表面修饰对载环孢菌素A聚乳酸纳米粒体外细胞摄取和体内组织分布的影响
作者：王杰 张强 易翔 曹栋 黎洪珊 魏树礼
单位：北京大学药学院药剂学研究室，北京 100083
关键词：药物载体；纳米粒；环孢菌素类；药代动力学；巨噬细胞；腹膜；吞噬作用
北京医科大学学报000312 [摘 要] 目的：研究表面修饰对载环孢菌素A纳米粒体外细胞吞噬和体内组织分布的影响。方法：用3H-环孢菌素A制备了平均粒径为59 nm的聚乳酸纳米粒，采用物理吸附的方法分别用Brij 78、Myrj 53和Myrj 59 3种表面活性剂对其进行了表面修饰。以小鼠腹腔巨噬细胞为体外细胞模型，以一级昆明种小鼠为动物模型，分别做体外细胞吞噬实验和体内组织分布实验。结果：纳米粒组可使小鼠腹腔巨噬细胞对环孢菌素A的摄取值达溶液组的20倍，表面修饰可使小鼠腹腔巨噬细胞的摄取值明显减小。纳米粒组可使环孢菌素A在小鼠肝、脾的组织分布相对于环孢菌素A溶液组明显增加，表面修饰可使环孢菌素A在小鼠肝、脾的组织分布有不同程度的增加。结论：表面修饰可以显著改变载环孢菌素A聚乳酸纳米粒的体外细胞摄取和体内在网状内皮系统的组织分布。
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[中图分类号] R978 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0235-04
Effect of surface modification on the uptake of polylactic acid nanoparticles
loading cyclosporine A by cells in vitro and on the body distribution in vivo
WANG Jie，ZHANG Qiang，YI Xiang，LI Hong-Shan，WEI Shu-Li
(Department of Pharmaceutics,School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
CAO Dong
(Department of Pharmacology,School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of surface modification on the uptake of cyclosporine A loaded nanoparticles by cells in vitro and on the body distribution in vivo. Methods: The polylactic acid nanoparticles with a mean diameter of 59 nm were prepared with 3H-labelled cyclosporine A and then three surfactants: Brij 78, Myrj 53 and Myrj 59 were used to modify the surface of the nanoparticles by physical adsorption. The mouse peritoneal macrophages and 35 mice were used to investigate the uptake of nanoparticles by cells in vitro and body distribution in vivo respectively. Results: In in vitro experiment, a 20-fold increase of cpm value in mouse peritoneal macrophages was observed in cyclosporine A nanoparticles compared with that in the cyclosporine A solution. Surface modification was found to reduce the uptake of nanoparticles. In in vivo body distribution, a noticeable increase of cpm value in reticuloendothelial system (RES) was observed. Conclusion: Surface modification effectively altered the uptake of cyclosporine A loaded polylactic acid nanoparticles by cells in vitro and the body distribution in vivo.
, 百拇医药
KEY WORDS Drug carriers; Nanoparticles; Cyclosporines/pharmacokin; Macrophages, peritoneal; Phagocytosis▲
药物载体输送系统——主要指微球、纳米粒(nanoparticles, NP)、脂质体等亚微粒的研究已成为药剂学研究中非常活跃的领域， 在静脉给药时药物
