边缘系创伤反应性髓鞘碱性蛋白表达与超微结构观察
作者：王庆松 嘉 莉 欧阳尧 陈曼娥
单位：王庆松 欧阳尧 成都军区总医院神经内科(成都 610083)；嘉 莉 成都军区总医院骨科；陈曼娥 第三军区大学大坪医院神经内科
关键词：大脑边缘系统；创伤和损伤；致脑炎碱性蛋白质类；超微结构
中国病理生理杂志990111 摘 要 目的：探讨创伤反应性中枢神经系统(CNS)间接受损的可能机制。方法：借助犬双后肢低、高速投射物致伤模型，观察了边缘系下丘脑、海马及颞顶区脑组织髓鞘碱性蛋白(MBP)表达及超微结构改变。结果：伤后8 h低速组下丘脑MBP-mRNA表达增强(P<0.01)；高速组下丘脑、海马MBP含量明显增高(P<0.01)，MBP-mRNA表达增强(P<0.01)；超微结构改变以高速组下丘脑、海马为著，多集中于神经元、神经纤维及毛细血管内皮细胞变化。结论：边缘系下丘脑、海马选择性易损，可能为创伤反应性CNS异常的重要病理生理基础。
, 百拇医药
The expression of trauma reactive myelin basic protein and
observation of ultrastructure in limbic system
WANG Qing-Song,JIA Li,OU-Yang Yao，CHEN Man-E
Department of Neurology,Chengdu General Hospital,Chengdu(610083)
Abstract AIM:To explore the probable mechanism of trauma reactive effects on the central nervous system(CNS).METHODS:On the basis of stress model with different velocity steel bullet injury to hind thighs of dogs,the expression of myelin basic protein(MBP) in limbic system,temporoparietal gray and white matters,and the early changes of their ultrastructure were observed.RESULTS：The expression of MBP-mRNA in hypothalamus in low speed group was significantly enhanced(P<0.05),MBP levels markedly increased(P<0.01) and the expression of MBP-mRNA was enhanced remarkably (P<0.01) in hypothalamus and hippocampus in high speed group 8 hours after trauma; and the early pathomorphism changes displayed some alterations in neurons, nerve fibers and capillary endothelium cells of limbic system in high grouop. CONCLUSION:Hypothalamus and hippocampus were vulnerably damaged in spite of no direct injury to head,and these may play a consistent pathophysiological role in the development of trauma reactive central nervous system disturbance.
, 百拇医药
MeSH Limbic system;Wounds and injuries;Encephalitogenic basic proteins; Ultrastructure
不少患者创伤虽未直接伤及大脑，却出现了一定程度的反应性神经、精神异常。部分伤员至创伤后期出现包括中枢神经系统(central nervous system,CNS)在内的多脏器功能衰竭[1，2]。认为可能与CNS间接受损有关[3，4]。鉴于目前探讨创伤反应性CNS异常的病理生理研究甚少，本实验借助犬双后肢低、高速投射物致伤模型，对边缘系下丘脑、海马及颞顶区灰、白质髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达与释放进行定量分析，结合其早期超微结构观察，为创伤后神经、精神异常等CNS反应提供实验依据。
材料与方法
一、实验动物及模型复制：
, 百拇医药
