柴胡皂甙对肝细胞增殖及基质合成的实验研究
作者：陈 爽 贲长恩 杨美娟 于世瀛 赵丽云 赵福建
单位：陈 爽 贲长恩 杨美娟 于世瀛 赵丽云 赵福建(北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京 100029)
关键词：柴胡皂甙；肝细胞；细胞外基质；细胞培养；免疫细胞化学；图像分析仪定量
中国中医基础医学杂志990509 摘 要 目的 研究柴胡皂甙对原代培养肝细胞(HC)增殖及合成细胞外基质(ECM)的作用，为进一步阐明柴胡皂甙防治肝损伤和抗肝纤维化的机理提供实验依据。方法 电镜观察、免疫细胞化学及图像分析仪检测HC内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白(FN)含量，流式细胞仪测定HC内的DNA含量和3H-脯氨酸掺入量未检测HC内胶原蛋白总量。结果 TKCncm各组对细胞损伤得到改善，各实验组HC内3H-脯氨酸掺入量均明显升高，各治疗组HC内DNA含量显著升高，而3H-脯氨酸掺入量均呈现降低趋势。HC内I型胶原含量明显减少，其余各组基质成分含量呈下降趋势。结论 柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用；表现为与相应实验组HC内DNA含量内呈上升趋势；胶原蛋白总量及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和FN含量及其合成受到抑制，从而抑制了HC对ECM的合成。
, http://www.100md.com
中图分类号：
The Experiment of Saikosaponin to Hepatocytes Proliferation and Matrix Synthesis
Chen Shuang Ben Changen Yang Meijuan et al
(Department of Histology & Embryology, Beijing university of Chinese Medicine and
Pharmacology Beijing 100029)
Abstract: Object:We studied that saikosaponin effected to primary cuiture hepatocytes proliferation and extracellular matrix synthesis.It provided experiment basis for further explanation mechanism of saikosaponin prevention and treatment hepatic injury and anti-hepatic tibrosis.Methods:we used electronmicroscope immunocytochemistry and image pattern anaiysis to detection collagen type Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ and fibronectin content in hepatocytes,H-proline incorporation content to detection collagen protein content in hepatocytes.Results:Every group of TKCnem can improve cells injury.All experiment group H-proline incorporation content in hepatocytes increased obviously,H-proline incorporation content appeared to come down tendentiously,collagen type I content in hepatooytes deereased obviously,another groups matrix content ap1 ared descending tendentiously.Conclusion:Saikosaponin has protection effect to liver cells.It expressed that relevant experiment groups DNA content in hepalocytes appcared aseending tendentiously,collagen protein and collagen types Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ and tibronectin contents decreased,and their synthesis were inhibited;so saikosaponin inhibited hepatocytes synthesis extracellular matrix.
, 百拇医药
Key words:Saikosaponin, Hepatocyte, Extracellular Matrix, Cell Cuiture Immunocytochemistry, Image Pattern Anaiysis Fixed Quantity
柴胡皂甙的抗炎、保肝、镇痛、增强免疫机能等效应，已为临床及实验研究所证实[1～4]。但有关其抗肝纤维化的作用及其作用机制，尤其是在外体培养条件下柴胡皂甙对HC合成ECM的干预作用尚未见报道。本文在肝脏细胞间调节网络的实验研究[5～7]基础上进一步就柴胡皂甙对HC增殖及合成ECM进行了实验研究[8、9]。
材料与方法
1 动物与试剂
