β-淀粉样蛋白对大鼠脑神经细胞凋亡及白介素2表达的影响
作者：戴永萍 刘春风 包仕尧
单位：(215004 苏州医学院附属第二医院神经内科)
关键词：Alzheimer病；β淀粉样蛋白；细胞凋亡；尼莫的平
江苏医药000516 【摘要】 目的 研究β-淀粉样蛋白(Aβ)的神经毒性机制，特别是对大鼠海马和额叶皮层细胞凋亡相关基因bcl-2表达的影响，以及尼莫的平的作用。方法 将SD大鼠随机分模型组、治疗组和对照组。在立体定位下于迈内特基底核(NBM)注入Aβ10μg建立Alzheimer病模型，治疗组在建立模型后每天腹腔注射尼莫的平至实验结束。对照组NBM注入等容积生理盐水。流式细胞仪DNA含量分析和免疫荧光法检测来测定细胞群中细胞凋亡的比例和Bcl-2蛋白的含量，并结合常规病理和透射电镜观察组织学改变。结果 组织学可见早期凋亡的形态学改变。模型组大鼠海马、额叶神经细胞凋亡和Bcl-2蛋白含量较对照组升高；尼莫的平治疗后凋亡细胞减少，但海马区仍高于对照组，Bcl-2蛋白水平有所下调，接近正常对照组。结论 Aβ的神经毒性与细胞凋亡有关，尼莫的平有一定的治疗作用。
, 百拇医药
Alzheimer病(AD)的主要病理特征是患者脑内的神经炎性斑块和血管淀粉样变性。神经炎性斑块的主要成分是含40个氨基酸残基的β-淀粉样蛋白(Aβ)，人们对它的作用进行了大量的研究，提出了AD病因的Aβ学说，但Aβ的神经毒性机制尚不明确。本文以Aβ注入大鼠NBM建立大鼠AD模型，采用流式细胞仪(FCM)研究Aβ对大鼠海马和额叶皮层细胞凋亡相关基因bcl-2表达的影响，以及尼莫的平的作用。
材料与方法
一、实验动物及分组：健康雄性SD大鼠3～4月龄，体重180～250g，由苏州医学院动物实验中心提供。随机分模型组(n＝9)、尼莫的平治疗组(n＝9)和对照组(n＝10)。
二、模型制备和给药方法：按我们已报告的方法[1]参照大鼠脑立体定位图谱，将10μl的Aβ(RBI，美国)在立体定位仪下注入大鼠迈内特基底核(NBM)坐标为前囟后1.4mm，旁2.5mm，深7.2mm。对照组在NBM处注入等容积生理盐水，尼莫的平治疗组在建立模型后即刻给予腹腔注射尼莫的平50μg/100g体重，以后每天注射1次至实验结束，共2周。
, 百拇医药
三、病理组织学观察方法：模型组大鼠注入Aβ后2周断头取鼠脑海马、额叶脑组织，HE染色显微镜和醋酯铀-枸橼酸铅染色透射电镜进行组织学观察。
四、海马、额叶神经细胞凋亡和Bcl-2蛋白的检测：制备后细胞悬液操作在流式细胞仪(FCM，EPICS XL型，Coulter，美国)先后作凋亡细胞和Bcl-2蛋白免疫荧光检测分析。
细胞凋亡检测分析：细胞悬液经处理后，上机作DNA含量的测定，每个样本测100个细胞，经计算机处理得出该细胞群体的DNA含量分布，绘出其直方图。在G1峰的左侧可以见到凋亡细胞(亚G1期)峰群，计算出该群细胞所占百分数。
Bcl-2蛋白的检测：细胞悬液用细胞膜打孔剂处理，按操作说明书操作。加入第一抗体(bcl-2兔IgG，)，37℃中孵育60分钟，按操作说明书操作。PBS清洗后再加第二抗体异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG反应60分钟，再用PBS清洗3次。上机作免疫荧光强度的检测，以荧光指数(FI)表示Bcl-2蛋白的相对含量。
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五、统计学处理：
数据以
±s表示。用t检验进行比较。
结果
一、组织学改变：HE染色可见海马和额叶变性的神经细胞和少量胶质细胞增生。透射电镜下可见一些细胞膜出现皱缩，细胞体积正常或稍缩小，细胞核膜完整，染色质浓缩，并见边聚现象。额叶神经细胞也有类似现象。本组未见典型凋亡小体。
