低温等离子体活化处理骨修复材料的组织学研究
作者：陈治清 张敏 邱静 冉均国 郑昌琼 何锦涛
单位：610041 成都，华西医科大学口腔医学院(陈治清、张敏、邱静)；四川联合大学生物无机材料研究室(冉均国、郑昌琼、何锦涛)
关键词：生物活性；牙科材料；骨修复材料
中华口腔医学杂志/980514 【摘要】 目的 为提高植入材料的生物活性，研究植入材料对机体组织产生的生物效应。方法 采用低温等离子表面活化处理技术，将羟基磷灰石颗粒置于真空高压电场中，通入NH3、H2、N2混合气体，在电容耦合辉光放电的等离子体环境中，使材料表面瞬间获得活性氨基结构。再通过动物骨内埋植实验，按不同时期对材料—骨界面的变化作动态组织学观察。结果 材料经表面活性处理后，其表面获得新生活性基团，而对材料本体的形态和性能不产生任何影响，植入骨内后能使材料—骨界面早期形成新骨并具有明显的促进骨生长作用，达到骨性结合的目的。结论 低温等离子体活化处理是提高植入材料生物活性的一种有效途径和方法。
, 百拇医药
Histomorphologic study of the bone repair materials by using the cold plasma technique
Chen Zhiqing*， Zhang Min， Qiu Jing,et al.*College of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective The purpose of this article is to improve the biological activity of the implant pretreated by use of cold plasma technic and to investigate the biological effects after implanted into bone.Methods First, HA granular was set in the electric field with high voltage and vacuum, then the gaseous mixture of ammonia, hydrogen and nitrogen was led to. By coupled capacity glow discharge, the plasma was produced and the pretreatment was completed. In this way, the surface of HA granular may obtain active amino structure. Sequently, the material was implanted into bone of the animal and the dynamic changes at the material/bone interface were histologically observed. Results The active group was definitely formed on the surface of the material after pretreatment and there were no adverse effects on the morphology and properties of the base material . Furthermore, the early formation of new bone at the interface of the material/bone was detected, and obvious effects on facilitating bone growth and osseointegration were obtained. Conclusion The findings indicated that cold plasma pretreatment technic was an effective method to improve the biological activity of implant material.
, 百拇医药
【Key Words】 Biological activity Dental material Bone repair materials
随着现代生物技术的发展，探索和研究具有氨基酸、蛋白质等生物活性结构的骨修复材料，已成为国内外研究的前沿课题。为获得更接近骨的整体结构和生物性能的材料，我们采用颗粒型羟基磷灰石，经低温等离子体活化处理，得到含有氨基结构的植入材料，植入动物骨内。分期处死动物，取样，制片，通过光学显微镜观察材料—骨界面的组织学动态变化。结果表明，含有氨基结构的植入材料对骨的早期形成和骨性结合均具有明显的促进作用，显示了良好的应用前景。
材料和方法
一、材料