载体输送系统亚微粒易被体内免疫系统的吞噬细胞作为异物而识别和吞噬，这些吞噬细胞主要为单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)，网状内皮系统(reticuloendothelial system, RES)中的肝和脾在吞噬这些亚微粒方面起了重要作用。如何减少或避免载体输送系统亚微粒在体内对吞噬细胞的趋向性及延长其在体内的循环时间；成为近年来的一个研究热点，其中对纳米粒进行表面修饰的研究日益活跃[1]。环孢菌素A(cyclosporine A, CyA)是一种具有强大免疫抑制作用的由11个氨基酸组成的环状多肽，CyA可以抑制巨噬细胞产生白细胞介素-1而产生免疫抑制作用[2]，因而研究巨噬细胞对载CyA纳米粒的吞噬摄取具有重要意义。本文以3H-标记的环孢菌素A(3H-CyA)制备了聚乳酸纳米粒(3H-CyA-NP)，采用物理吸附的方法用Brij 78(polyoxyethylene 20 stearyl ether)、Myrj 53(polyoxyethylene 50 stearate)和Myrj 59(polyoxyethylene 100 stearate)3种表面活性剂分别对3H-CyA-NP进行了表面修饰，以小鼠腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophage, MPM)为细胞模型，以一级昆明种小鼠为动物模型，研究表面修饰对载环孢菌素A聚乳酸纳米粒体外细胞摄取和体内分布的影响，并考察体外巨噬细胞对纳米粒的摄取与体内纳米粒对RES靶向作用的相关性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
3H-CyA(放化纯度大于90%，比放射强度1.85×1015 Bq.mol-1)，中国原子能科学研究院标记；聚乳酸(MW 1500)，山东医疗器械研究所；普朗尼克F68、Brij 78、Myrj 53和Myrj 59, Sigma公司； Triton X-100, FARCO Chemical Supplies, Hong Kong；PPO(2,5-Diphenyloxazole), Fluka 公司；分析纯过氯酸，天津市东方化工厂；分析纯双氧水，北京化工厂；二甲苯，北京益利精细化学品有限公司。
液闪计数仪：Parmacia WALLAC 1410(Turku, Finland);粒径测定和分析仪：Submicron Particle Sizer(Model 370, Santa Barbara, California, USA)。
, 百拇医药
一级昆明种小鼠由本校实验动物部提供。
1.2 载CyA聚乳酸纳米粒的制备
在50 ml无菌三角瓶中加入3H-CyA乙醇溶液0.36 ml(3.7×1010 Bq.L-1)，60℃水浴中以氮气吹干乙醇。在上述三角瓶中加入50 mg CyA、450 mg聚乳酸和50 ml丙酮，充分振荡，使瓶中各物质溶解,构成有机相。取普朗尼克F68 375 mg溶于150 ml注射用水中，构成水相。将有机相注入0～2℃的水相，所得半透明体系置60℃水浴中蒸发丙酮并浓缩至50 ml,即得3H-CyA-NP。用激光散射法于632.8 nm波长条件下测得此纳米粒的粒径为(59±11) nm。取该纳米粒混悬液用负染法拍透射电镜照片，观察其形态，结果见图1。
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图1 载环孢菌素A聚乳酸纳米粒透射电镜照片
[平均粒径(59±11) nm]
Figure 1 Electron transmission microphotography of CyA
loaded nanoparticles after negative staining [(59±11) nm]
各取3H-CyA-NP 5 ml，分别加入100 mg的Brij 78、Myrj 53和Myrj 59，超声震荡5 min，即得各表面修饰的载环孢菌素A的纳米粒。
1.3 MPM悬液的制备[3]
取(20±2)g昆明一级小鼠若干只，断颈处死，在无菌操作下，每只用5 ml冷Hank's液注入腹腔，按压腹腔壁100次(1 min)，吸出腹腔液。合并腹腔液摇匀，取样进行细胞计数，用含5%(体积分数)小牛血清的RPMI-1640液稀释至每毫升1×105备用。
, 百拇医药
1.4 MPM的体外摄取实验[3]
于10 ml离心管中分别加入MPM悬液1.0 ml和各样品0.5 ml，(37±0.5)℃水浴中培养30 min(每5 min振摇一次)，取出于冰浴中终止吞噬，离心(600×g,5 min)，弃去上清液。用生理盐水12 ml分次(4 ml×3)，洗涤，离心，弃去上清。其中一组只加MPM悬液1.0 ml作为细胞对照。
1.5 体内组织分布实验
取(20±2) g一级昆明小鼠35只，随机分成5组，按5 mg.kg-1环孢菌素A尾静脉给药。10 min后，断头取血0.1 ml，并取肝、脾和肾各50 mg于10 ml离心管中，消化后测定样品的每分计数值。另取一组小鼠，不给药，作为空白组织对照。
1.6 液体闪烁计数的测定
, 百拇医药
闪烁液的配制：取5 g PPO，加入Triton X-100 333 ml，再加入二甲苯至1 000 ml，摇匀备用。
于各实验样品离心管中，加入过氯酸0.2 ml，双氧水0.4 ml，密塞于75℃水浴中加热2 h，加入闪烁液10 ml，摇匀，测定样品的每分计数值。
1.7 统计学方法
测定结果以
±s表示，采用t化极差q法检验比较各组样品的细胞摄取和体内组织分布。
2 结果
2.1 各样品体外细胞摄取的比较(表1)
与3H-CyA-Sol相比，3H-NP可使MPM的摄取值明显增加(P<0.001)。与3H-NP相比，经表面活性剂修饰的各样品MPM摄取值明显减小(P<0.001),摄取值的从大到小顺序为3H-NP，3H-NP-Brij78，3H-NP-Myrj53和3H-NP-Myrj59，其中3H-NP-Myrj59的MPM的摄取值甚至小于3H-CyA-Sol的MPM的摄取值(P<0.05)，其它各样品的MPM的摄取值均大于3H-CyA-Sol的MPM的摄取值(P<0.01)。
