冰片与川芎配伍对脑缺血再灌注损伤的保护作用
作者：黄萍 吴清和 荣向路 雷娓娓 贝美莲 韩坚 吴玲霓
单位：广州中医药大学中药学院， 广州 510405
关键词：冰片/药理学；川芎/药理学；脑缺血/中药疗法；脑/病理学；神经细胞/超微结构；@胶质细胞/超微结构
广州中医药大学学报000412摘要：用结扎双侧颈总动脉法，造成大鼠脑缺血再灌注模型，观察冰片与川芎配伍对急性脑缺血再灌注脑组织含水量、形态学及超微结构的影响。结果显示，冰片与川芎配伍可明显减轻缺血再灌注脑组织含水量；明显减轻细胞间质水肿和神经细胞的损伤；对脑缺血再灌注所致脑组织超微结构的破坏也有明显的保护作用。提示冰片与川芎配伍可通过保护血管内皮细胞功能、基膜的完整性，改善微循环，减轻脑水肿程度，从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。冰片与川芎配伍后，作用明显优于单用川芎或冰片。
中图分类号：R285.5 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1007-3213(2000)04-0323-04
Protective Effects of Borneolum Combined with Rhizoma Chuanxiong
on Cerebral Ischemia with Reperfusion Injury
HUANG Ping, WU Qinghe, RONG Xianglu, LEI Weiwei,BEI Meilian, HAN Jian, WU Lingni
(School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)
Abstract:Rat model of cerebral ischemia with reperfusion injury was set up by occlusion of bilateral carotid arteries. The effect of Borneolum combined with Rhizoma Chuanxiong on the water volume of cerebral tissue, morphological feature and ultrastructure of the rat model was observed. The results showed that Borneolum combined with Rhizoma Chuanxiong decreased the cerebral water volume, reduced intercellular edema and neurocytic damage and protect cerebral ultrastructure from damage. It is indicated that the protective mechanism is related to the preservation of vascular endothelial cell function and intact basilemma, improvement of microcirculation and reduction of cerebral edema. The effect of Borneolum combined with Rhizoma Chuanxiong is superior to that of Rhizoma Chuanxiong and Borneolum used singly.
, 百拇医药
Key words:BORNEOLUM SYNTHETICUM/pharmacology;LIGUSTICUM CHUANXIONG/pharmacology; CEREBRAL ISCHEMIA/TCD therapy;BRAIN/pharmacology; NEURONS/ultrastructure; @GLIOCYTE/ultrastructure
