NOS抑制剂对局灶性缺血再灌流大鼠脑神经细胞凋亡的影响研究
作者：吕晓红 李广生 饶明俐
单位：吕晓红 饶明俐(白求恩医科大学第一临床学院神经内科130021)；李广生(白求恩医科大学地方病研究所)
关键词：NOS抑制剂；神经细胞凋亡；缺血再灌流
临床神经病学杂志000504 【摘要】 目的 研究一氧化氮合酶(NOS)抑制剂在局灶性脑缺血再灌流过程中对神经细胞的作用机理，特 别是NOS抑制剂(NNLA)与细胞凋亡的关系。方法 利用末端标记法，测定NN LA干预 后局灶性脑缺血鼠脑组织中神经细胞的凋亡情况。结果 大、小剂量的NOS 抑制剂分别具有增加或减少阳性凋亡细胞出现率的作用。结论 给予不同剂量的NOS抑制剂与单纯缺血再灌流相比，对脑神经细胞的凋亡出现率有不同的影 响。
Effect of inhibitor of nitric oxide synthase on neuronal apoptosis in the focal cerebral ischemic reperfusion in rats
, http://www.100md.com
Lü Xiaohong Li Guangsheng Rao M ingli
(Department of Neurology,the First Clinical College of Norman Bethune Univ ersity, Changchun 130021)
【Abstract】 Objective To study the mechanism of neurocyte on inhibitor of nitric oxi-de synthase (NOS) in the focal cerebral ischemic reperf us ion and the relationship between inhibitor of NOS and apoptosis especially.Methods Using terminal de oxyribo-nucleotide transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL ) method,the changes of apoptosis cells in the rat's brain tissue on the focal cerebral ischemic reperfusion were determined after NNLA intervention.Re sults Big dose of inhibitor of NOS could increase positive neuronal apoptosis.Small d ose of inhibitor of NOS could decrease positive neuronal apoptosis.Concl usion NOS inhibitors of different doses were administered as compared w ith cerebral ischemic reperfusion,there was different effect in the prevalence o f brain ne uronal apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Inhibitor of nitric oxide synthase Neuronal apop tosis Cerebral ischemic reperfusion
细胞凋亡异常增加，可能是缺血性脑损伤的重要发病机理。脑缺血后细胞会产生凋亡并参与 缺血性损伤；脑缺血后细胞产生的一些生理、生化改变如细胞内钙增加、一氧化氮(NO)的产 生、脂质过氧化反应增强等，既是细胞产生凋亡的因素，同时在凋亡的形成中也具有重要作 用。为此，我们给缺血再灌流大鼠应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，以观察其对细胞凋亡的 影响。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重200～250 g，鼠龄为3～4个月，由本校实验 动物部提供。分为正常对照组(5只)、假手术对照组(5只)、手术对照组(10只)、小剂 量NOS抑制剂干预组(10只)、大剂量NOS抑制剂干预组(10只)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 制作大鼠脑局灶缺血再灌流模型 选用Koizumi[1]所采用的从颈外动脉经 颈内动脉导入尼龙栓线法制作大脑局灶缺血再灌流模型。该模型不开颅、无需麻醉即可再灌 流。