成年健康家犬22只，雌雄不拘，体重10.5～14.0 kg。伤前随机分为对照组(6只)低速组和高速组(各8只)。用戊巴比妥钠(30 mg/kg,iv)麻醉。1.03 g钢珠(5.56mm)室内靶道致伤，低、高速组撞击速度分别为625 m/s、1368 m/s。瞄准点在犬双后肢大腿肌肉发达处，尽量避免伤及股骨、大血管及神经干。伤后局部加压包扎止血。对照组除不致伤外，其余处理与致伤组相同。
二、观察指标：
对照、低速、高速3组动物分别随机取4、6、6只于伤后8 h活杀，取下丘脑、海马、颞顶区灰质、白质等处脑组织，分装，液氮保存。其余6只于伤后8 h以3%戊二醛颈内动脉灌注(压力控制于14.5～16.0 kPa)，取下丘脑、海马，一分HE染色；另一分包埋后超薄切片，双铅染色，JEM-100SX透射电镜观察。用MBP酶联免疫吸附试剂盒(华西医科大学提供)测定脑组织匀浆MBP含量。以地高辛配基随机引物法标记MBP-cRNA探针(600 bp)，采用一步快速热酚抽提法提取脑组织总RNA，按经典方法进行斑点杂交；用图像分析系统测定各点平均光密度，求其积分光密度值，以反映各点MBP-mRNA相对含量。
, 百拇医药
三、统计处理：
所有数据均以
±s表示。应用SPRM软件(第三军医大学)进行双因素方差分析。
结 果
(一)一般情况：高速组在投射物撞击速度、撞击能量、组织吸收能量等方面明显高于低速组(P<0.01)。低速组伤后1h内、高速组伤后6h内直肠温均显著低于伤前及对照组(P<0.01)；伤后8 h动态观察心率、呼吸、血压、CSF压力等变化均不明显(P>0.05)。
(二)脑组织MPB变化：低速组下丘脑MBP明显高于对照组(P<0.05)；高速组下丘脑、海马MBP显著高于其它两组(P<0.01)(表1)。
(三)脑组织MBP-mRNA斑点杂交：斑点杂交膜经图像分析表明低速组下丘脑MBP-mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)，高速组下丘脑、海马明显高于其它两组(P<0.01)(表2)。表1 下丘脑、海马、颞顶区脑组织区MBP含量
, 百拇医药
Tab 1 Contents of MBP in hypothalamus,hippocampus and temporoparietal grey and white matters(μg/g brain tissues,±s) Group
n
Hypothalamus
Hippocampus
Grey matter
White matter
Control
4
, 百拇医药
1.05±0.35
0.85±0.21
0.40±0.09
5.19±1.25
Low speed
6
4.00±0.83*
1.29±0.38
0.51±0.14
5.58±1.40
High speed
, 百拇医药 6
30.18±7.56**△△
4.25±0.92**△△
0.65±0.17
7.01±1.63
*P<0.05， *P<0.01， vs control group; △△ P<0.01， vs low speed group表2 MBP-mRNA斑点杂交信号积分光密度值
Tab 2 Integral optical density of MBP-mRNA dot blot hybridization signal(±s) Group
, http://www.100md.com
n
Hypothalamus
Hippocampus
Grey matter
White matter
Control
4
0.51±0.14
0.42±0.12
0.24±0.08
4.91±1.34
Low speed
, 百拇医药
6
3.40±1.22*
1.16±0.42
0.52±0.11
5.28±1.52
High speed
6
7.58±2.45**△△
4.23±1.42**△△
0.91±0.17
6.48±2.13
, http://www.100md.com
*P<0.05， **P<0.01， vs control group； △△ P<0.01， vs low speed group
(四)CNS超微结构改变：病变主要以边缘系下丘脑、海马为主，高速组神经元可见核仁碎裂，呈块状边聚，核膜皱缩、呈锯齿状突起，胞质内细胞器减少，内质网、线粒体空泡变性，间质水肿(图1)；毛细血管内皮细胞肿胀，突入管腔内，腔内红细胞瘀积，神经纤维髓鞘变性，呈葱皮样改变(图2)。低速组神经元结构改变不明显，仅见轻度间质水肿与髓鞘变性，线粒体肿胀较轻。颞顶区灰、白质未见明显病变。
Fig 1 Nucleolar margination in high speed group TEM×3 000
图1 高速组核仁碎裂边聚
, 百拇医药
Fig 2 swelling of capillary endothelium cell,and myelinic degeneration as lamellar structure in high speed group TEM×3 000