中风是中老年人的常见病、多发病，缺血性中风约占脑卒中的70%，可导致很高的病死率和致残率。而脑卒中急性期的脑水肿是脑损伤的主要病理过程，也是致死的主要因素。本研究观察冰片与川芎配伍对脑缺血再灌注大鼠脑水肿及形态学的影响，探讨二者配伍对脑缺血再灌注损伤保护作用及冰片在其中的“引药”作用。
1 材料与方法
1.1 动物
SD大鼠，体重180～200g，雌雄各半，由广东省卫生厅实验动物场提供。
, 百拇医药
1.2 药物
冰片：购于广州市药材公司。与卫生部药检所提供的冰片(化学对照品，机片)比较后核定为机片。配制成10%石蜡油液备用(4℃冰箱保存)。
川芎：购于广州市药材公司。先在室温下浸泡1h，以1∶10加入蒸馏水煎煮两次，每次30min。用3层过滤，合并2次滤液后以水浴法浓缩成100%浓度备用(4℃冰箱保存)。
1.3 主要仪器
JEM-1200EX电子显微镜，日本电子公司产品。
1.4 实验方法
动物随机分为对照组、模型组、冰片组(1g/kg)、川芎高剂组(1g/kg)、川芎低剂组(0.5g/kg)、川芎高剂+冰片组(川高+冰组)、川芎低剂+冰片组(川低+冰组)。各组每天灌胃给药1次(对照组和模型组灌等量蒸馏水，川高+冰组和川低+冰组均为灌服川芎后15min灌冰片)，连续7d。实验前禁食24h，实验当天给药后1h，各组动物除对照组外，均按文献方法稍加改良复制脑缺血再灌注模型，以动脉夹夹闭双侧颈总动脉40min，放开动脉夹再灌注60min，快速断头开颅取脑。取右侧半球，用滤纸吸取表面水分，以电子天平称取湿重，放入干燥箱105℃烤24h至恒重(两次脑组织干重差m≤0.1 mg)，称取干重，按照Elliott公式计算脑含水量∶脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。取左侧大脑皮质组织1mm3，振动半薄切片，片厚50μm，再经1%锇酸后固定，系列酒精脱水，丙酮脱水，平板EPON812包埋，在显微镜下定位，AO超薄切片机超薄切片，片厚60nm，双重电子染色后，观察超微结构并照相。取同侧脑组织作病理组织切片，HE染色后光镜下观察神经细胞形态及间质水肿情况。
, 百拇医药
2 结果
2.1 对大鼠缺血再灌注后脑组织含水量的影响 冰片与川芎配伍可明显降低缺血再灌注脑组织含水量(P<0.05)；单用川芎或冰片对脑组织含水量无明显影响。见表1。
2.2 对脑组织超微结构的影响
2.2.1 微血管形态 正常对照组(图1-a)微血管横切面呈椭圆形，内皮细胞(Ed)扁平，表面平滑，管腔(Lu)较宽，基底膜(BM)完整，管周神经毡形态正常；模型组(图1-b)微血管横切面见管腔明显狭窄，内皮细胞肿胀明显，基底膜模糊不清，管周水肿明显(△)；冰片与川芎配伍组(图1-c)微血管的超微结构与正常对照组相似；川芎组微血管横切面见基底膜局部较模糊，其余与正常对照组相似；冰片组微血管的超微结构与模型组相似。
2.2.2 神经细胞形态 正常对照组(图2-a)神经细胞核(N)呈卵圆形，无切迹，胞质有大量线粒体(Mi)，切面为椭圆形，内有基质与排列密杂的嵴；粗面内质网(RER)发达，其间有众多的核糖体；高尔基氏器(Go)由多层扁平囊排列而成；可见少量的脂褐素(Lic)。模型组(图2-b)神经细胞核不规则，有明显切迹， 胞质中线粒体多数肿胀，其内部嵴稀疏或断裂成空泡样变；高尔基氏器扁平囊排列紊乱并扩张成囊泡状；脂褐素大量增加。冰片与川芎配伍组(图2-c)神经细胞的超微结构与正常对照组相似，未见明显病理改变。川芎组神经细胞形态与正常对照组相似，但高尔基氏器轻度肿胀，脂褐素较多。冰片组神经细胞的超微结构与模型组相似，未见明显的改善情况。
, 百拇医药
2.2.3 胶质细胞形态 正常对照组(图3-a)胶质细胞核呈卵圆形，染色略深，胞质较少，有中等量体积较小的线粒体。模型组(图3-b)胶质细胞核内外 均呈水肿状，胞核不规则，核内染色质凝聚，核膜断裂与模糊不清；胞质大片水肿空白区域(△)，可见残存的细胞器漂浮其间。冰片与川芎配伍组(图3-c)胶质细胞的超微结构与正常对照组相似，未见明显病理改变。川芎组胶质细胞核轻度水肿，核内染色质有凝聚现象。冰片组胶质细胞的超微结构与模型组相似，未见明显的改善情况。
2.3 光镜下神经细胞及间质的变化