1.2.2 实验方法 (1)手术对照组(实验1组)：缺血3小时，再灌注1天，处死。(2)小 剂量NOS抑制剂干预组(实验2组)：术后30分钟给予NOS抑制剂(NNLA) 5 mg/kg，腹腔注射 ，缺血3小时，再灌注20小时时再次给予同样剂量的NNLA腹腔注射1次，于再灌注24小时时处 死。(3)大剂量NOS抑制剂干预组(实验3组)：术后30分钟给予NOS抑制剂：NNLA 30 mg/k g，腹腔注射，缺血3小时，再灌注20小时时再次给予同样剂量的NNLA腹腔注射1次，于再灌 注24小时时处死。(4)正常对照组：常规饲养。(5)假手术对照组：常规制作局灶缺血模 型，在手术操作过程中，不将栓线导入大鼠脑动脉系统中，余同手术组。饲养1天后处死。
, 百拇医药
1.2.3 测定方法 末端脱氧核糖核酸介导生物素化脱氧尿嘧啶缺口末端标记(TUNEL)法， 大 鼠直接断头取脑，左右半球分别置于4%多聚甲醛中固定24小时，常规石腊包埋，备用。石腊 切片常规脱蜡，蛋白酶K消化；加样、反应、显色等步骤严格桉试剂盒说明书进行；反应结 束后，常规甲基绿复染；常规封片、镜检并照相。
2 结 果
各组大鼠缺血再灌流后大脑阳性凋亡细胞数比较 见表1。
表1 各组大鼠阳性凋亡细胞数比较(
±s) 组 别
左半球
右半球
实验1组
, 百拇医药
47.45±3.00△▲
11.36±1.44
实验2组
37.15±2.98△*▲
10.42±1.41
实验3组
64.93±3.26△*▲
12.12±1.25
正常对照组
9.61±0.86
8.90±0.82
, 百拇医药
假手术对照组
11.36±1.37
11.82±1.74
与正常对照组相比△P<0.01，实验2、3组 的左半球分别与实验1组的左半球相比*P<0.01，同组左、右半球相比▲P<0.0 1
实验1组左侧半球(手术侧)大脑皮层区偶见DAB着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩，核 周空泡形成。海马区约半数细胞呈DAB着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩。实验1组右侧半球(作为对照)海马区未见DAB着染的阳性凋亡细胞。大脑皮层偶见DAB 着染的阳性凋亡细胞。实验3组左侧半球：大脑皮层区大部分细胞呈DAB着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩，部分 细胞浆也因核DNA碎片的逸出呈阳性着染。海马区绝大部分细胞呈DAB着染的阳性凋亡细胞 ，细胞核固缩，染色质形态各异，呈半月形、哑铃形等。实验2组左侧半球：大脑皮质区几乎未见DAB着染的阳性凋亡细胞。海马区部分细胞呈DAB 着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩。总之，缺血再灌流期间脑组织中NO含量的变化可通过影响阳性凋亡细胞的出现率而影响梗死 区的病变程度，或认为其改变本身就是NO直接影响的结果。3 讨 论
, 百拇医药
3.1 NOS抑制剂(NNLA)对局灶性脑缺血再灌流中细胞凋亡的影响 NO作为多功能生物效应 分子不仅参与细胞的各种生理活动，而且在许多病理过程中也发挥了重要作用。本研究结果 表明，NO对于局灶性脑缺血再灌流病理过程的影响与我们以前所作的NO对前脑缺血再灌流模 型病理改变影响的结果十分相似，即NNLA在缺血再灌流过程中具有两种截然不同的作用：( 1)小剂量NNLA的神经细胞保护作用[2，3]：通过抑制缺血期及再灌流期过量产生 的NO，而逆转其对神经细胞的毒性作用。但在局灶性缺血再灌流模型中这种保护作用似乎没 有在前脑缺血再灌流过程中明显。(2)大剂量NNLA的神经毒性作用[4，5]：由于 过量抑制了NO的合成，使其不能满足生理需要量，致使血管过度收缩，脑血流量下降，增加 了神经细胞对缺血缺氧的敏感性，导致病变在原基础上的加重。脑缺血引起的脑损伤是由于 血流阻断，组织缺氧及其后的再灌流再供氧所致，已有许多实验证明，这种损伤大多发生于 再灌流期，而且是由活性氧自由基(ROS):包括O-2、OH-、H2O-2、NO-、 NO-2、NO-3等介导的。损伤的严重程度取决于许多因素，其中之一是缺血缺氧时 间。如果组织缺血缺氧时间不足以使组织损伤成为不可逆时，通过再灌流重新供给组织血液 和营养，可使许多受损的神经细胞得以恢复，在这种情况下，再灌流是有益的。但是超过缺 血时限的血液再灌流不能促进脑细胞的康复，却可激化自由基连锁反应，导致代谢异常，引 起缺血损害进一步加重。NOS作为内源性ROS产生系统之一，在脑缺血及再灌流期NOS mRNA均 有表达，并伴有NO含量的升高，而在此过程中，可有神经细胞程序性细胞死亡的发生。提示 NO作为ROS之一(外源性刺激条件)，可能通过激活某种内源性凋亡启动基因参与并调节局 灶性脑缺血再灌流过程中的细胞凋亡。
, 百拇医药
3.2 TUNEL在局灶性脑缺血再灌流模型中检测凋亡细胞的意义 TUNEL是一种可进行原位检 测的分子生物免疫组织化学方法，它能特异地与凋亡细胞中断裂DNA的3’-羟基末端结合 ，经DAB显色可使凋亡细胞呈阳性着染，有很强的特异性[6]。因坏死神经细胞也 有DNA的崩解，可呈阳性反应，但它们伴有核破碎，在形态上与凋亡细胞明显不同，故在光 镜下容易区分。应用这一方法，可在组织切片上检出光镜下未发生形态改变的早期凋亡细胞 并进行原位定量、定性分析。我们的测定结果显示：该方法应用于局灶性脑缺血再灌流模型 中可以对缺血区的凋亡细胞进行定性、定量及定位研究，并具有敏感性高、出现早及利于形 态学观察等特点，可以弥补琼脂糖凝胶电泳检测方法的不足。但特异性略差，特别是当组织 切片经酶消化处理过强或聚合酶浓度过高时，可出现微弱的背景染色。少量坏死细胞也可呈 阳性反应，在进行结果分析时需注意这一点。