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表1 各样品体外细胞摄取的比较(n=5,±s)
Table 1 Effect of surfactant coating on in vitro uptake of 3H-NP by mouse peritoneal macrophages at 37℃(n=5,±s) Samples
Surfactant
(HLB)
Surfactant
concentration(%)
, 百拇医药
A/Bq
(after 30 min)
Change#
(%)
Change*
(%)
3H-NP
None
7 616±394a
0.0
2 000
, 百拇医药
3H-NP-Brij78
Brij 78(15.3)
2.0
1 791±201b
-76.5
390
3H-NP-Myrj53
Myrj 53(17.9)
2.0
633±154c
-91.7
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75
3H-NP-Myrj59
Myrj 59(19.1)
2.0
268± 56d
-96.5
-26
3H-CyA-Sol
362± 84
0
3H-control
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776 276±60 184
Cell control
13±3
HLB, hydrophile-lipophile balance; A, (radio) activity; a, P<0.001 vs 3H-CyA-Sol; b, P<0.001 vs 3H-CyA-Sol, P<0.001 vs 3H-NP; c, P<0.05 vs 3H-CyA-Sol, P<0.001 vs 3H-NP; d, P<0.05 vs 3H-CyA-Sol, P<0.001 vs 3H-NP. #Change vs 3H-NP; *Change vs 3H-CyA-Sol. Surfactant was added after preparation of the sample. Then the samples were homogenized under ultrasonic for 5 min.
, 百拇医药
2.2 各样品的体内组织分布的比较(表2)
以各组织(50 mg)的每分计数值与血液(0.1 ml)的每分计数值的比值来衡量样品在各组织分布的大小。可见与3H-CyA-Sol相比，各样品在肝(P<0.01)、脾(P<0.05)的分布明显增加，在肾(P>0.1)的分布没有明显改变。与3H-NP相比，3H-NP-Brij78在肝(P>0.1)和脾(P>0.05)的分布没有明显改变；3H-NP-Myrj53和3H-NP-Myrj59在肝的分布明显增加(P<0.01)，而在脾的分布没有明显改变(P>0.05)；各样品在肾的分布改变不大(P>0.05)。
表2 各样品静脉注射后体内组织分布的比较(n=7,±s)
, 百拇医药
Table 2 Effect of surfactant coating on in vivo body distribution in mouse after intravenous administration (n=7,±s) Samples
A(after 10 min)$/Bq
A(tissue)/A(blood)
Change△
(%)
Change
(%)
, 百拇医药
Blood
Liver
Spleen
Kidney
Liver
Spleen
Kidney
3H-CyA-Sol
68± 7
262±85
72±26
174±36
, 百拇医药
3.8±0.8
1.0±0.3
2.5±0.3
0.0
3H-NP
56±10
325±33
90±23
144±17
5.9±0.5*
1.6±0.4#
2.6±0.2
, 百拇医药
23.9
0.0
3H-NP-Brij78
64±19
351±44
109±23
164±21
5.7±1.0**
1.8±0.5##
2.3±0.2
33.7
, 百拇医药 7.9
3H-NP-Myrj53
44± 6
370±75
106±14
143±10
7.4±0.2***
2.2±0.2###
3.2±0.1
41.1
13.9
3H-NP-Myrj59
, 百拇医药
50± 2
428±50
96±16
162± 7
8.5±0.8***
1.9±0.4###
3.2±0.1
63.1
31.7
Tissue control
4±1
4±1
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5±1
4±1
A, (radio) activity; *P<0.001 vs 3H-CyA-Sol; **P<0.001 vs 3H-CyA-Sol, P>0.1 vs 3H-NP; ***P<0.001 vs 3H-CyA-Sol, P<0.01 vs 3H-NP; #P<0.05 vs 3H-CyA-Sol; ##P<0.05 vs 3H-CyA-Sol, P>0.1 vs 3H-NP; ###P<0.01 vs 3H-CyA-Sol, P>0.05 vs 3H-NP. △Change vs 3H-CyA-Sol in liver, Change vs 3H-NP in liver. $The samples were injected into the tail vein, then the mouse was killed and the blood, liver, spleen and kidney were collected after 10 min.