二、凋亡细胞和Bcl-2蛋白测定：各组大鼠海马、额叶神经细胞亚G1期细胞百分数和Bcl-2蛋白含量改变见表1。模型组大鼠海马、额叶神经细胞亚G1期细胞和Bcl-2蛋白含量较对照组升高；尼莫的平治疗后亚G1期细胞下降，但海马区仍高于对照组，Bcl-2水平均有所下调，接近正常对照组。
, 百拇医药
表1 各组大鼠海马和额叶凋亡细胞百分数和Bcl-2蛋白含量改变 组别
额 叶
海 马
凋亡细胞百分数
Bcl-2蛋白
凋亡细胞百分数
Bcl-2蛋白
模型组
9.8±2.9*△
2.87±0.34*△
12.7±4.1**△
, 百拇医药
2.68±0.41**△
治疗组
6.1±2.4
1.89±0.27
7.8±3.4*
1.86±0.28
对照组
5.1±2.1
2.23±0.27
4.8±1.2
2.15±0.28
, http://www.100md.com 与对照组比较*P<0.01，**P<0.05；与治疗组比，△P<0.01
讨论
研究表明AD的大多数症状与脑内沉积的Aβ毒性作用所造成的神经退行性变有关，研究发现Aβ是一种有明显神经毒性的短肽，但Aβ致神经细胞丧失是通过凋亡还是通过坏死机制，尚未有明确的结论[2]。为研究Aβ的神经损伤机制和药物的干预作用，我们将Aβ注入大鼠NBM以建立大鼠AD模型，在已进行的行为学测试表明了该模型很好地复制了AD的学习记忆缺损，并能引起海马、额叶局部脑血流量降低[1]。近年来研究表明Alzheimer病(AD)与细胞凋亡及相关基因关系密切[3，4]。在培养的神经细胞、AD动物模型和AD患者脑内均发现了细胞凋亡的证据[3]。但也有不同的意见，认为细胞凋亡并非是AD神经细胞死亡的主要方式[4]。为此我们采用流式细胞仪亚“G1”峰检测法研究了Aβ对大鼠海马、额叶神经细胞的影响。亚G1期细胞在整个细胞群中所占的百分数，可以用来比较不同细胞群之间凋亡细胞的多少。我们发现无论海马还是额叶的神经细胞凋亡都增加，海马区更明显。同样在组织学研究中也发现了早期凋亡的证据。在Aβ致细胞损害过程中，有作者发现Aβ通过干扰细胞Ca2+的平衡产生细胞毒性，并诱导细胞凋亡[5]。Arispe等[6]的体外试验发现合成的Aβ可形成一种跨越脂双层的离子通道，这些通道可以有效地转运钙离子，而且这种改变早于淀粉样斑块的形成。由于发现Aβ可以在脂质体上形成钙离子通道，破坏细胞内外的Ca2+平衡，因此细胞内游离钙的增加被认为可能是凋亡的早期触发因素之一。我们采用尼莫的平抑制了部分细胞凋亡的发生，也证实了Ca2+的重要作用。而不能完全抑制海马区细胞凋亡原因，可能与治疗的时间、药物剂量以及同时存在其它机制有关。
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细胞凋亡受到多种基因的调节，其中bcl-2是一个重要的与凋亡相关的基因。我们发现注入Aβ后2周模型组大鼠海马和额叶bcl-2基因表达增强，应用尼莫的平后其表达的水平有所下调。这与O’Barr等[7]在AD患者中的观察结果基本一致，他们发现AD患者Bcl-2蛋白表达水平是非痴呆老年人蛋白表达的3倍以上；而Su等[8]应用免疫组化技术在AD患者发现在老年斑周围Bcl-2表达上调，在纤维缠结神经元中其表达水平下调。Paradis等[9]用100nM浓度的Aβ加入培养的人海马神经细胞中所发现的结果却相反，Bcl-2表达水平下降而Bax升高。这说明bcl-2基因在对AD中神经细胞凋亡有一定的调节作用，对抗Aβ所诱导的细胞凋亡，并可能与Aβ浓度或含量有关。
由此可见，在动物模型、细胞培养以及AD患者的研究中大多数的结果都表明Aβ的神经毒性与细胞凋亡以及相关的基因关系密切。
参考文献
, http://www.100md.com
1，刘春风，戴永萍，包仕尧，等.Alzheimer病大鼠局部脑血流量与行为学改变的研究.临床神经病学杂志，1999，12：160-162.