正常对照组(图4-a)、模型组(图4-b)、冰片与川芎配伍组(图4-c)、川芎组(图4-d)、冰片组(图4-e)光镜下神经细胞及间质的病理改变情况见表2。
图1 电镜下脑组织微血管形态
, 百拇医药
图2 电镜下神经细胞形态
图3 电镜下胶质细胞形态
表1 对缺血再灌注脑组织含水量的影响(
±s) 组 别
N/个
p含水量/%
正常组
10
79.18±1.02
模型组
, 百拇医药
10
82.14±0.95△△
冰片组
10
82.22±1.84
川芎高剂组
10
81.84±0.93
川芎低剂组
10
82.76±1.34
川高+冰组
, 百拇医药
10
80.48±1.42*
川低+冰组
10
82.08±1.65
△与对照组比较P<0.05，△△P<0.01；*与模型组比较P<0.05，**P<0.01 表2 药物对神经细胞及间质的影响 N/例 组 别
合计
正常
病变+
病变++
病变+++
, 百拇医药
正常对照组
5
5
模型组
5
3
2
冰片+川芎组
5
2
2
1
川芎组
5
, http://www.100md.com
1
3
1
冰片组
5
1
2
3
正常：神经细胞核较大，核仁清楚，胞体有突起伸出，间质内未见出血、坏死及水肿。病变+：神经细胞外空隙略增宽，间质水肿较局限，细胞间距离略增宽，神经细胞变性坏死不明显。病变+++：神经细胞外空隙明显增宽，间质水肿较弥漫，细胞间距离明显增宽，部分神经细胞变性坏死，可见神经细胞被噬现象。病变++：上述变化介于+与+++之间
3 讨论
, 百拇医药
中医理论认为，冰片“芳香走窜”，“引药上行”，“独行则势弱、佐使则有功”。冰片在胃肠道吸收迅速，极易透过血脑屏障进入脑内[1]。冰片可开放血脑屏障，促进某些水溶性大分子物质和药物透过血脑屏障进入脑内(如泛影葡胺、Evan's Blue、庆大霉素、磺胺嘧啶等[2～5])。这些都为冰片作为“引药”(使药)提供了佐证。川芎是临床治疗脑血管病尤其是缺血性脑血管病的有效药物，具有扩张脑血管、增加脑血流量、降低耗氧量等作用，对脑缺血性损伤有保护作用。有研究表明，川芎嗪配伍冰片后，可促进川芎嗪的胃肠吸收，明显提高川芎嗪的血药浓度[6]。
基于冰片促进血脑屏障开放的特性，本实验观察了冰片与川芎配伍对急性脑缺血再灌注脑组织含水量、形态学及超微结构的影响。结果表明，冰片与川芎配伍可明显减轻缺血再灌注脑组织含水量；明显减轻细胞间质水肿和神经细胞的损伤；对脑缺血再灌注所致脑组织超微结构的破坏也有明显的保护作用。提示冰片与川芎配伍可通过保护血管内皮细胞功能、基膜的完整性，改善微循环，减轻脑水肿程度，从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。实验还显示单用川芎或冰片对脑组织含水量无明显影响，提示川芎虽能活血行血，但无冰片的“芳香走窜”“引药上行”，仍然不能发挥其药理作用，而冰片本身并不具备这一作用，只有两者配伍使用才能增强川芎对脑缺血再灌注损伤的保护作用，从而为冰片的“引药”(使药)作用提供了药理学依据。进一步的实验还证明，冰片与川芎配伍可能是通过减少缺血脑组织中NO的生成，减轻NO`介导的神经毒性作用，提高自由基清除酶的活性，抑制脂质过氧化反应，而对缺血性脑组织损伤起保护作用(待发表)。
, 百拇医药
基金项目：广东省中医药管理局课题(编号：97165)
作者简介：黄萍(1960-)，女，副教授；
参考文献：
[1] 梁美容，刘启德，黄天来，等.冰片在大鼠血清和脑组织中的药代动力学特征[J].中药新药与临床药理，1993，4(4)：38
[2] 梁美容，叶少梅，张银卿，等.冰片对兔、大鼠脑组织伊文氏蓝染色作用的观察[J].广州中医学院学报，1993，10(4)：211
[3] 刘启德，梁美容，陈芝喜，等.冰片对庆大霉素透血脑屏障的影响[J].广州中医学院学报，1994，11(1)：34
[4] 徐伟，王宗锐.薄荷醇及冰片对磺胺嘧啶和伊文氏蓝在脑中分布的影响[J].中药药理与临床，1995(6)：31
[5] 王宁生，梁美容，刘启德，等.冰片“佐使则有功”之实验研究[J].中医杂志，1994，35(1)：46
[6] 陈铁锋.冰片促进四甲基吡嗪的吸收[J].中国药理学报，1990，11(1)：42