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3 讨论
由本实验可见，将CyA包埋于纳米粒中可使MPM对3H-CyA的摄取值达对照组3H-CyA溶液的20倍。将NP用表面活性剂进行表面修饰可以减小吞噬细胞对纳米粒的吞噬作用[1]，本实验证明了用Brij 78、Myrj 53和Myrj 59对载CyA聚乳酸纳米粒用物理吸附法进行表面修饰可以减少巨噬细胞对纳米粒的吞噬作用(P<0.001)，由实验结果可见随着表面活性剂亲水性的增强[HLB(Myrj 59)>HLB(Myrj 53)>HLB(Brij 78)]，其降低巨噬细胞吞噬NP的作用也增大。用PEG对纳米粒进行表面修饰是近年来制备长循环纳米粒的一个热点[4]，Brij 78、Myrj 53和Myrj 59的亲水端为PEG长链结构，对应的PEG相对分子质量分别为1 000、2 000、5 000，由实验结果可见，随着PEG长链的增长，其降低巨噬细胞吞噬NP的作用也增大。
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NP在静脉给药时对RES具有一定的靶向性，通常情况下这种靶向性使纳米粒在静脉给药后的半衰期只有1～10 min，且很快地在肝和脾达到分布平衡，所以本实验用10 min时纳米粒在体内的分布能较准确地反映纳米粒在体内对RES的靶向情况[5]。
本实验证明了将CyA包埋于NP中相对于CyA溶液可以增加CyA在肝(P<0.01)和脾(P<0.05)的分布。由实验结果可以看出，在本实验条件下，对纳米粒进行表面修饰对肾的分布影响不大(P>0.05)，因而不能减少CyA对肾的毒副作用。
由于RES中吞噬细胞非常丰富，一般认为，如果NP在体外易被吞噬细胞摄取，则体内在RES的分布就多，反之亦然。有报道证明，用表面活性剂对纳米粒进行表面修饰可能减少纳米粒在体内对RES的靶向性[1]。但由实验结果可见用Myrj 53和Myrj 59对载CyA聚乳酸纳米粒用物理吸附法进行表面修饰后在体内没有减少而是增加了其对肝的靶向性，原因可能是本实验所制备的NP的粒径较小(59 nm)，粒径较小(<70 nm)的胶体亚微粒对肝的渗透性较强，渗透性的增强使NP在肝发生了主动的聚集，而表面修饰的结果是增加了这种渗透性[6]。本实验结果证明，一定的条件下NP用表面活性剂修饰后并不降低对RES的靶向性，且体外细胞摄取与体内RES中的分布之间缺乏相关性，因此，并不能在所有情况下用体外细胞摄取值来推测NP在体内对RES的靶向性。
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本研究首先是载体给药系统的研究，CyA是一个模型药物，将CyA包埋于纳米粒中对CyA可能产生的药理及动力学上的改变有待进一步的研究。将CyA包埋于普通纳米粒中，可以提高CyA对巨噬细胞的靶向性而提高免疫抑制作用，但其缺点是这将使CyA在体内的清除加快，而CyA的使用大多数情况下需要长期用药，且其毒副作用与剂量有关，半衰期的减小将不利于CyA的使用。CyA选择性抑制胸腺细胞及辅助T细胞是其免疫抑制的核心，而对巨噬细胞的作用仅起辅助作用，如果单纯提高CyA对巨噬细胞的靶向性无疑将限制其使用。如果将CyA包埋于长循环表面修饰的纳米粒中，将使CyA在体内的循环时间延长，即提高了生物利用度，而游离的CyA本身对免疫细胞具有靶向性，因而将CyA包埋于长循环纳米粒中相对于普通纳米粒而言表面上是降低了对巨噬细胞的靶向性，实际上可能是疗效的明显改善。总之，由于CyA和胶体亚微粒对巨噬细胞的共同靶向性，研究巨噬细胞对载CyA胶体亚微粒的摄取作用对于CyA胶体制剂的开发具有重要指导意义。■
基金项目：国家自然科学基金(39870897)资助项目。
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参考文献
[1]Gert S, Sheila DB, Toos D, et al. Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995,17:31-48
[2]Bunjes D, Hardt C, Rollinghoff M, et al. Cyclosporin A mediates immunosuppression of primary cytotoxic T cell responses by impairing the release of interleukin 1 and interleukin 2[J]. Eur J Immunol, 1981,11:657-661
, 百拇医药
[3]张强,廖工铁,魏大鹏，等.用毫微球增加体外小鼠腹腔巨噬细胞与大鼠肝细胞对庆大霉素的摄取[J]. 药学学报,1996,31:375-380
[4]Gref R, Domb PQ, Blunk T, et al. The controlled intravenous delivery of drugs using PEG-coated sterically stabilized nanospheres[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995,16：215-223
[5]Illum L, Davis SS, Müller RH, et al. The organ distribution and circulation time of intravenously injected colloidal carriers sterically stabilized with a block copolymer-Poloxamine 908[J]. Life Sci,1987,40,367-374