参 考 文 献
1，Koizumi JY，Nakazawa T，Qoneda G.Experimental studies of ischemia brain edema:A new experimental model of cerebral embolism in rats which circulation can be in troduced in the ischemia area.Jpn J Stroke,1986,8:1
, http://www.100md.com
2，Hamada Y, Dayakawa T, Hattori H, et al.Inhibition of nitric oxide synthesis redu ces hypoxic-ischemic brain damage in the neonatal rat.Pediatr Res,1994,5:10
3，Dawson VL, Dawson TM, Bartley DA, et al.Mechanisms of nitric oxide mediated neur otoxicity in primary brain cultures.J Neurosci,1993,13:2651
4，Kukuz JW, Prodo RJ, Dietrich WD, et al. The effect of nitric oxide synthase inh ibition infarct volume after reversible focal cerebral ischemia in conscious rat s.Stroke,1993,24:2023
5，Yamamoto S, Golanov EV, Berger SB, et al.Inhibition of nitric oxide synthesis in creases focal ischemic infarction in rat.J Cereb Blood Flow Metab,1992,12:717
6，牛建昭,小路武彦,中根一穗.用原位缺口翻译法比较两种细胞死亡的DNA状态.解剖学报,1994 ,25:398
收稿1999-07-04
修回2000-03-23, http://www.100md.com
单位：吕晓红 饶明俐(白求恩医科大学第一临床学院神经内科130021)；李广生(白求恩医科大学地方病研究所)
关键词：NOS抑制剂；神经细胞凋亡；缺血再灌流
临床神经病学杂志000504 【摘要】 目的 研究一氧化氮合酶(NOS)抑制剂在局灶性脑缺血再灌流过程中对神经细胞的作用机理，特 别是NOS抑制剂(NNLA)与细胞凋亡的关系。方法 利用末端标记法，测定NN LA干预 后局灶性脑缺血鼠脑组织中神经细胞的凋亡情况。结果 大、小剂量的NOS 抑制剂分别具有增加或减少阳性凋亡细胞出现率的作用。结论 给予不同剂量的NOS抑制剂与单纯缺血再灌流相比，对脑神经细胞的凋亡出现率有不同的影 响。
Effect of inhibitor of nitric oxide synthase on neuronal apoptosis in the focal cerebral ischemic reperfusion in rats
, http://www.100md.com
Lü Xiaohong Li Guangsheng Rao M ingli
(Department of Neurology,the First Clinical College of Norman Bethune Univ ersity, Changchun 130021)
【Abstract】 Objective To study the mechanism of neurocyte on inhibitor of nitric oxi-de synthase (NOS) in the focal cerebral ischemic reperf us ion and the relationship between inhibitor of NOS and apoptosis especially.Methods Using terminal de oxyribo-nucleotide transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL ) method,the changes of apoptosis cells in the rat's brain tissue on the focal cerebral ischemic reperfusion were determined after NNLA intervention.Re sults Big