2，Wisniewski T，Ghiso J，Frangine B.Alzheimer’s disease and solubleAβ.Neurobiology of aging，1994，15：143-152.
3，Savitz SI，Rosenbaum DM.Apoptosis in neurological disease.Neurosurgery，1998，42：555-574.
4，Stadelmann C，Bruck W，Bancher C，et al.Alzheimer disease：DNA fragmentation indicates increased neuronal vulnerability，but not apoptosis.J Neuropathol Exp Neurol，1998，57：456-464.
, 百拇医药
5，Fu W，Luo H，Parthasarathy S，et al.Catecholamines potentiate amyloid beta-peptide neurotoxicity：involve-ment of oxidative stress，mitochondrial dysfunction，and perturbed calcium homeostasis.Neurobiol Dis，1998，5：229-243.
6，Arispe N，Rojas E，Pollard H.Alzheimer’s disease amyloid beta protein forms calcium channeles in bilayer membranes：blockade by tromethamine and aluminum.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：567-571.
7，O’Barr S，Schultz J，Rogers J.Expression of the protoncogene bcl-2 in Alzheimer’s disease brain.Neurobiol Aging，1996，17：131-136.
, 百拇医药
8，Su JH，Deng G，Cotman CW.Bax protein expression is increased in Alzheimer’s brain：correlations with DNA damage，Bcl-2 expression，and brain pathology.J Neuropathol Exp Neurol，1997，56：86-93.
9，Paradis E，Douillard H，Koutroumanis M，et al.Amyloid beta peptide of Alzheimer’s disease downregulates Bcl-2 and upregulates bax expression in human neurons.J Neurosci，1996，16：7533-7539.
(收稿：1999-09-20 修回：1999-11-09), 百拇医药
单位：(215004 苏州医学院附属第二医院神经内科)
关键词：Alzheimer病；β淀粉样蛋白；细胞凋亡；尼莫的平
江苏医药000516 【摘要】 目的 研究β-淀粉样蛋白(Aβ)的神经毒性机制，特别是对大鼠海马和额叶皮层细胞凋亡相关基因bcl-2表达的影响，以及尼莫的平的作用。方法 将SD大鼠随机分模型组、治疗组和对照组。在立体定位下于迈内特基底核(NBM)注入Aβ10μg建立Alzheimer病模型，治疗组在建立模型后每天腹腔注射尼莫的平至实验结束。对照组NBM注入等容积生理盐水。流式细胞仪DNA含量分析和免疫荧光法检测来测定细胞群中细胞凋亡的比例和Bcl-2蛋白的含量，并结合常规病理和透射电镜观察组织学改变。结果 组织学可见早期凋亡的形态学改变。模型组大鼠海马、额叶神经细胞凋亡和Bcl-2蛋白含量较对照组升高；尼莫的平治疗后凋亡细胞减少，但海马区仍高于对照组，Bcl-2蛋白水平有所下调，接近正常对照组。结论 Aβ的神经毒性与细胞凋亡有关，尼莫的平有一定的治疗作用。
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Alzheimer病(AD)的主要病理特征是患者脑内的神经炎性斑块和血管淀粉样变性。神经炎性斑块的主要成分是含40个氨基酸残基的β-淀粉样蛋白(Aβ)，人们对它的作用进行了大量的研究，提出了AD病因的Aβ学说，但Aβ的神经毒性机制尚不明确。本文以Aβ注入大鼠NBM建立大鼠AD模型，采用流式细胞仪(FCM)研究Aβ对大鼠海马和额叶皮层细胞凋亡相关基因bcl-2表达的影响，以及尼莫的平的作用。