图2 高速组毛细血管内皮细胞肿胀，髓鞘变性呈葱皮样结构
讨 论
鉴于创伤反应性神经、精神异常的原因尚未确定[5]，本研究采用1.03 g钢珠标准致伤模型，创伤效应较稳定；选用高低两种致伤速度，产生两种不同强度的应激模型；以此探讨创伤反应性CNS异常的病理生理基础。
MBP是组成CNS髓鞘的主要蛋白质之一，约占其蛋白质总量的30%[6]。MBP含量测定，是标志CNS有无实质性损害较特异的监测指标，其含量高低在一定程度上反映损伤的范围及程度[7，8]。
, http://www.100md.com
我们以往的研究发现，肢体严重致伤后CSF、血清MBP释放增多，提示虽未直接伤及大脑，但CNS可能有不同程度、不同范围的应激性损伤[9]。本实验结果显示，伤后下丘脑、海马MBP不同程度增高，尤以下丘脑明显，提示上述脑区可能间接受损； 斑点杂交结果显示该处脑组织MBP-mRNA表达增强，提示由于局部肢体严重致伤，导致边缘系下丘脑、海马神经组织受损，致MBP释放增多，促使MBP-mRNA代偿性表达增强，以修复损伤组织；且随所施损伤强度不同，MBP-mRNA表达水平亦不同，提示所致的CNS的反应不同。CNS早期超微结构改变进一步揭示，肢体严重致伤，边缘系下丘脑、海马确有不同程度、不同范围受损，而颞顶区脑组织则未见明显病变，提示此二脑区可能为创伤反应性CNS易损区。
下丘脑、海马为边缘系统的重要组成部分。下丘脑控制着机体的多种重要机能活动，是内脏活动、内分泌与情绪行为之间维持平衡的中枢；海马为古皮质，与近期记忆、情绪反应、某些内脏活动有关；此二脑区受损，可能引起边缘系统功能失衡，导致一系列神经-内分泌功能紊乱及某些内脏、情绪活动障碍。本实验结果提示，边缘系下丘脑、海马选择性易损，可能为创伤反应性CNS异常的重要病理生理基础。
, 百拇医药
*“九五”军队医药卫生科研基金(No.96Q021)资助
参考文献
1 Grossman M.Received support and psychological adjustment in critically-injuried patients and their family.J Neurosci Nurs,1995,27(1):11.
2 Savic J,Lazarov A,Malicevic Z,et al.Relationship between early neuroendocrine response and severity of war injury according to the red cross classification.Vojnosanit Pregi,1995,52(2)：107.
, 百拇医药 3 Suneson A,Hansson HA,Seeman T.Pressure wave injuries to the nervous system caused by high-energy missile extremity impact:part Ⅱ.Distant effects on the central nervous system-a light and electron microscopic study on pigs.J Trauma,1990,30:295.
4 Hadfield JM,Yates DW,Kirkman E,et al.Regional cerebral blood flow and carbon dioxide reactivity after noncerebral injury in the rat. Circ Shock,1993,39(2):100.
5 刘荫秋，安波，李曙光，等.高速高能战创伤间接伤的特点及其致伤机理.中华创伤杂志，1995，11(2)：22.
, 百拇医药
6 Mendz GL,Barden JA,Martenson RE.Conformation of a tetradecapeptide epitope of myelin basic protein.Eur J Biochem,1995,231(3):659.
7 王庆松，陈曼娥.髓鞘碱性蛋白与中枢神经系统损害.国外医学神经病学神经外科学分册，1995，22(6)：306.
8 Yamazaki Y,Yada K,Morii S,et al.Diagnostic significance of serum neuro-specific endase and myelin basic protein assay in patients with acute head injury.Surg Neurol,1995,43(3):267.
9 王庆松，陈曼娥，琚亚非.肢体火器伤神经体液髓鞘碱性蛋白释放表达实验研究.中华创伤杂志，1996，12(3)：187.