[6]Litzinger DC, Buiting AMJ, Van R, et al. Effect of lipsome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic PEG-containing liposomes[J]. Biochem Biophys Acta, 1994,1190:99-107
收稿日期：1999-06-01, 百拇医药
单位：北京大学药学院药剂学研究室，北京 100083
关键词：药物载体；纳米粒；环孢菌素类；药代动力学；巨噬细胞；腹膜；吞噬作用
北京医科大学学报000312 [摘 要] 目的：研究表面修饰对载环孢菌素A纳米粒体外细胞吞噬和体内组织分布的影响。方法：用3H-环孢菌素A制备了平均粒径为59 nm的聚乳酸纳米粒，采用物理吸附的方法分别用Brij 78、Myrj 53和Myrj 59 3种表面活性剂对其进行了表面修饰。以小鼠腹腔巨噬细胞为体外细胞模型，以一级昆明种小鼠为动物模型，分别做体外细胞吞噬实验和体内组织分布实验。结果：纳米粒组可使小鼠腹腔巨噬细胞对环孢菌素A的摄取值达溶液组的20倍，表面修饰可使小鼠腹腔巨噬细胞的摄取值明显减小。纳米粒组可使环孢菌素A在小鼠肝、脾的组织分布相对于环孢菌素A溶液组明显增加，表面修饰可使环孢菌素A在小鼠肝、脾的组织分布有不同程度的增加。结论：表面修饰可以显著改变载环孢菌素A聚乳酸纳米粒的体外细胞摄取和体内在网状内皮系统的组织分布。
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[中图分类号] R978 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0235-04
Effect of surface modification on the uptake of polylactic acid nanoparticles
loading cyclosporine A by cells in vitro and on the body distribution in vivo
WANG Jie，ZHANG Qiang，YI Xiang，LI Hong-Shan，WEI Shu-Li
(Department of Pharmaceutics,School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
CAO Dong
(Department of Pharmacology,School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of surface modification on the uptake of cyclosporine A loaded nanoparticles by cells in vitro and on the body distribution in vivo. Methods: The polylactic acid nanoparticles with a mean diameter of 59 nm were prepared with 3H-labelled cyclosporine A and then three surfactants: Brij 78, Myrj 53 and Myrj 59 were used to modify the surface of the nanoparticles by physical adsorption. The mouse peritoneal macrophages and 35 mice were used to investigate the uptake of nanoparticles by cells in vitro and body distribution in vivo respectively. Results: In in vitro experiment, a 20-fold increase of cpm value in mouse peritoneal macrophages was observed in cyclosporine A nanoparticles compared with that in the cyclosporine A solution. Surface modification was found to reduce the uptake of nanoparticles. In in vivo body distribution, a noticeable increase of cpm value in reticuloendothelial system (RES) was observed. Conclusion: Surface modification effectively altered the uptake of cyclosporine A loaded polylactic acid nanoparticles by cells in vitro and the body distribution in vivo.
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KEY WORDS Drug carriers; Nanoparticles; Cyclosporines/pharmacokin; Macrophages, peritoneal; Phagocytosis▲
药物载体输送系统——主要指微球、纳米粒(nanoparticles, NP)、脂质体等亚微粒的研究已成为药剂学研究中非常活跃的领域， 在静脉给药时药物