实验材料：选择粒度为250μm～350μm ， 密度为3.0g±0.05g/cm3的羟基磷灰石颗粒(华西医科大学口腔材料研究室提供)。将材料置于真空高压电场中，通入NH3、H2、N2混合气体，在电容耦合辉光放电的等离子环境中，使材料表面瞬间获得活性氨基结构，经X线光电子能谱和红外光谱测试确定[1]。低温等离子体活化处理仪由吉林省宏安电子仪器厂制造，JG-B-300型(0～300W ， 13.56MHz) ，1990年出厂。
, http://www.100md.com
对照材料：未经处理的颗粒状羟基磷灰石，经环氧乙烷消毒灭菌后备用。
二、实验方法
通过动物实验考察材料—骨界面结合情况的组织学动态变化。选用健康成年家犬4只，体重11kg～15kg，随机分为4个实验组，每组一只动物，充分利用不同部位进行骨缺损修复实验。实验部位选在下颌骨体部的外侧骨板区。自颏部中线至下颌角依次定位植入实验材料、对照材料并设空白对照。左右两侧定位区对称。
术前采用氯丙嗪2ml、氯胺酮25ml、阿托品1ml 作实验动物腹腔及肌肉内注射麻醉。术区备皮，常规消毒后沿左下颌骨下缘切开皮肤分离皮下组织和肌肉，暴露下颌骨下缘，切开骨膜后用涡轮机在外侧骨板区造成3个直径5mm、深2mm的骨缺损并将实验材料和对照材料植入骨缺损区内；空白对照组不填入任何材料。分层严密缝合。右侧与左侧同法进行。术后给予抗菌素预防感染。
, http://www.100md.com 在术后1周、2周、4周、12周分别处死动物，取骨缺损修复区和周围骨联合标本，用10%的甲醛液固定，脱钙液脱钙，石蜡包埋作常规组织学切片。采用HE和新三色法染色，在光学显微镜下观察植入材料—骨界面区的组织学动态变化。
结果
一、植入实验材料组的改变
光学显微镜下可见实验材料植入骨缺损区1周后即有骨样细胞形成。这些细胞呈放射状排列在植入材料与周围骨之间。细胞形态与邻近的成纤维细胞相似。材料与材料之间，材料与界面之间有大量纤维组织长入并可见一些新生血管及中性粒细胞侵润 (图1)。植入2周后，尤以新三色法染色可明显观察到骨缺损区除一些纤维组织外，在靠近骨壁处可见有新骨形成 (图2)。植入4周后，骨缺损修复区纤维组织明显减少，被新生骨所替代，新生骨与周围骨组织界线模糊，结合紧密 (图3)。植入12周后的骨缺损修复区，材料颗粒之间被大量的新生骨充满，植入区新骨与周围骨界线消失，出现较多的哈佛氏管样结构。新生骨结构趋近于原骨，材料与骨组织融合为一体 (图4)。
, 百拇医药
二、植入对照材料组的改变
对照材料植入1周后也可见纤维组织长入骨缺损区和部分新生的血管，但未见骨样细胞形成且较实验材料组的炎性反应重，中性粒细胞侵润明显。植入2周后可见纤维组织存在，材料-骨界面新骨形成不明显。植入4周在靠近骨壁处出现有新骨，但仍可见少量炎性细胞侵润。植入12周后，骨缺损区纤维组织明显减少，新生骨增多与原骨交错连接，界线不清，植入材料—骨界面结合紧密。
三、空白对照组的改变
空白对照组在术后1周、2周时为大量纤维组织增生，炎性反应明显，中性粒细胞侵润较多。4 周后靠近骨界面处有骨修复迹象，但大部分缺损区仍被纤维组织充满。植入12周后始出现骨性愈合，但缺损区内仍可见少量纤维组织。
讨论
一、低温等离子体表面活化处理技术的意义
, 百拇医药
等离子体被称为物质存在的第四种状态。由于它所进行的反应是在高激发状态下完成的，因而具有较高的化学活性和较高的能量。这时它若与其它物质表面的中性分子或原子接触，瞬间很容易产生接枝和交联而形成新的化合物，使低温下难以进行的反应得以实现。目前利用等离子化学反应的特性，将其引入生物医学工程领域，在提高生物材料的生物相容性方面显示了良好的前景[2]。本研究采用NH3、H2、N2混合气体，在电容耦合辉光放电等离子条件下，以其独特的化学反应，产生大量的活性基团，特别是将氨基基团接转到基体材料表面，形成人体所需要的化合物，提高了材料的生物活性[3]。当这些表面具有生物活性的骨修复材料植入机体后，能与机体一起参与新陈代谢，与体内组织细胞进行表面能量和物质交换，产生生物性结合，发挥生理功能。从而达到生物材料表面活性改性的目的。
二、含氨基结构骨修复材料的生物效应
, 百拇医药 含氨基结构的骨修复材料植入动物骨内后1周就有骨样细胞形成，这些早期形成的骨样细胞为新骨的形成提供了必需的组织学基础。同时这些细胞在参与体内钙代谢，在吸附、聚集钙离子的过程中，为新骨的早期形成和钙化发挥了积极的作用[3，4]。植入2周后就明显见到材料与骨界面之间有新骨形成。修复4周后新骨与原骨已无明显界线，二者之间形成紧密结合的骨性界面。而同期植入的未经活化处理的对照材料与骨界面之间新骨形成较实验材料晚。表明氨基在骨缺损修复中的作用是明显的，可能是它与钙结合成为可溶的高渗性的不电离化合物，使血液中结合钙浓度增加。有利于植入材料与人体组织形成牢固的结合[5，6]。上述研究结果显示出了含氨基结构材料能够具有生物活性，是一种提高材料生物效应的有效方法，对口腔材料学研究和临床应用均具有重要的作用。
图1 实验材料植入1周，材料—骨界面骨样细胞形成 40×1 图2 实验材料植入2周，材料—骨界面新骨形成 40×1 图3 实验材料植入4周，新骨、原骨融为一体 40×1 图4 实验材料植入12周，新骨结构趋近于原骨 40×1
, 百拇医药
参考文献
1 冉均国.羟基磷灰石种植材料的表面改性研究.生物医学工程通报， 1994，6:104-106.