收稿日期：1997年元月6日
修稿日期：1997年7月7日
, 百拇医药
单位：王庆松 欧阳尧 成都军区总医院神经内科(成都 610083)；嘉 莉 成都军区总医院骨科；陈曼娥 第三军区大学大坪医院神经内科
关键词：大脑边缘系统；创伤和损伤；致脑炎碱性蛋白质类；超微结构
中国病理生理杂志990111 摘 要 目的：探讨创伤反应性中枢神经系统(CNS)间接受损的可能机制。方法：借助犬双后肢低、高速投射物致伤模型，观察了边缘系下丘脑、海马及颞顶区脑组织髓鞘碱性蛋白(MBP)表达及超微结构改变。结果：伤后8 h低速组下丘脑MBP-mRNA表达增强(P<0.01)；高速组下丘脑、海马MBP含量明显增高(P<0.01)，MBP-mRNA表达增强(P<0.01)；超微结构改变以高速组下丘脑、海马为著，多集中于神经元、神经纤维及毛细血管内皮细胞变化。结论：边缘系下丘脑、海马选择性易损，可能为创伤反应性CNS异常的重要病理生理基础。
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The expression of trauma reactive myelin basic protein and
observation of ultrastructure in limbic system
WANG Qing-Song,JIA Li,OU-Yang Yao，CHEN Man-E
Department of Neurology,Chengdu General Hospital,Chengdu(610083)
Abstract AIM:To explore the probable mechanism of trauma reactive effects on the central nervous system(CNS).METHODS:On the basis of stress model with different velocity steel bullet injury to hind thighs of dogs,the expression of myelin basic protein(MBP) in limbic system,temporoparietal gray and white matters,and the early changes of their ultrastructure were observed.RESULTS：The expression of MBP-mRNA in hypothalamus in low speed group was significantly enhanced(P<0.05),MBP levels markedly increased(P<0.01) and the expression of MBP-mRNA was enhanced remarkably (P<0.01) in hypothalamus and hippocampus in high speed group 8 hours after trauma; and the early pathomorphism changes displayed some alterations in neurons, nerve fibers and capillary endothelium cells of limbic system in high grouop. CONCLUSION:Hypothalamus and hippocampus were vulnerably damaged in spite of no direct injury to head,and these may play a consistent pathophysiological role in the development of trauma reactive central nervous system disturbance.
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MeSH Limbic system;Wounds and injuries;Encephalitogenic basic proteins; Ultrastructure
不少患者创伤虽未直接伤及大脑，却出现了一定程度的反应性神经、精神异常。部分伤员至创伤后期出现包括中枢神经系统(central nervous system,CNS)在内的多脏器功能衰竭[1，2]。认为可能与CNS间接受损有关[3，4]。鉴于目前探讨创伤反应性CNS异常的病理生理研究甚少，本实验借助犬双后肢低、高速投射物致伤模型，对边缘系下丘脑、海马及颞顶区灰、白质髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达与释放进行定量分析，结合其早期超微结构观察，为创伤后神经、精神异常等CNS反应提供实验依据。
材料与方法
一、实验动物及模型复制：