载体输送系统亚微粒易被体内免疫系统的吞噬细胞作为异物而识别和吞噬，这些吞噬细胞主要为单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)，网状内皮系统(reticuloendothelial system, RES)中的肝和脾在吞噬这些亚微粒方面起了重要作用。如何减少或避免载体输送系统亚微粒在体内对吞噬细胞的趋向性及延长其在体内的循环时间；成为近年来的一个研究热点，其中对纳米粒进行表面修饰的研究日益活跃[1]。环孢菌素A(cyclosporine A, CyA)是一种具有强大免疫抑制作用的由11个氨基酸组成的环状多肽，CyA可以抑制巨噬细胞产生白细胞介素-1而产生免疫抑制作用[2]，因而研究巨噬细胞对载CyA纳米粒的吞噬摄取具有重要意义。本文以3H-标记的环孢菌素A(3H-CyA)制备了聚乳酸纳米粒(3H-CyA-NP)，采用物理吸附的方法用Brij 78(polyoxyethylene 20 stearyl ether)、Myrj 53(polyoxyethylene 50 stearate)和Myrj 59(polyoxyethylene 100 stearate)3种表面活性剂分别对3H-CyA-NP进行了表面修饰，以小鼠腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophage, MPM)为细胞模型，以一级昆明种小鼠为动物模型，研究表面修饰对载环孢菌素A聚乳酸纳米粒体外细胞摄取和体内分布的影响，并考察体外巨噬细胞对纳米粒的摄取与体内纳米粒对RES靶向作用的相关性。
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1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
3H-CyA(放化纯度大于90%，比放射强度1.85×1015 Bq.mol-1)，中国原子能科学研究院标记；聚乳酸(MW 1500)，山东医疗器械研究所；普朗尼克F68、Brij 78、Myrj 53和Myrj 59, Sigma公司； Triton X-100, FARCO Chemical Supplies, Hong Kong；PPO(2,5-Diphenyloxazole), Fluka 公司；分析纯过氯酸，天津市东方化工厂；分析纯双氧水，北京化工厂；二甲苯，北京益利精细化学品有限公司。
液闪计数仪：Parmacia WALLAC 1410(Turku, Finland);粒径测定和分析仪：Submicron Particle Sizer(Model 370, Santa Barbara, California, USA)。
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一级昆明种小鼠由本校实验动物部提供。
1.2 载CyA聚乳酸纳米粒的制备
在50 ml无菌三角瓶中加入3H-CyA乙醇溶液0.36 ml(3.7×1010 Bq.L-1)，60℃水浴中以氮气吹干乙醇。在上述三角瓶中加入50 mg CyA、450 mg聚乳酸和50 ml丙酮，充分振荡，使瓶中各物质溶解,构成有机相。取普朗尼克F68 375 mg溶于150 ml注射用水中，构成水相。将有机相注入0～2℃的水相，所得半透明体系置60℃水浴中蒸发丙酮并浓缩至50 ml,即得3H-CyA-NP。用激光散射法于632.8 nm波长条件下测得此纳米粒的粒径为(59±11) nm。取该纳米粒混悬液用负染法拍透射电镜照片，观察其形态，结果见图1。
, 百拇医药
图1 载环孢菌素A聚乳酸纳米粒透射电镜照片
[平均粒径(59±11) nm]
Figure 1 Electron transmission microphotography of CyA
loaded nanoparticles after negative staining [(59±11) nm]
各取3H-CyA-NP 5 ml，分别加入100 mg的Brij 78、Myrj 53和Myrj 59，超声震荡5 min，即得各表面修饰的载环孢菌素A的纳米粒。
1.3 MPM悬液的制备[3]
取(20±2)g昆明一级小鼠若干只，断颈处死，在无菌操作下，每只用5 ml冷Hank's液注入腹腔，按压腹腔壁100次(1 min)，吸出腹腔液。合并腹腔液摇匀，取样进行细胞计数，用含5%(体积分数)小牛血清的RPMI-1640液稀释至每毫升1×105备用。
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1.4 MPM的体外摄取实验[3]
于10 ml离心管中分别加入MPM悬液1.0 ml和各样品0.5 ml，(37±0.5)℃水浴中培养30 min(每5 min振摇一次)，取出于冰浴中终止吞噬，离心(600×g,5 min)，弃去上清液。用生理盐水12 ml分次(4 ml×3)，洗涤，离心，弃去上清。其中一组只加MPM悬液1.0 ml作为细胞对照。
1.5 体内组织分布实验
取(20±2) g一级昆明小鼠35只，随机分成5组，按5 mg.kg-1环孢菌素A尾静脉给药。10 min后，断头取血0.1 ml，并取肝、脾和肾各50 mg于10 ml离心管中，消化后测定样品的每分计数值。另取一组小鼠，不给药，作为空白组织对照。
1.6 液体闪烁计数的测定
, 百拇医药
闪烁液的配制：取5 g PPO，加入Triton X-100 333 ml，再加入二甲苯至1 000 ml，摇匀备用。
于各实验样品离心管中，加入过氯酸0.2 ml，双氧水0.4 ml，密塞于75℃水浴中加热2 h，加入闪烁液10 ml，摇匀，测定样品的每分计数值。
1.7 统计学方法
测定结果以
±s表示，采用t化极差q法检验比较各组样品的细胞摄取和体内组织分布。2 结果
2.1 各样品体外细胞摄取的比较(表1)
与3H-CyA-Sol相比，3H-NP可使MPM的摄取值明显增加(P<0.001)。与3H-NP相比，经表面活性剂修饰的各样品MPM摄取值明显减小(P<0.001),摄取值的从大到小顺序为3H-NP，3H-NP-Brij78，3H-NP-Myrj53和3H-NP-Myrj59，其中3H-NP-Myrj59的MPM的摄取值甚至小于3H-CyA-Sol的MPM的摄取值(P<0.05)，其它各样品的MPM的摄取值均大于3H-CyA-Sol的MPM的摄取值(P<0.01)。