材料与方法
一、实验动物及分组：健康雄性SD大鼠3～4月龄，体重180～250g，由苏州医学院动物实验中心提供。随机分模型组(n＝9)、尼莫的平治疗组(n＝9)和对照组(n＝10)。
二、模型制备和给药方法：按我们已报告的方法[1]参照大鼠脑立体定位图谱，将10μl的Aβ(RBI，美国)在立体定位仪下注入大鼠迈内特基底核(NBM)坐标为前囟后1.4mm，旁2.5mm，深7.2mm。对照组在NBM处注入等容积生理盐水，尼莫的平治疗组在建立模型后即刻给予腹腔注射尼莫的平50μg/100g体重，以后每天注射1次至实验结束，共2周。
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三、病理组织学观察方法：模型组大鼠注入Aβ后2周断头取鼠脑海马、额叶脑组织，HE染色显微镜和醋酯铀-枸橼酸铅染色透射电镜进行组织学观察。
四、海马、额叶神经细胞凋亡和Bcl-2蛋白的检测：制备后细胞悬液操作在流式细胞仪(FCM，EPICS XL型，Coulter，美国)先后作凋亡细胞和Bcl-2蛋白免疫荧光检测分析。
细胞凋亡检测分析：细胞悬液经处理后，上机作DNA含量的测定，每个样本测100个细胞，经计算机处理得出该细胞群体的DNA含量分布，绘出其直方图。在G1峰的左侧可以见到凋亡细胞(亚G1期)峰群，计算出该群细胞所占百分数。
Bcl-2蛋白的检测：细胞悬液用细胞膜打孔剂处理，按操作说明书操作。加入第一抗体(bcl-2兔IgG，)，37℃中孵育60分钟，按操作说明书操作。PBS清洗后再加第二抗体异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG反应60分钟，再用PBS清洗3次。上机作免疫荧光强度的检测，以荧光指数(FI)表示Bcl-2蛋白的相对含量。
, http://www.100md.com
五、统计学处理：
数据以
±s表示。用t检验进行比较。结果
一、组织学改变：HE染色可见海马和额叶变性的神经细胞和少量胶质细胞增生。透射电镜下可见一些细胞膜出现皱缩，细胞体积正常或稍缩小，细胞核膜完整，染色质浓缩，并见边聚现象。额叶神经细胞也有类似现象。本组未见典型凋亡小体。
二、凋亡细胞和Bcl-2蛋白测定：各组大鼠海马、额叶神经细胞亚G1期细胞百分数和Bcl-2蛋白含量改变见表1。模型组大鼠海马、额叶神经细胞亚G1期细胞和Bcl-2蛋白含量较对照组升高；尼莫的平治疗后亚G1期细胞下降，但海马区仍高于对照组，Bcl-2水平均有所下调，接近正常对照组。
, 百拇医药
表1 各组大鼠海马和额叶凋亡细胞百分数和Bcl-2蛋白含量改变 组别
额 叶
海 马
凋亡细胞百分数
Bcl-2蛋白
凋亡细胞百分数
Bcl-2蛋白
模型组
9.8±2.9*△
2.87±0.34*△
12.7±4.1**△
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2.68±0.41**△
治疗组
6.1±2.4
1.89±0.27
7.8±3.4*
1.86±0.28
对照组
5.1±2.1
2.23±0.27
4.8±1.2
2.15±0.28
, http://www.100md.com 与对照组比较*P<0.01，**P<0.05；与治疗组比，△P<0.01
讨论
研究表明AD的大多数症状与脑内沉积的Aβ毒性作用所造成的神经退行性变有关，研究发现Aβ是一种有明显神经毒性的短肽，但Aβ致神经细胞丧失是通过凋亡还是通过坏死机制，尚未有明确的结论[2]。为研究Aβ的神经损伤机制和药物的干预作用，我们将Aβ注入大鼠NBM以建立大鼠AD模型，在已进行的行为学测试表明了该模型很好地复制了AD的学习记忆缺损，并能引起海马、额叶局部脑血流量降低[1]。近年来研究表明Alzheimer病(AD)与细胞凋亡及相关基因关系密切[3，4]。在培养的神经细胞、AD动物模型和AD患者脑内均发现了细胞凋亡的证据[3]。但也有不同的意见，认为细胞凋亡并非是AD神经细胞死亡的主要方式[4]。为此我们采用流式细胞仪亚“G1”峰检测法研究了Aβ对大鼠海马、额叶神经细胞的影响。亚G1期细胞在整个细胞群中所占的百分数，可以用来比较不同细胞群之间凋亡细胞的多少。我们发现无论海马还是额叶的神经细胞凋亡都增加，海马区更明显。同样在组织学研究中也发现了早期凋亡的证据。在Aβ致细胞损害过程中，有作者发现Aβ通过干扰细胞Ca2+的平衡产生细胞毒性，并诱导细胞凋亡[5]。Arispe等[6]的体外试验发现合成的Aβ可形成一种跨越脂双层的离子通道，这些通道可以有效地转运钙离子，而且这种改变早于淀粉样斑块的形成。由于发现Aβ可以在脂质体上形成钙离子通道，破坏细胞内外的Ca2+平衡，因此细胞内游离钙的增加被认为可能是凋亡的早期触发因素之一。我们采用尼莫的平抑制了部分细胞凋亡的发生，也证实了Ca2+的重要作用。而不能完全抑制海马区细胞凋亡原因，可能与治疗的时间、药物剂量以及同时存在其它机制有关。