2 浅井道彦，著.低温等离子体在医用材料上的应用.冉均国，译.生物医学工程杂志，1987，4:64-71.
3 Michael W, Ernest B. Histomophometry of bone apposition around three types of endosseous dental implants. J Oral Maxillofac Implants, 1992,7:491-496 .
4 Magnus G, Tomas A. A Histomorphometric study of unthreaded Hydroxyapatite-coated and Titanium-coated implants in rabbit bone. J Oral Maxillofac Implants,1992,7:485-490.
, 百拇医药
5 David ES. Histomorphometry of the dental implant-bone interface: one year results of a comparative investigation in dogs. J Oral Maxillofac Implants, 1994,9:501-511.
6 Takashi T, Kohei K. Periodontal tissue regeneration on the surface of synthetic hydroxyapatite implanted into root surface. J Periodontol, 1995,66:125-130.
(收稿：1997-08-28 修回：1998-03-16), 百拇医药
单位：610041 成都，华西医科大学口腔医学院(陈治清、张敏、邱静)；四川联合大学生物无机材料研究室(冉均国、郑昌琼、何锦涛)
关键词：生物活性；牙科材料；骨修复材料
中华口腔医学杂志/980514 【摘要】 目的 为提高植入材料的生物活性，研究植入材料对机体组织产生的生物效应。方法 采用低温等离子表面活化处理技术，将羟基磷灰石颗粒置于真空高压电场中，通入NH3、H2、N2混合气体，在电容耦合辉光放电的等离子体环境中，使材料表面瞬间获得活性氨基结构。再通过动物骨内埋植实验，按不同时期对材料—骨界面的变化作动态组织学观察。结果 材料经表面活性处理后，其表面获得新生活性基团，而对材料本体的形态和性能不产生任何影响，植入骨内后能使材料—骨界面早期形成新骨并具有明显的促进骨生长作用，达到骨性结合的目的。结论 低温等离子体活化处理是提高植入材料生物活性的一种有效途径和方法。
, 百拇医药
Histomorphologic study of the bone repair materials by using the cold plasma technique
Chen Zhiqing*， Zhang Min， Qiu Jing,et al.*College of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective The purpose of this article is to improve the biological activity of the implant pretreated by use of cold plasma technic and to investigate the biological effects after implanted into bone.Methods First, HA granular was set in the electric field with high voltage and vacuum, then the gaseous mixture of ammonia, hydrogen and nitrogen was led to. By coupled capacity glow discharge, the plasma was produced and the pretreatment was completed. In this way, the surface of HA granular may obtain active amino structure. Sequently, the material was implanted into bone of the animal and the dynamic changes at the material/bone interface were histologically observed. Results The active group was definitely formed on the surface of the material after pretreatment and there were no adverse effects on the morphology and properties of the base material . Furthermore, the early formation of new bone at the interface of the material/bone was detected, and obvious effects on facilitating bone growth and osseointegration were obtained. Conclusion The findings indicated that cold plasma pretreatment technic was an effective method to improve the biological activity of implant material.