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表1 各样品体外细胞摄取的比较(n=5,
±s)Table 1 Effect of surfactant coating on in vitro uptake of 3H-NP by mouse peritoneal macrophages at 37℃(n=5,
±s) SamplesSurfactant
(HLB)
Surfactant
concentration(%)
, 百拇医药
A/Bq
(after 30 min)
Change#
(%)
Change*
(%)
3H-NP
None
7 616±394a
0.0
2 000
, 百拇医药
3H-NP-Brij78
Brij 78(15.3)
2.0
1 791±201b
-76.5
390
3H-NP-Myrj53
Myrj 53(17.9)
2.0
633±154c
-91.7
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75
3H-NP-Myrj59
Myrj 59(19.1)
2.0
268± 56d
-96.5
-26
3H-CyA-Sol
362± 84
0
3H-control
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776 276±60 184
Cell control
13±3
HLB, hydrophile-lipophile balance; A, (radio) activity; a, P<0.001 vs 3H-CyA-Sol; b, P<0.001 vs 3H-CyA-Sol, P<0.001 vs 3H-NP; c, P<0.05 vs 3H-CyA-Sol, P<0.001 vs 3H-NP; d, P<0.05 vs 3H-CyA-Sol, P<0.001 vs 3H-NP. #Change vs 3H-NP; *Change vs 3H-CyA-Sol. Surfactant was added after preparation of the sample. Then the samples were homogenized under ultrasonic for 5 min.
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2.2 各样品的体内组织分布的比较(表2)
以各组织(50 mg)的每分计数值与血液(0.1 ml)的每分计数值的比值来衡量样品在各组织分布的大小。可见与3H-CyA-Sol相比，各样品在肝(P<0.01)、脾(P<0.05)的分布明显增加，在肾(P>0.1)的分布没有明显改变。与3H-NP相比，3H-NP-Brij78在肝(P>0.1)和脾(P>0.05)的分布没有明显改变；3H-NP-Myrj53和3H-NP-Myrj59在肝的分布明显增加(P<0.01)，而在脾的分布没有明显改变(P>0.05)；各样品在肾的分布改变不大(P>0.05)。
表2 各样品静脉注射后体内组织分布的比较(n=7,
±s), 百拇医药
Table 2 Effect of surfactant coating on in vivo body distribution in mouse after intravenous administration (n=7,
±s) SamplesA(after 10 min)$/Bq
A(tissue)/A(blood)
Change△
(%)
Change
(%)
, 百拇医药
Blood
Liver
Spleen
Kidney
Liver
Spleen
Kidney
3H-CyA-Sol
68± 7
262±85
72±26
174±36
, 百拇医药
3.8±0.8
1.0±0.3
2.5±0.3
0.0
3H-NP
56±10
325±33
90±23
144±17
5.9±0.5*
1.6±0.4#
2.6±0.2
, 百拇医药
23.9
0.0
3H-NP-Brij78
64±19
351±44
109±23
164±21
5.7±1.0**
1.8±0.5##
2.3±0.2
33.7
, 百拇医药 7.9
3H-NP-Myrj53
44± 6
370±75
106±14
143±10
7.4±0.2***
2.2±0.2###
3.2±0.1
41.1
13.9
3H-NP-Myrj59
, 百拇医药
50± 2
428±50
96±16
162± 7
8.5±0.8***
1.9±0.4###
3.2±0.1
63.1
31.7
Tissue control
4±1
4±1
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5±1
4±1
A, (radio) activity; *P<0.001 vs 3H-CyA-Sol; **P<0.001 vs 3H-CyA-Sol, P>0.1 vs 3H-NP; ***P<0.001 vs 3H-CyA-Sol, P<0.01 vs 3H-NP; #P<0.05 vs 3H-CyA-Sol; ##P<0.05 vs 3H-CyA-Sol, P>0.1 vs 3H-NP; ###P<0.01 vs 3H-CyA-Sol, P>0.05 vs 3H-NP. △Change vs 3H-CyA-Sol in liver, Change vs 3H-NP in liver. $The samples were injected into the tail vein, then the mouse was killed and the blood, liver, spleen and kidney were collected after 10 min.