收稿日期：2000-06-30, 百拇医药
单位：广州中医药大学中药学院， 广州 510405
关键词：冰片/药理学；川芎/药理学；脑缺血/中药疗法；脑/病理学；神经细胞/超微结构；@胶质细胞/超微结构
广州中医药大学学报000412摘要：用结扎双侧颈总动脉法，造成大鼠脑缺血再灌注模型，观察冰片与川芎配伍对急性脑缺血再灌注脑组织含水量、形态学及超微结构的影响。结果显示，冰片与川芎配伍可明显减轻缺血再灌注脑组织含水量；明显减轻细胞间质水肿和神经细胞的损伤；对脑缺血再灌注所致脑组织超微结构的破坏也有明显的保护作用。提示冰片与川芎配伍可通过保护血管内皮细胞功能、基膜的完整性，改善微循环，减轻脑水肿程度，从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。冰片与川芎配伍后，作用明显优于单用川芎或冰片。
中图分类号：R285.5 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1007-3213(2000)04-0323-04
Protective Effects of Borneolum Combined with Rhizoma Chuanxiong
on Cerebral Ischemia with Reperfusion Injury
HUANG Ping, WU Qinghe, RONG Xianglu, LEI Weiwei,BEI Meilian, HAN Jian, WU Lingni
(School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)
Abstract:Rat model of cerebral ischemia with reperfusion injury was set up by occlusion of bilateral carotid arteries. The effect of Borneolum combined with Rhizoma Chuanxiong on the water volume of cerebral tissue, morphological feature and ultrastructure of the rat model was observed. The results showed that Borneolum combined with Rhizoma Chuanxiong decreased the cerebral water volume, reduced intercellular edema and neurocytic damage and protect cerebral ultrastructure from damage. It is indicated that the protective mechanism is related to the preservation of vascular endothelial cell function and intact basilemma, improvement of microcirculation and reduction of cerebral edema. The effect of Borneolum combined with Rhizoma Chuanxiong is superior to that of Rhizoma Chuanxiong and Borneolum used singly.
, 百拇医药
Key words:BORNEOLUM SYNTHETICUM/pharmacology;LIGUSTICUM CHUANXIONG/pharmacology; CEREBRAL ISCHEMIA/TCD therapy;BRAIN/pharmacology; NEURONS/ultrastructure; @GLIOCYTE/ultrastructure