, 百拇医药
成年健康家犬22只，雌雄不拘，体重10.5～14.0 kg。伤前随机分为对照组(6只)低速组和高速组(各8只)。用戊巴比妥钠(30 mg/kg,iv)麻醉。1.03 g钢珠(5.56mm)室内靶道致伤，低、高速组撞击速度分别为625 m/s、1368 m/s。瞄准点在犬双后肢大腿肌肉发达处，尽量避免伤及股骨、大血管及神经干。伤后局部加压包扎止血。对照组除不致伤外，其余处理与致伤组相同。
二、观察指标：
对照、低速、高速3组动物分别随机取4、6、6只于伤后8 h活杀，取下丘脑、海马、颞顶区灰质、白质等处脑组织，分装，液氮保存。其余6只于伤后8 h以3%戊二醛颈内动脉灌注(压力控制于14.5～16.0 kPa)，取下丘脑、海马，一分HE染色；另一分包埋后超薄切片，双铅染色，JEM-100SX透射电镜观察。用MBP酶联免疫吸附试剂盒(华西医科大学提供)测定脑组织匀浆MBP含量。以地高辛配基随机引物法标记MBP-cRNA探针(600 bp)，采用一步快速热酚抽提法提取脑组织总RNA，按经典方法进行斑点杂交；用图像分析系统测定各点平均光密度，求其积分光密度值，以反映各点MBP-mRNA相对含量。
, 百拇医药
三、统计处理：
所有数据均以
±s表示。应用SPRM软件(第三军医大学)进行双因素方差分析。结 果
(一)一般情况：高速组在投射物撞击速度、撞击能量、组织吸收能量等方面明显高于低速组(P<0.01)。低速组伤后1h内、高速组伤后6h内直肠温均显著低于伤前及对照组(P<0.01)；伤后8 h动态观察心率、呼吸、血压、CSF压力等变化均不明显(P>0.05)。
(二)脑组织MPB变化：低速组下丘脑MBP明显高于对照组(P<0.05)；高速组下丘脑、海马MBP显著高于其它两组(P<0.01)(表1)。
(三)脑组织MBP-mRNA斑点杂交：斑点杂交膜经图像分析表明低速组下丘脑MBP-mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)，高速组下丘脑、海马明显高于其它两组(P<0.01)(表2)。表1 下丘脑、海马、颞顶区脑组织区MBP含量
, 百拇医药
Tab 1 Contents of MBP in hypothalamus,hippocampus and temporoparietal grey and white matters(μg/g brain tissues,
±s) Groupn
Hypothalamus
Hippocampus
Grey matter
White matter
Control
4
, 百拇医药
1.05±0.35
0.85±0.21
0.40±0.09
5.19±1.25
Low speed
6
4.00±0.83*
1.29±0.38
0.51±0.14
5.58±1.40
High speed
, 百拇医药 6
30.18±7.56**△△
4.25±0.92**△△
0.65±0.17
7.01±1.63
*P<0.05， *P<0.01， vs control group; △△ P<0.01， vs low speed group表2 MBP-mRNA斑点杂交信号积分光密度值
Tab 2 Integral optical density of MBP-mRNA dot blot hybridization signal(
±s) Group, http://www.100md.com
n
Hypothalamus
Hippocampus
Grey matter
White matter
Control
4
0.51±0.14
0.42±0.12
0.24±0.08
4.91±1.34
Low speed
, 百拇医药
6
3.40±1.22*
1.16±0.42
0.52±0.11
5.28±1.52
High speed
6
7.58±2.45**△△
4.23±1.42**△△
0.91±0.17
6.48±2.13
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*P<0.05， **P<0.01， vs control group； △△ P<0.01， vs low speed group
(四)CNS超微结构改变：病变主要以边缘系下丘脑、海马为主，高速组神经元可见核仁碎裂，呈块状边聚，核膜皱缩、呈锯齿状突起，胞质内细胞器减少，内质网、线粒体空泡变性，间质水肿(图1)；毛细血管内皮细胞肿胀，突入管腔内，腔内红细胞瘀积，神经纤维髓鞘变性，呈葱皮样改变(图2)。低速组神经元结构改变不明显，仅见轻度间质水肿与髓鞘变性，线粒体肿胀较轻。颞顶区灰、白质未见明显病变。
Fig 1 Nucleolar margination in high speed group TEM×3 000
图1 高速组核仁碎裂边聚
, 百拇医药
Fig 2 swelling of capillary endothelium cell,and myelinic degeneration as lamellar structure in high speed group TEM×3 000