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3 讨论
由本实验可见，将CyA包埋于纳米粒中可使MPM对3H-CyA的摄取值达对照组3H-CyA溶液的20倍。将NP用表面活性剂进行表面修饰可以减小吞噬细胞对纳米粒的吞噬作用[1]，本实验证明了用Brij 78、Myrj 53和Myrj 59对载CyA聚乳酸纳米粒用物理吸附法进行表面修饰可以减少巨噬细胞对纳米粒的吞噬作用(P<0.001)，由实验结果可见随着表面活性剂亲水性的增强[HLB(Myrj 59)>HLB(Myrj 53)>HLB(Brij 78)]，其降低巨噬细胞吞噬NP的作用也增大。用PEG对纳米粒进行表面修饰是近年来制备长循环纳米粒的一个热点[4]，Brij 78、Myrj 53和Myrj 59的亲水端为PEG长链结构，对应的PEG相对分子质量分别为1 000、2 000、5 000，由实验结果可见，随着PEG长链的增长，其降低巨噬细胞吞噬NP的作用也增大。
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NP在静脉给药时对RES具有一定的靶向性，通常情况下这种靶向性使纳米粒在静脉给药后的半衰期只有1～10 min，且很快地在肝和脾达到分布平衡，所以本实验用10 min时纳米粒在体内的分布能较准确地反映纳米粒在体内对RES的靶向情况[5]。
本实验证明了将CyA包埋于NP中相对于CyA溶液可以增加CyA在肝(P<0.01)和脾(P<0.05)的分布。由实验结果可以看出，在本实验条件下，对纳米粒进行表面修饰对肾的分布影响不大(P>0.05)，因而不能减少CyA对肾的毒副作用。
由于RES中吞噬细胞非常丰富，一般认为，如果NP在体外易被吞噬细胞摄取，则体内在RES的分布就多，反之亦然。有报道证明，用表面活性剂对纳米粒进行表面修饰可能减少纳米粒在体内对RES的靶向性[1]。但由实验结果可见用Myrj 53和Myrj 59对载CyA聚乳酸纳米粒用物理吸附法进行表面修饰后在体内没有减少而是增加了其对肝的靶向性，原因可能是本实验所制备的NP的粒径较小(59 nm)，粒径较小(<70 nm)的胶体亚微粒对肝的渗透性较强，渗透性的增强使NP在肝发生了主动的聚集，而表面修饰的结果是增加了这种渗透性[6]。本实验结果证明，一定的条件下NP用表面活性剂修饰后并不降低对RES的靶向性，且体外细胞摄取与体内RES中的分布之间缺乏相关性，因此，并不能在所有情况下用体外细胞摄取值来推测NP在体内对RES的靶向性。
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本研究首先是载体给药系统的研究，CyA是一个模型药物，将CyA包埋于纳米粒中对CyA可能产生的药理及动力学上的改变有待进一步的研究。将CyA包埋于普通纳米粒中，可以提高CyA对巨噬细胞的靶向性而提高免疫抑制作用，但其缺点是这将使CyA在体内的清除加快，而CyA的使用大多数情况下需要长期用药，且其毒副作用与剂量有关，半衰期的减小将不利于CyA的使用。CyA选择性抑制胸腺细胞及辅助T细胞是其免疫抑制的核心，而对巨噬细胞的作用仅起辅助作用，如果单纯提高CyA对巨噬细胞的靶向性无疑将限制其使用。如果将CyA包埋于长循环表面修饰的纳米粒中，将使CyA在体内的循环时间延长，即提高了生物利用度，而游离的CyA本身对免疫细胞具有靶向性，因而将CyA包埋于长循环纳米粒中相对于普通纳米粒而言表面上是降低了对巨噬细胞的靶向性，实际上可能是疗效的明显改善。总之，由于CyA和胶体亚微粒对巨噬细胞的共同靶向性，研究巨噬细胞对载CyA胶体亚微粒的摄取作用对于CyA胶体制剂的开发具有重要指导意义。■
基金项目：国家自然科学基金(39870897)资助项目。
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参考文献
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[2]Bunjes D, Hardt C, Rollinghoff M, et al. Cyclosporin A mediates immunosuppression of primary cytotoxic T cell responses by impairing the release of interleukin 1 and interleukin 2[J]. Eur J Immunol, 1981,11:657-661
, 百拇医药
[3]张强,廖工铁,魏大鹏，等.用毫微球增加体外小鼠腹腔巨噬细胞与大鼠肝细胞对庆大霉素的摄取[J]. 药学学报,1996,31:375-380
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[5]Illum L, Davis SS, Müller RH, et al. The organ distribution and circulation time of intravenously injected colloidal carriers sterically stabilized with a block copolymer-Poloxamine 908[J]. Life Sci,1987,40,367-374
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收稿日期：1999-06-01, 百拇医药