中风是中老年人的常见病、多发病，缺血性中风约占脑卒中的70%，可导致很高的病死率和致残率。而脑卒中急性期的脑水肿是脑损伤的主要病理过程，也是致死的主要因素。本研究观察冰片与川芎配伍对脑缺血再灌注大鼠脑水肿及形态学的影响，探讨二者配伍对脑缺血再灌注损伤保护作用及冰片在其中的“引药”作用。
1 材料与方法
1.1 动物
SD大鼠，体重180～200g，雌雄各半，由广东省卫生厅实验动物场提供。
, 百拇医药
1.2 药物
冰片：购于广州市药材公司。与卫生部药检所提供的冰片(化学对照品，机片)比较后核定为机片。配制成10%石蜡油液备用(4℃冰箱保存)。
川芎：购于广州市药材公司。先在室温下浸泡1h，以1∶10加入蒸馏水煎煮两次，每次30min。用3层过滤，合并2次滤液后以水浴法浓缩成100%浓度备用(4℃冰箱保存)。
1.3 主要仪器
JEM-1200EX电子显微镜，日本电子公司产品。
1.4 实验方法
动物随机分为对照组、模型组、冰片组(1g/kg)、川芎高剂组(1g/kg)、川芎低剂组(0.5g/kg)、川芎高剂+冰片组(川高+冰组)、川芎低剂+冰片组(川低+冰组)。各组每天灌胃给药1次(对照组和模型组灌等量蒸馏水，川高+冰组和川低+冰组均为灌服川芎后15min灌冰片)，连续7d。实验前禁食24h，实验当天给药后1h，各组动物除对照组外，均按文献方法稍加改良复制脑缺血再灌注模型，以动脉夹夹闭双侧颈总动脉40min，放开动脉夹再灌注60min，快速断头开颅取脑。取右侧半球，用滤纸吸取表面水分，以电子天平称取湿重，放入干燥箱105℃烤24h至恒重(两次脑组织干重差m≤0.1 mg)，称取干重，按照Elliott公式计算脑含水量∶脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。取左侧大脑皮质组织1mm3，振动半薄切片，片厚50μm，再经1%锇酸后固定，系列酒精脱水，丙酮脱水，平板EPON812包埋，在显微镜下定位，AO超薄切片机超薄切片，片厚60nm，双重电子染色后，观察超微结构并照相。取同侧脑组织作病理组织切片，HE染色后光镜下观察神经细胞形态及间质水肿情况。
, 百拇医药
2 结果
2.1 对大鼠缺血再灌注后脑组织含水量的影响 冰片与川芎配伍可明显降低缺血再灌注脑组织含水量(P<0.05)；单用川芎或冰片对脑组织含水量无明显影响。见表1。
2.2 对脑组织超微结构的影响
2.2.1 微血管形态 正常对照组(图1-a)微血管横切面呈椭圆形，内皮细胞(Ed)扁平，表面平滑，管腔(Lu)较宽，基底膜(BM)完整，管周神经毡形态正常；模型组(图1-b)微血管横切面见管腔明显狭窄，内皮细胞肿胀明显，基底膜模糊不清，管周水肿明显(△)；冰片与川芎配伍组(图1-c)微血管的超微结构与正常对照组相似；川芎组微血管横切面见基底膜局部较模糊，其余与正常对照组相似；冰片组微血管的超微结构与模型组相似。
2.2.2 神经细胞形态 正常对照组(图2-a)神经细胞核(N)呈卵圆形，无切迹，胞质有大量线粒体(Mi)，切面为椭圆形，内有基质与排列密杂的嵴；粗面内质网(RER)发达，其间有众多的核糖体；高尔基氏器(Go)由多层扁平囊排列而成；可见少量的脂褐素(Lic)。模型组(图2-b)神经细胞核不规则，有明显切迹， 胞质中线粒体多数肿胀，其内部嵴稀疏或断裂成空泡样变；高尔基氏器扁平囊排列紊乱并扩张成囊泡状；脂褐素大量增加。冰片与川芎配伍组(图2-c)神经细胞的超微结构与正常对照组相似，未见明显病理改变。川芎组神经细胞形态与正常对照组相似，但高尔基氏器轻度肿胀，脂褐素较多。冰片组神经细胞的超微结构与模型组相似，未见明显的改善情况。
, 百拇医药
2.2.3 胶质细胞形态 正常对照组(图3-a)胶质细胞核呈卵圆形，染色略深，胞质较少，有中等量体积较小的线粒体。模型组(图3-b)胶质细胞核内外 均呈水肿状，胞核不规则，核内染色质凝聚，核膜断裂与模糊不清；胞质大片水肿空白区域(△)，可见残存的细胞器漂浮其间。冰片与川芎配伍组(图3-c)胶质细胞的超微结构与正常对照组相似，未见明显病理改变。川芎组胶质细胞核轻度水肿，核内染色质有凝聚现象。冰片组胶质细胞的超微结构与模型组相似，未见明显的改善情况。
2.3 光镜下神经细胞及间质的变化