dose of inhibitor of NOS could increase positive neuronal apoptosis.Small d ose of inhibitor of NOS could decrease positive neuronal apoptosis.Concl usion NOS inhibitors of different doses were administered as compared w ith cerebral ischemic reperfusion,there was different effect in the prevalence o f brain ne uronal apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Inhibitor of nitric oxide synthase Neuronal apop tosis Cerebral ischemic reperfusion
细胞凋亡异常增加，可能是缺血性脑损伤的重要发病机理。脑缺血后细胞会产生凋亡并参与 缺血性损伤；脑缺血后细胞产生的一些生理、生化改变如细胞内钙增加、一氧化氮(NO)的产 生、脂质过氧化反应增强等，既是细胞产生凋亡的因素，同时在凋亡的形成中也具有重要作 用。为此，我们给缺血再灌流大鼠应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，以观察其对细胞凋亡的 影响。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重200～250 g，鼠龄为3～4个月，由本校实验 动物部提供。分为正常对照组(5只)、假手术对照组(5只)、手术对照组(10只)、小剂 量NOS抑制剂干预组(10只)、大剂量NOS抑制剂干预组(10只)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 制作大鼠脑局灶缺血再灌流模型 选用Koizumi[1]所采用的从颈外动脉经 颈内动脉导入尼龙栓线法制作大脑局灶缺血再灌流模型。该模型不开颅、无需麻醉即可再灌 流。
1.2.2 实验方法 (1)手术对照组(实验1组)：缺血3小时，再灌注1天，处死。(2)小 剂量NOS抑制剂干预组(实验2组)：术后30分钟给予NOS抑制剂(NNLA) 5 mg/kg，腹腔注射 ，缺血3小时，再灌注20小时时再次给予同样剂量的NNLA腹腔注射1次，于再灌注24小时时处 死。(3)大剂量NOS抑制剂干预组(实验3组)：术后30分钟给予NOS抑制剂：NNLA 30 mg/k g，腹腔注射，缺血3小时，再灌注20小时时再次给予同样剂量的NNLA腹腔注射1次，于再灌 注24小时时处死。(4)正常对照组：常规饲养。(5)假手术对照组：常规制作局灶缺血模 型，在手术操作过程中，不将栓线导入大鼠脑动脉系统中，余同手术组。饲养1天后处死。
, 百拇医药
1.2.3 测定方法 末端脱氧核糖核酸介导生物素化脱氧尿嘧啶缺口末端标记(TUNEL)法， 大 鼠直接断头取脑，左右半球分别置于4%多聚甲醛中固定24小时，常规石腊包埋，备用。石腊 切片常规脱蜡，蛋白酶K消化；加样、反应、显色等步骤严格桉试剂盒说明书进行；反应结 束后，常规甲基绿复染；常规封片、镜检并照相。
2 结 果
各组大鼠缺血再灌流后大脑阳性凋亡细胞数比较 见表1。
表1 各组大鼠阳性凋亡细胞数比较(
±s) 组 别左半球
右半球
实验1组
, 百拇医药
47.45±3.00△▲
11.36±1.44
实验2组
37.15±2.98△*▲
10.42±1.41
实验3组
64.93±3.26△*▲
12.12±1.25
正常对照组
9.61±0.86
8.90±0.82
, 百拇医药
假手术对照组
11.36±1.37
11.82±1.74
与正常对照组相比△P<0.01，实验2、3组 的左半球分别与实验1组的左半球相比*P<0.01，同组左、右半球相比▲P<0.0 1
实验1组左侧半球(手术侧)大脑皮层区偶见DAB着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩，核 周空泡形成。海马区约半数细胞呈DAB着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩。实验1组右侧半球(作为对照)海马区未见DAB着染的阳性凋亡细胞。大脑皮层偶见DAB 着染的阳性凋亡细胞。实验3组左侧半球：大脑皮层区大部分细胞呈DAB着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩，部分 细胞浆也因核DNA碎片的逸出呈阳性着染。海马区绝大部分细胞呈DAB着染的阳性凋亡细胞 ，细胞核固缩，染色质形态各异，呈半月形、哑铃形等。实验2组左侧半球：大脑皮质区几乎未见DAB着染的阳性凋亡细胞。海马区部分细胞呈DAB 着染的阳性凋亡细胞，细胞核固缩。总之，缺血再灌流期间脑组织中NO含量的变化可通过影响阳性凋亡细胞的出现率而影响梗死 区的病变程度，或认为其改变本身就是NO直接影响的结果。3 讨 论