图2 高速组毛细血管内皮细胞肿胀，髓鞘变性呈葱皮样结构
讨 论
鉴于创伤反应性神经、精神异常的原因尚未确定[5]，本研究采用1.03 g钢珠标准致伤模型，创伤效应较稳定；选用高低两种致伤速度，产生两种不同强度的应激模型；以此探讨创伤反应性CNS异常的病理生理基础。
MBP是组成CNS髓鞘的主要蛋白质之一，约占其蛋白质总量的30%[6]。MBP含量测定，是标志CNS有无实质性损害较特异的监测指标，其含量高低在一定程度上反映损伤的范围及程度[7，8]。
, http://www.100md.com
我们以往的研究发现，肢体严重致伤后CSF、血清MBP释放增多，提示虽未直接伤及大脑，但CNS可能有不同程度、不同范围的应激性损伤[9]。本实验结果显示，伤后下丘脑、海马MBP不同程度增高，尤以下丘脑明显，提示上述脑区可能间接受损； 斑点杂交结果显示该处脑组织MBP-mRNA表达增强，提示由于局部肢体严重致伤，导致边缘系下丘脑、海马神经组织受损，致MBP释放增多，促使MBP-mRNA代偿性表达增强，以修复损伤组织；且随所施损伤强度不同，MBP-mRNA表达水平亦不同，提示所致的CNS的反应不同。CNS早期超微结构改变进一步揭示，肢体严重致伤，边缘系下丘脑、海马确有不同程度、不同范围受损，而颞顶区脑组织则未见明显病变，提示此二脑区可能为创伤反应性CNS易损区。
下丘脑、海马为边缘系统的重要组成部分。下丘脑控制着机体的多种重要机能活动，是内脏活动、内分泌与情绪行为之间维持平衡的中枢；海马为古皮质，与近期记忆、情绪反应、某些内脏活动有关；此二脑区受损，可能引起边缘系统功能失衡，导致一系列神经-内分泌功能紊乱及某些内脏、情绪活动障碍。本实验结果提示，边缘系下丘脑、海马选择性易损，可能为创伤反应性CNS异常的重要病理生理基础。
, 百拇医药
*“九五”军队医药卫生科研基金(No.96Q021)资助
参考文献
1 Grossman M.Received support and psychological adjustment in critically-injuried patients and their family.J Neurosci Nurs,1995,27(1):11.
2 Savic J,Lazarov A,Malicevic Z,et al.Relationship between early neuroendocrine response and severity of war injury according to the red cross classification.Vojnosanit Pregi,1995,52(2)：107.
, 百拇医药 3 Suneson A,Hansson HA,Seeman T.Pressure wave injuries to the nervous system caused by high-energy missile extremity impact:part Ⅱ.Distant effects on the central nervous system-a light and electron microscopic study on pigs.J Trauma,1990,30:295.
4 Hadfield JM,Yates DW,Kirkman E,et al.Regional cerebral blood flow and carbon dioxide reactivity after noncerebral injury in the rat. Circ Shock,1993,39(2):100.
5 刘荫秋，安波，李曙光，等.高速高能战创伤间接伤的特点及其致伤机理.中华创伤杂志，1995，11(2)：22.
, 百拇医药
6 Mendz GL,Barden JA,Martenson RE.Conformation of a tetradecapeptide epitope of myelin basic protein.Eur J Biochem,1995,231(3):659.
7 王庆松，陈曼娥.髓鞘碱性蛋白与中枢神经系统损害.国外医学神经病学神经外科学分册，1995，22(6)：306.
8 Yamazaki Y,Yada K,Morii S,et al.Diagnostic significance of serum neuro-specific endase and myelin basic protein assay in patients with acute head injury.Surg Neurol,1995,43(3):267.
9 王庆松，陈曼娥，琚亚非.肢体火器伤神经体液髓鞘碱性蛋白释放表达实验研究.中华创伤杂志，1996，12(3)：187.
收稿日期：1997年元月6日
修稿日期：1997年7月7日
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