, http://www.100md.com
细胞凋亡受到多种基因的调节，其中bcl-2是一个重要的与凋亡相关的基因。我们发现注入Aβ后2周模型组大鼠海马和额叶bcl-2基因表达增强，应用尼莫的平后其表达的水平有所下调。这与O’Barr等[7]在AD患者中的观察结果基本一致，他们发现AD患者Bcl-2蛋白表达水平是非痴呆老年人蛋白表达的3倍以上；而Su等[8]应用免疫组化技术在AD患者发现在老年斑周围Bcl-2表达上调，在纤维缠结神经元中其表达水平下调。Paradis等[9]用100nM浓度的Aβ加入培养的人海马神经细胞中所发现的结果却相反，Bcl-2表达水平下降而Bax升高。这说明bcl-2基因在对AD中神经细胞凋亡有一定的调节作用，对抗Aβ所诱导的细胞凋亡，并可能与Aβ浓度或含量有关。
由此可见，在动物模型、细胞培养以及AD患者的研究中大多数的结果都表明Aβ的神经毒性与细胞凋亡以及相关的基因关系密切。
参考文献
, http://www.100md.com
1，刘春风，戴永萍，包仕尧，等.Alzheimer病大鼠局部脑血流量与行为学改变的研究.临床神经病学杂志，1999，12：160-162.
2，Wisniewski T，Ghiso J，Frangine B.Alzheimer’s disease and solubleAβ.Neurobiology of aging，1994，15：143-152.
3，Savitz SI，Rosenbaum DM.Apoptosis in neurological disease.Neurosurgery，1998，42：555-574.
4，Stadelmann C，Bruck W，Bancher C，et al.Alzheimer disease：DNA fragmentation indicates increased neuronal vulnerability，but not apoptosis.J Neuropathol Exp Neurol，1998，57：456-464.
, 百拇医药
5，Fu W，Luo H，Parthasarathy S，et al.Catecholamines potentiate amyloid beta-peptide neurotoxicity：involve-ment of oxidative stress，mitochondrial dysfunction，and perturbed calcium homeostasis.Neurobiol Dis，1998，5：229-243.
6，Arispe N，Rojas E，Pollard H.Alzheimer’s disease amyloid beta protein forms calcium channeles in bilayer membranes：blockade by tromethamine and aluminum.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：567-571.
7，O’Barr S，Schultz J，Rogers J.Expression of the protoncogene bcl-2 in Alzheimer’s disease brain.Neurobiol Aging，1996，17：131-136.
, 百拇医药
8，Su JH，Deng G，Cotman CW.Bax protein expression is increased in Alzheimer’s brain：correlations with DNA damage，Bcl-2 expression，and brain pathology.J Neuropathol Exp Neurol，1997，56：86-93.
9，Paradis E，Douillard H，Koutroumanis M，et al.Amyloid beta peptide of Alzheimer’s disease downregulates Bcl-2 and upregulates bax expression in human neurons.J Neurosci，1996，16：7533-7539.
(收稿：1999-09-20 修回：1999-11-09), 百拇医药