应用雄性Wistar大鼠，以CCl4与橄榄油等量混合，皮下注射一次(150μl/g体重)4d后用于实验，试剂全部为Sigma公司提供，ABC试剂盒、兔抗鼠二抗、猪抗兔二抗为DAKO公司提供；3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究所。
, 百拇医药
2 HC、KC、FSC分离与培养
分离HC、KC选用体重140g～180g大鼠；分离FSC选用体重450g～550g大鼠，HC、KC分别由正常和CCl4损伤大鼠分离获得， FSC则由正常大鼠分离获取。分离、培养方法同前[5～7]。
3 条件培养液的制备
分别由正常、CCl4损伤大鼠分离HC、KC培养后提取培养液，分别记作HCncm、KCncm、KCtcm；由正常大鼠分离FSC，培养后分别提取“静息”FSC、自发激活的FSC培养液，分别记作FSCncm、 FSCtcm，制备方法同前[5、6、7]。
4 实验分组
各实验组FSC以含有10%胎牛血清的DMEM培养48h后，分别换用稀释度为1∶4的KC、HC各条件培养液，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/ml柴胡皂甙，以后每膈48h换液，以同样条件继续培养，至8d取样进行各项指标检测(表1)。
, 百拇医药
表1 培养大鼠FSC的实验分组及处理方法 分 组
培养0h
培养48h
培养第8天
条件培养液
柴胡皂甙(50μ g/ml)
对照
DMEM
—
—
取样检测
T对照
, 百拇医药 DMEM
-
+
取样检测
KCncm
DMEM
KCncm
-
取样检测
TKCncm
DMEM
KCncm
+
, 百拇医药
取样检测
KCtcm
DMEM
KCtcm
-
取样检测
TKCtcm
DMEM
KCtcm
+
取样检测
HCncm
DMEM
, 百拇医药
HCncm
-
取样检测
THCncm
DMEM
HCncm
+
取样检测
HCtcm
DMEM
HCtcm
-
取样检测
, 百拇医药
THCtcm
DMEM
HCtcm
+
取样检测
KCncm+HCncm
DMEM
KCncm+HCncm
-
取样检测
TKCncm+HCncm
DMEM
KCncm+HCncm
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+
取样检测
KCncm+HCtcm
DMEM
KCncm+HCtcm
-
取样检测
TKCncm+HCtcm
DMEM
KCncm+HCtcm
+
取样检测
, 百拇医药 各实验组HC以含有10%小牛MEM培养液培养4h后，分别换用无血清MEM培养液及稀释度为1∶4的KC、FSC条件培养基培养，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/ml柴胡皂甙，24h后取样，进行各项指标检测(实验分别见表2)。表2 培养大鼠HC的实验分组及处理方法 分 组
培养0h
培养48h
培养第24h
条件培养液
柴胡皂甙(50μ g/ml)
对照
MEM
—
—
, 百拇医药
取样检测
T对照
MEM
-
+
取样检测
KCncm
MEM
KCncm
-
取样检测
TKCncm
MEM
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KCncm
+
取样检测
KCtcm
MEM
KCtcm
-
取样检测
TKCtcm
MEM
KCtcm
+
取样检测
, http://www.100md.com
FSCncm
MEM
FSCncm
-
取样检测
TFSCncm
MEM
FSCncm
+
取样检测
FSCtcm
MEM
FSCtcm
, 百拇医药
-
取样检测
TFSCtcm
MEM
FSCtcm
+
取样检测
5 透射电镜标本制备
常规清洗，3%戊二醛磷酸缓冲液固定，离心，再固定，脱水，树脂包埋，薄切80nm，电子染色，JEM—1200EX电镜观察。
6 流式细胞仪检测细胞内DNA含量
弃去培养液，加入0.25%胰酶200μl～400μl，在倒置显微镜下观察，细胞稍变圆时，加入30μl～50μl小牛血清终止清化。用吸管反复吹打，200r/min，离心7min收集细胞，加入3ml～4ml无Ca2+、Mg2+PBS液，离心7min。弃上清，约留0.5ml细胞悬液，振荡使细胞分离。用注射器迅速将细胞注入70%4℃冷乙醇中，置4℃冰箱固定至少18h。调细胞悬液为106个/ml，加入RNA酶A(每样品50μg/ml)，于37℃水浴中孵育30min后，立即放入冰箱中，终止RNA酶的作用。加入50μg/ml碘化丙啶液，进行DNA染色。上机前尼龙网过滤。BECTON FACS420流式细胞仪，在激发光为480nm，发射光为585nm条件下，检测DNA含量。
, 百拇医药
7 3H-脯氨酸掺入检测
每孔加入3H-脯氨酸1μci/ml。培养48h后弃去培养液，加入0.25%胰酶90μl，倒置显微镜下观察，细胞变圆后加入10μl小牛血清，吹打细胞至脱壁，49型玻璃纤维滤纸收集细胞，美国Beckman LS5801型液体闪烁计数仪进行胶原蛋白合成总量的检测。
8 免疫细胞化学及图像分析
以稀释度为1∶4的不同条件培养基培养24h后，取出盖玻片，用ABC免疫酶法分别检测细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和FN，并用美国TN∶8502图像分析测量[7]。结果
1 电镜观察
KCcm各组HC内均可见核周隙增宽，内质网扩张，脱颗粒，胞质内可见胶原原纤维；FSCtem组细胞内内质网明显增多，轻度扩张，FSCncm组细胞生长良好，可见有丝分裂，TKCcm各组细胞核间隙和内质网基本恢复。
, 百拇医药
2 HC内DNA含量检测
KCncm、 KCtcm、 FSCtcm及HC内DNA均呈下调趋势，而FSCncm则明显上调。与相应的实验组相比，TKCncm、TKCtcm、 TFSCtcm各组DNA含量则分别升高24%、53%、43%，TFSCncm组DNA含量也趋于升量(表3)。
3 HC内胶原蛋白总量的检测
