介素-2(IL-2)测定 参见文献[3]方法。
1.2.5 白细胞介素-2受体(IL-2R)及细胞增殖周期测定 参见文献[6]方法。
1.3 统计学方法 试验数据采用SPSS软件t检验法。
2 结果
2.1 补益中药对应激后小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 从表1可见应激后小鼠淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应低下，与对照组比较明显下降(P<0.01)，灌服中药后均可提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，其增加百分率分别是18%，21%，39%。丝断组与贞杞组两组之间无明显差异，合剂组有增强的趋势。从表1还可见应激后小鼠对LPS诱导的脾淋巴细胞增殖无明显影响，提示应激可抑制T淋巴细胞的增殖，而对B淋巴细胞的增殖则无明显影响。
表1 补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 组别
, 百拇医药
刺激指数
ConA
LPS
对照组
3.98±0.14
2.58±0.16
应激组
2.81±0.311)
2.08±0.21
丝断组
3.60±0.052)
2.14±0.10
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贞杞组
3.74±0.082)
2.38±0.19
合剂组
4.06±0.112)
2.31±0.21
注：①x±s ②n=6 1)与对照组比P<0.01 2)与应激组比P<0.01
2.2 补益中药对应激后小鼠脾淋巴细胞胞浆内钙离子的影响 从表2可见应激后小鼠脾淋巴细胞胞浆内Ca2+浓度与对照组比较增加36%(P<0.05)，灌服各药组均可降低细胞胞浆内Ca2+浓度，其中合剂组作用最好，接近正常对照组水平(P<0.05)。
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表2 补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞胞浆游离钙的影响 组别
1×105.ml-1脾细胞中Ca2+含量/nmol.L-1
对照组
68.64± 8.47
应激组
93.10±17.581)
丝断组
52.56± 9.172)
贞杞组
, 百拇医药
54.63±14.432)
合剂组
61.84±12.352)
注：①x±s ②n=6 1)与对照组比P<0.05 2)与应激组比P<0.01
2.3 补益中药对应激后小鼠脾淋巴细胞膜的流动性的影响 从表3可见应激后小鼠脾淋巴细胞膜的荧光偏振度(P)明显降低(P<0.01)，提示膜流动性增高，而灌服中药后均可使P值显著增高(P<0.05)，合剂组的P值接近正常对照组水平(P>0.05)。表明补益中药对细胞膜有保护作用。
表3 中药对应激后小鼠脾淋巴细胞膜流动性的影响 组别
荧光偏振度/P
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对照组
0.323±0.022
应激组
0.254±0.0401)
丝断组
0.302±0.0292)
贞杞组
0.296±0.0212)
合剂组
0.320±0.0252)
注：①x±s ②n=6 1)与对照组比P<0.01 2)与应激组比较P<0.05
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2.4 合剂对应激后小鼠脾淋巴细胞增殖周期的影响 对照组、应激组、合剂组各组小鼠脾淋巴细胞在增殖过程中进入S期(DNA合成期)的细胞百分比分别为13.72±2.23，4.72±0.81及9.76±1.97。G2/M(DNA合成后期，有丝分裂)期分别为4.48±1.44，8.24±1.42及4.74±1.84。G0/G1(DNA合成准备期)分别为81.08±2.45，87.06±1.53及85.48±2.38。进入DNA合成期的细胞百分比，模型组明显低于正常对照组(P<0.05)，DNA合成后期及DNA合成准备期，模型组与对照组比较相对增多(P<0.05)。灌服中药后进入DNA合成期细胞增多，滞留在DNA合成后期及DNA合成准备期的细胞相对减少。
2.5 合剂组对应激后小鼠脾淋巴细胞IL-2活性、IL-2R阳性细胞的影响 对照组、模型组、合剂组脾淋巴细胞IL-2活性分别为8.62±0.21，4.81±0.29，6.53±0.36 U*ml-1。IL-2R阳性细胞分别为18.66±2.91，9.39±1.67及13.93±3.01。与对照组比较模型小鼠脾淋巴细胞合成的IL-2活性下降，IL-2R阳性细胞减少(P<0.01)，合剂组可促进脾淋巴细胞IL-2的合成(P<0.05)，增加IL-2R阳性细胞(P<0.01)。
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3 讨论
现代医学对应激的研究进展较深入，偏重于基础理论的探讨，但如何减少和缓解应激对机体的不利的影响，报道甚少。祖国医学根据“阴平阳秘，精神乃治”的整体治疗观点，对各种应激(七情、六淫)所致疾病的治疗，采用调整机体阴阳失调，多收到较好疗效。为更深入、系统探讨中医药缓解应激、提高免疫功能的作用机理，本文观察了补益中药对应激小鼠脾淋巴细胞增殖过程中IL-2，IL-2R、细胞周期、胞浆内钙离子浓度、细胞膜流动性等的影响。本课题采用束缚性应激方法，表明应激后小鼠脾淋巴细胞增殖能力下降，胞浆内钙离子浓度增加、IL-2产生的活性降低、IL-2R阳性细胞表达减少、细胞膜流动性增强，细胞增殖周期中进入S期细胞减少，滞留于G2/M与G0/G1期的细胞相对增多。灌服菟丝子、川断及女贞子、枸杞子及四药合剂后可使上述状况改善，均可恢复或接近正常对照组水平。
据报道菟丝子、川断、女贞子、枸杞子各药，对机体造血系统、细胞与体液免疫功能有调整功能，并有较广泛的药理作用[7]。为此本试验选用这两组药。试验结果表明补阳类药菟丝子、川断与补阴类药女贞子、枸杞子两组药均可改善对应激小鼠免疫细胞的影响，而两组之间无明显差异，但四药合剂的作用较强，与正常组水平接近。提示中医在组方治疗应激所致疾病时，补阴药与补阳药相互配伍，可以提高疗效。结合本试验，表明上述补益中药对应激小鼠免疫细胞的调整作用机理是多环节，初步认为可对抗应激后小鼠淋巴细胞细胞胞浆内Ca2+亢进，恢复细胞膜流动性，增加白细胞介素-2受体阳性细胞，提高白细胞介素-2合成，调整细胞增殖周期，从而可缓解和降低应激对机体的不利反应。但应激对免疫细胞的影响是多方面的，本课题正在作进一步的研究。
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基金项目：卫生部科研基金资助课题(94-1-227)
参考文献：
[1]许贤豪.神经免疫学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.81.
[2]查宏斌，徐红，翟清竹，等.束缚应激大鼠血清淋巴细胞转化抑制因子的研究.生理学报，1991，43(1)：31.
[3]周道洪.测定淋巴细胞转化和IL-2活性的新方法——MTT比色分析法.中国免疫学杂志，1986，2(1)：39.
[4]张均田，李锡明，石成璋，等.用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方法.中国药学杂志，1991，26(11)：655.
[5]陈泽涛，顾振东.中药对淋巴细胞型白血病小鼠细胞膜流动性的影响.中西医结合杂志，1991，11(1)：39.
[6]宋平根，李素文.流式细胞的原理和应用.北京：北京师范大学出版社，1992.82.
[7]李广勋.中药药理毒理和临床.天津：天津科技出版公司，1992.282，368，389，392.
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药