正常对照组(图4-a)、模型组(图4-b)、冰片与川芎配伍组(图4-c)、川芎组(图4-d)、冰片组(图4-e)光镜下神经细胞及间质的病理改变情况见表2。
图1 电镜下脑组织微血管形态
, 百拇医药
图2 电镜下神经细胞形态
图3 电镜下胶质细胞形态
表1 对缺血再灌注脑组织含水量的影响(
±s) 组 别N/个
p含水量/%
正常组
10
79.18±1.02
模型组
, 百拇医药
10
82.14±0.95△△
冰片组
10
82.22±1.84
川芎高剂组
10
81.84±0.93
川芎低剂组
10
82.76±1.34
川高+冰组
, 百拇医药
10
80.48±1.42*
川低+冰组
10
82.08±1.65
△与对照组比较P<0.05，△△P<0.01；*与模型组比较P<0.05，**P<0.01 表2 药物对神经细胞及间质的影响 N/例 组 别
合计
正常
病变+
病变++
病变+++
, 百拇医药
正常对照组
5
5
模型组
5
3
2
冰片+川芎组
5
2
2
1
川芎组
5
, http://www.100md.com
1
3
1
冰片组
5
1
2
3
正常：神经细胞核较大，核仁清楚，胞体有突起伸出，间质内未见出血、坏死及水肿。病变+：神经细胞外空隙略增宽，间质水肿较局限，细胞间距离略增宽，神经细胞变性坏死不明显。病变+++：神经细胞外空隙明显增宽，间质水肿较弥漫，细胞间距离明显增宽，部分神经细胞变性坏死，可见神经细胞被噬现象。病变++：上述变化介于+与+++之间
3 讨论
, 百拇医药
中医理论认为，冰片“芳香走窜”，“引药上行”，“独行则势弱、佐使则有功”。冰片在胃肠道吸收迅速，极易透过血脑屏障进入脑内[1]。冰片可开放血脑屏障，促进某些水溶性大分子物质和药物透过血脑屏障进入脑内(如泛影葡胺、Evan's Blue、庆大霉素、磺胺嘧啶等[2～5])。这些都为冰片作为“引药”(使药)提供了佐证。川芎是临床治疗脑血管病尤其是缺血性脑血管病的有效药物，具有扩张脑血管、增加脑血流量、降低耗氧量等作用，对脑缺血性损伤有保护作用。有研究表明，川芎嗪配伍冰片后，可促进川芎嗪的胃肠吸收，明显提高川芎嗪的血药浓度[6]。
基于冰片促进血脑屏障开放的特性，本实验观察了冰片与川芎配伍对急性脑缺血再灌注脑组织含水量、形态学及超微结构的影响。结果表明，冰片与川芎配伍可明显减轻缺血再灌注脑组织含水量；明显减轻细胞间质水肿和神经细胞的损伤；对脑缺血再灌注所致脑组织超微结构的破坏也有明显的保护作用。提示冰片与川芎配伍可通过保护血管内皮细胞功能、基膜的完整性，改善微循环，减轻脑水肿程度，从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。实验还显示单用川芎或冰片对脑组织含水量无明显影响，提示川芎虽能活血行血，但无冰片的“芳香走窜”“引药上行”，仍然不能发挥其药理作用，而冰片本身并不具备这一作用，只有两者配伍使用才能增强川芎对脑缺血再灌注损伤的保护作用，从而为冰片的“引药”(使药)作用提供了药理学依据。进一步的实验还证明，冰片与川芎配伍可能是通过减少缺血脑组织中NO的生成，减轻NO`介导的神经毒性作用，提高自由基清除酶的活性，抑制脂质过氧化反应，而对缺血性脑组织损伤起保护作用(待发表)。
, 百拇医药
基金项目：广东省中医药管理局课题(编号：97165)
作者简介：黄萍(1960-)，女，副教授；
参考文献：
[1] 梁美容，刘启德，黄天来，等.冰片在大鼠血清和脑组织中的药代动力学特征[J].中药新药与临床药理，1993，4(4)：38
[2] 梁美容，叶少梅，张银卿，等.冰片对兔、大鼠脑组织伊文氏蓝染色作用的观察[J].广州中医学院学报，1993，10(4)：211
[3] 刘启德，梁美容，陈芝喜，等.冰片对庆大霉素透血脑屏障的影响[J].广州中医学院学报，1994，11(1)：34
[4] 徐伟，王宗锐.薄荷醇及冰片对磺胺嘧啶和伊文氏蓝在脑中分布的影响[J].中药药理与临床，1995(6)：31
[5] 王宁生，梁美容，刘启德，等.冰片“佐使则有功”之实验研究[J].中医杂志，1994，35(1)：46
[6] 陈铁锋.冰片促进四甲基吡嗪的吸收[J].中国药理学报，1990，11(1)：42
收稿日期：2000-06-30, 百拇医药