与对照组相比，各实验组HC内3H-脯氨酸掺入量均明显升高(表4)；而TKCncm、 TKCtcm、 TFSCtcm、 TFSCncm各组分别下降21%、22%、33%、15%，与实验组相比均有统计学意义(表3)。
表3 各组HC内DNA含量及3H-脯氨酸掺入量(
±s) HC培养条件
, 百拇医药
DNA含量(道数) n=3
3H-脯氨酸掺入量(CPM) n=4
治疗组
实验组
实验组
治疗组
MEM
141.17±22.06
160.31±29.30
138.67±8.50
150.31±19.30
, 百拇医药 KCncm
103.02±12.29
134.88±12.07△
167.47±15.55★
132.10±10.64△
KCtcm
79.64±10.15★
122.00±21.06△
192.66±22.43★
149.61±11.36△
, 百拇医药
FSCncm
323.83±20.31★★
342.30±29.48
222.33±29.50★★
189.77±15.00
FSCtcm
99.36±11.49★
141.63±18.49△
112.02±9.23★
74.83±11.49△
, 百拇医药
注：与MEM处理组比较：★P<0.05,★★P<0.01；与各组相应实验组比较：△P<0.05,△△P<0.01。
4 胶原免疫细胞化学观察
Ⅰ型胶原：各实验组HC内I型胶原在胞质内含有丰富的棕褐色阳性反应颗粒。与对照组相比，除FSCncm组无明显变化外，其余各组其阳性反应明显增强(表4)，而各相应治疗组其阳性反应颗粒减少，反应强度减弱，其中TKCncm、 TKCtcm、 TSFCtcm组分别下降16%、15%、18%，具有统计学意义(表4)。Ⅲ型胶原：各实验组HC内Ⅲ型胶原阳性反应颗粒在胞质内含量较多，呈棕褐色，与实验组相比，TKCncm、TFSCtcm组Ⅲ型胶原含量分别下降19%、18%，具有统计学意义(表4)。Ⅳ型胶原：与Ⅰ、Ⅲ型胶原相比，各治疗组中除FSCncm组外，其余各组阳性反应均明显增强(表4)。各治疗组Ⅳ型胶原含量均有所下降(表4)。
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表4 各组HC Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量(±s) HC培养条件n=6
Ⅰ型胶原含量(MOD)
Ⅳ型胶原含量(MOD)
Ⅳ型胶原含量(x±s)
实验组
治疗组
实验组
治疗组
实验组
治疗组
MEM
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232.44±24.67
119.95±116.01
205.02±25.63
225.41±20.46
124.53±25.76
117.23±18.21
KCncm
280.92±14.73★
237.32±12.29△
261.33±21.14★
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210.77±19.64△
203.06±23.86★
152.20±18.22△
KCtcm
404.58±29.61★★★
346.30±20.41
300.47±33.86★
269.48±19.82△
229.45±32.65★
, 百拇医药
184.91±21.31
FSCncm
242.84±17.43
219.25±14.13△
212.56±12.17
229.40±25.74
110.22±7.76
130.10±14.41
FSCtcm
308.24±17.71★
252.89±20.95△
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298.12±19.24★★
246.09±21.01△
194.68±17.37★
169.34±11.13
注：与DMEM组比较：★P<0.05,★★P<0.01；与各组相应实验组比较：△P<0.05,△△P<0.01。
5 FN各实验组HC内FN呈棕褐色阳性反应较强，充满于胞质内
与对照组相比，除FSCncm组外，其余各组均明显增强(表5)。而治疗组TKCncm、TKCtcm、TFSCtcm组较实验组FN含量均呈下降趋势(表5)。
, 百拇医药
表5 各实验组HC内FN含量(±s) FSC培养
条件n=6
FN含量(MOD)
实验组
治疗组
MEM
254.66±26.71
280.35±17.16
KCncm
312.18±20.15★
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272.73±20.49
KCtcm
366.38±31.22★
332.52±20.64
FSCncm
242.18±19.51
270.25±23.90
FSCtcm
347.95±25.38★
301.55±26.19
注：与DMEM处理组比较：★P<0.05,★★P<0.01；与各组相应实验组比较：△P<0.05。
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讨论
肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，其起始于HC坏死，随之是炎症反应、纤维生成介质释放、FSC激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡，导致细胞外基质过度蓄积为必然结局。在此过程中，HC坏死是纤维化发生的前提，KC是继之发生的FSC激活级联反应及ECM沉积的重要中介细胞，而FSC的激活则是纤维化启动和迁延的关键所在。因此，如能有效地防止HC损伤和坏死，阻断KC及其释放的有关因子的中介作用，抑制FSC的激活，即能有效地抑制肝纤维化的发生、发展进程。本实验就是以柴胡皂甙对体外培养细胞观察其对HC增殖及细胞外基质合成的影响。