, 百拇医药
【Key Words】 Biological activity Dental material Bone repair materials
随着现代生物技术的发展，探索和研究具有氨基酸、蛋白质等生物活性结构的骨修复材料，已成为国内外研究的前沿课题。为获得更接近骨的整体结构和生物性能的材料，我们采用颗粒型羟基磷灰石，经低温等离子体活化处理，得到含有氨基结构的植入材料，植入动物骨内。分期处死动物，取样，制片，通过光学显微镜观察材料—骨界面的组织学动态变化。结果表明，含有氨基结构的植入材料对骨的早期形成和骨性结合均具有明显的促进作用，显示了良好的应用前景。
材料和方法
一、材料
实验材料：选择粒度为250μm～350μm ， 密度为3.0g±0.05g/cm3的羟基磷灰石颗粒(华西医科大学口腔材料研究室提供)。将材料置于真空高压电场中，通入NH3、H2、N2混合气体，在电容耦合辉光放电的等离子环境中，使材料表面瞬间获得活性氨基结构，经X线光电子能谱和红外光谱测试确定[1]。低温等离子体活化处理仪由吉林省宏安电子仪器厂制造，JG-B-300型(0～300W ， 13.56MHz) ，1990年出厂。
, http://www.100md.com
对照材料：未经处理的颗粒状羟基磷灰石，经环氧乙烷消毒灭菌后备用。
二、实验方法
通过动物实验考察材料—骨界面结合情况的组织学动态变化。选用健康成年家犬4只，体重11kg～15kg，随机分为4个实验组，每组一只动物，充分利用不同部位进行骨缺损修复实验。实验部位选在下颌骨体部的外侧骨板区。自颏部中线至下颌角依次定位植入实验材料、对照材料并设空白对照。左右两侧定位区对称。
术前采用氯丙嗪2ml、氯胺酮25ml、阿托品1ml 作实验动物腹腔及肌肉内注射麻醉。术区备皮，常规消毒后沿左下颌骨下缘切开皮肤分离皮下组织和肌肉，暴露下颌骨下缘，切开骨膜后用涡轮机在外侧骨板区造成3个直径5mm、深2mm的骨缺损并将实验材料和对照材料植入骨缺损区内；空白对照组不填入任何材料。分层严密缝合。右侧与左侧同法进行。术后给予抗菌素预防感染。
, http://www.100md.com 在术后1周、2周、4周、12周分别处死动物，取骨缺损修复区和周围骨联合标本，用10%的甲醛液固定，脱钙液脱钙，石蜡包埋作常规组织学切片。采用HE和新三色法染色，在光学显微镜下观察植入材料—骨界面区的组织学动态变化。
结果
一、植入实验材料组的改变
光学显微镜下可见实验材料植入骨缺损区1周后即有骨样细胞形成。这些细胞呈放射状排列在植入材料与周围骨之间。细胞形态与邻近的成纤维细胞相似。材料与材料之间，材料与界面之间有大量纤维组织长入并可见一些新生血管及中性粒细胞侵润 (图1)。植入2周后，尤以新三色法染色可明显观察到骨缺损区除一些纤维组织外，在靠近骨壁处可见有新骨形成 (图2)。植入4周后，骨缺损修复区纤维组织明显减少，被新生骨所替代，新生骨与周围骨组织界线模糊，结合紧密 (图3)。植入12周后的骨缺损修复区，材料颗粒之间被大量的新生骨充满，植入区新骨与周围骨界线消失，出现较多的哈佛氏管样结构。新生骨结构趋近于原骨，材料与骨组织融合为一体 (图4)。
, 百拇医药
二、植入对照材料组的改变
对照材料植入1周后也可见纤维组织长入骨缺损区和部分新生的血管，但未见骨样细胞形成且较实验材料组的炎性反应重，中性粒细胞侵润明显。植入2周后可见纤维组织存在，材料-骨界面新骨形成不明显。植入4周在靠近骨壁处出现有新骨，但仍可见少量炎性细胞侵润。植入12周后，骨缺损区纤维组织明显减少，新生骨增多与原骨交错连接，界线不清，植入材料—骨界面结合紧密。
三、空白对照组的改变
空白对照组在术后1周、2周时为大量纤维组织增生，炎性反应明显，中性粒细胞侵润较多。4 周后靠近骨界面处有骨修复迹象，但大部分缺损区仍被纤维组织充满。植入12周后始出现骨性愈合，但缺损区内仍可见少量纤维组织。
讨论
一、低温等离子体表面活化处理技术的意义