, 百拇医药
3.1 NOS抑制剂(NNLA)对局灶性脑缺血再灌流中细胞凋亡的影响 NO作为多功能生物效应 分子不仅参与细胞的各种生理活动，而且在许多病理过程中也发挥了重要作用。本研究结果 表明，NO对于局灶性脑缺血再灌流病理过程的影响与我们以前所作的NO对前脑缺血再灌流模 型病理改变影响的结果十分相似，即NNLA在缺血再灌流过程中具有两种截然不同的作用：( 1)小剂量NNLA的神经细胞保护作用[2，3]：通过抑制缺血期及再灌流期过量产生 的NO，而逆转其对神经细胞的毒性作用。但在局灶性缺血再灌流模型中这种保护作用似乎没 有在前脑缺血再灌流过程中明显。(2)大剂量NNLA的神经毒性作用[4，5]：由于 过量抑制了NO的合成，使其不能满足生理需要量，致使血管过度收缩，脑血流量下降，增加 了神经细胞对缺血缺氧的敏感性，导致病变在原基础上的加重。脑缺血引起的脑损伤是由于 血流阻断，组织缺氧及其后的再灌流再供氧所致，已有许多实验证明，这种损伤大多发生于 再灌流期，而且是由活性氧自由基(ROS):包括O-2、OH-、H2O-2、NO-、 NO-2、NO-3等介导的。损伤的严重程度取决于许多因素，其中之一是缺血缺氧时 间。如果组织缺血缺氧时间不足以使组织损伤成为不可逆时，通过再灌流重新供给组织血液 和营养，可使许多受损的神经细胞得以恢复，在这种情况下，再灌流是有益的。但是超过缺 血时限的血液再灌流不能促进脑细胞的康复，却可激化自由基连锁反应，导致代谢异常，引 起缺血损害进一步加重。NOS作为内源性ROS产生系统之一，在脑缺血及再灌流期NOS mRNA均 有表达，并伴有NO含量的升高，而在此过程中，可有神经细胞程序性细胞死亡的发生。提示 NO作为ROS之一(外源性刺激条件)，可能通过激活某种内源性凋亡启动基因参与并调节局 灶性脑缺血再灌流过程中的细胞凋亡。
, 百拇医药
3.2 TUNEL在局灶性脑缺血再灌流模型中检测凋亡细胞的意义 TUNEL是一种可进行原位检 测的分子生物免疫组织化学方法，它能特异地与凋亡细胞中断裂DNA的3’-羟基末端结合 ，经DAB显色可使凋亡细胞呈阳性着染，有很强的特异性[6]。因坏死神经细胞也 有DNA的崩解，可呈阳性反应，但它们伴有核破碎，在形态上与凋亡细胞明显不同，故在光 镜下容易区分。应用这一方法，可在组织切片上检出光镜下未发生形态改变的早期凋亡细胞 并进行原位定量、定性分析。我们的测定结果显示：该方法应用于局灶性脑缺血再灌流模型 中可以对缺血区的凋亡细胞进行定性、定量及定位研究，并具有敏感性高、出现早及利于形 态学观察等特点，可以弥补琼脂糖凝胶电泳检测方法的不足。但特异性略差，特别是当组织 切片经酶消化处理过强或聚合酶浓度过高时，可出现微弱的背景染色。少量坏死细胞也可呈 阳性反应，在进行结果分析时需注意这一点。
参 考 文 献
1，Koizumi JY，Nakazawa T，Qoneda G.Experimental studies of ischemia brain edema:A new experimental model of cerebral embolism in rats which circulation can be in troduced in the ischemia area.Jpn J Stroke,1986,8:1
, http://www.100md.com
2，Hamada Y, Dayakawa T, Hattori H, et al.Inhibition of nitric oxide synthesis redu ces hypoxic-ischemic brain damage in the neonatal rat.Pediatr Res,1994,5:10
3，Dawson VL, Dawson TM, Bartley DA, et al.Mechanisms of nitric oxide mediated neur otoxicity in primary brain cultures.J Neurosci,1993,13:2651
4，Kukuz JW, Prodo RJ, Dietrich WD, et al. The effect of nitric oxide synthase inh ibition infarct volume after reversible focal cerebral ischemia in conscious rat s.Stroke,1993,24:2023
5，Yamamoto S, Golanov EV, Berger SB, et al.Inhibition of nitric oxide synthesis in creases focal ischemic infarction in rat.J Cereb Blood Flow Metab,1992,12:717
6，牛建昭,小路武彦,中根一穗.用原位缺口翻译法比较两种细胞死亡的DNA状态.解剖学报,1994 ,25:398
收稿1999-07-04
修回2000-03-23, http://www.100md.com