, 百拇医药
等离子体被称为物质存在的第四种状态。由于它所进行的反应是在高激发状态下完成的，因而具有较高的化学活性和较高的能量。这时它若与其它物质表面的中性分子或原子接触，瞬间很容易产生接枝和交联而形成新的化合物，使低温下难以进行的反应得以实现。目前利用等离子化学反应的特性，将其引入生物医学工程领域，在提高生物材料的生物相容性方面显示了良好的前景[2]。本研究采用NH3、H2、N2混合气体，在电容耦合辉光放电等离子条件下，以其独特的化学反应，产生大量的活性基团，特别是将氨基基团接转到基体材料表面，形成人体所需要的化合物，提高了材料的生物活性[3]。当这些表面具有生物活性的骨修复材料植入机体后，能与机体一起参与新陈代谢，与体内组织细胞进行表面能量和物质交换，产生生物性结合，发挥生理功能。从而达到生物材料表面活性改性的目的。
二、含氨基结构骨修复材料的生物效应
, 百拇医药 含氨基结构的骨修复材料植入动物骨内后1周就有骨样细胞形成，这些早期形成的骨样细胞为新骨的形成提供了必需的组织学基础。同时这些细胞在参与体内钙代谢，在吸附、聚集钙离子的过程中，为新骨的早期形成和钙化发挥了积极的作用[3，4]。植入2周后就明显见到材料与骨界面之间有新骨形成。修复4周后新骨与原骨已无明显界线，二者之间形成紧密结合的骨性界面。而同期植入的未经活化处理的对照材料与骨界面之间新骨形成较实验材料晚。表明氨基在骨缺损修复中的作用是明显的，可能是它与钙结合成为可溶的高渗性的不电离化合物，使血液中结合钙浓度增加。有利于植入材料与人体组织形成牢固的结合[5，6]。上述研究结果显示出了含氨基结构材料能够具有生物活性，是一种提高材料生物效应的有效方法，对口腔材料学研究和临床应用均具有重要的作用。
图1 实验材料植入1周，材料—骨界面骨样细胞形成 40×1 图2 实验材料植入2周，材料—骨界面新骨形成 40×1 图3 实验材料植入4周，新骨、原骨融为一体 40×1 图4 实验材料植入12周，新骨结构趋近于原骨 40×1
, 百拇医药
参考文献
1 冉均国.羟基磷灰石种植材料的表面改性研究.生物医学工程通报， 1994，6:104-106.
2 浅井道彦，著.低温等离子体在医用材料上的应用.冉均国，译.生物医学工程杂志，1987，4:64-71.
3 Michael W, Ernest B. Histomophometry of bone apposition around three types of endosseous dental implants. J Oral Maxillofac Implants, 1992,7:491-496 .
4 Magnus G, Tomas A. A Histomorphometric study of unthreaded Hydroxyapatite-coated and Titanium-coated implants in rabbit bone. J Oral Maxillofac Implants,1992,7:485-490.
, 百拇医药
5 David ES. Histomorphometry of the dental implant-bone interface: one year results of a comparative investigation in dogs. J Oral Maxillofac Implants, 1994,9:501-511.
6 Takashi T, Kohei K. Periodontal tissue regeneration on the surface of synthetic hydroxyapatite implanted into root surface. J Periodontol, 1995,66:125-130.
(收稿：1997-08-28 修回：1998-03-16), 百拇医药