本实验结果表明，柴胡皂甙可改变KCcm诱发的HC核周隙增宽，核变形，内质网扩张等膜系统的损伤性改变，下调激活的KC、FSC条件培养对HC中DNA合成具有抑制效应，与相应的实验组相比，TKCncm、TKCtcm、TFSCtcm组DNA含量分别升高31%、53%和14%，这不仅从形态学方面证实了柴胡皂甙对HC的保护作用与其稳定细胞膜系统有关，而且提供柴胡皂甙可中和激活的KC及FSC释放可溶性细胞因子对HC增殖的抑制效应，从而间接上调HC有丝分裂的相对活性，改善HC的功能，我们曾证实了KC对FSC激活的上调效应，并论证了HC、KC在FSC激活过程中的协调作用[5、6、7、9]。
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柴胡皂甙可抑制HC内ECM的合成，3H-脯氨酸掺入量显示TKCncm、TKCtcm及TFSCtcm组胶原蛋白合成总量明显下降，与相应实验组相比具有统计学意义(表3)。免疫组化证明，各治疗组HC内I型胶原含量明显减少，与相应实验组相比TKCncm、TKCtcm、TFSCtcm组具有统计学意义(表4)。故提示：①柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用，这与其稳定HC膜系统、中和可溶性细胞因子对HC增殖的抑制效应有关；②柴胡皂甙也可直接抑制FSC DNA合成及中和可溶性细胞因子促增殖效应，抑制FSC的增殖，直接或间接地抑制FSC合成ECM的能力。
* 国家教委博士点科研基金资助
参考文献
[1] 范金茹，贺石林，王行宽.参附注射液与柴胡注射液抗脂质过氧化的作用.中成药 1991； 13(2)：25
[2] 迁冈悦二.初代培养大鼠肝细胞中和汉药作用机理的研究——柴胡皂甙对体外实验中CCl4肝损伤的影响.国外医学.中医中药分册 1983；5(6)：50
, 百拇医药
[3] Liu, YP, Liu J,JiaXS. et al. Protective effects of fulovotopentosides on acetaminopheninduced hepatotoxicity. Acta Pharmacol. Sin, 1992; 13(3):209
[4] 于庆海，万立萍.柴胡皂甙抗炎作用初探.沈阳药学院学报 1986； 3(1)：14
[5] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.KC对原代培养FSC激活的调节作用.解剖学杂志(待发表).
[6] 陈爽，贲长恩，赵丽云，等.HC和KC在贮脂细胞激活过程中的协同作用(待发表).
[7] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.KC和FSC对肝细胞增殖及合成功能的影响.解剖科学进展(待发表).
[8] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.芍药甙对实验性大鼠培养肝细胞损伤的防治作用的形态学及生物化学研究.中西医结合肝病杂志 1997；7(4)：217
[9] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.柴胡皂甙对FSC激活级合成细胞外基质的实验研究.北京中医药大学学报(待发表).
(收稿日期 1998—07—15 修回日期 1998—12—16), 百拇医药
单位：陈 爽 贲长恩 杨美娟 于世瀛 赵丽云 赵福建(北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京 100029)
关键词：柴胡皂甙；肝细胞；细胞外基质；细胞培养；免疫细胞化学；图像分析仪定量
中国中医基础医学杂志990509 摘 要 目的 研究柴胡皂甙对原代培养肝细胞(HC)增殖及合成细胞外基质(ECM)的作用，为进一步阐明柴胡皂甙防治肝损伤和抗肝纤维化的机理提供实验依据。方法 电镜观察、免疫细胞化学及图像分析仪检测HC内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白(FN)含量，流式细胞仪测定HC内的DNA含量和3H-脯氨酸掺入量未检测HC内胶原蛋白总量。结果 TKCncm各组对细胞损伤得到改善，各实验组HC内3H-脯氨酸掺入量均明显升高，各治疗组HC内DNA含量显著升高，而3H-脯氨酸掺入量均呈现降低趋势。HC内I型胶原含量明显减少，其余各组基质成分含量呈下降趋势。结论 柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用；表现为与相应实验组HC内DNA含量内呈上升趋势；胶原蛋白总量及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和FN含量及其合成受到抑制，从而抑制了HC对ECM的合成。
, http://www.100md.com
中图分类号：
The Experiment of Saikosaponin to Hepatocytes Proliferation and Matrix Synthesis
Chen Shuang Ben Changen Yang Meijuan et al
(Department of Histology & Embryology, Beijing university of Chinese Medicine and
Pharmacology Beijing 100029)
Abstract: Object:We studied that saikosaponin effected to primary cuiture hepatocytes proliferation and extracellular matrix synthesis.It provided experiment basis for further explanation mechanism of saikosaponin prevention and treatment hepatic injury and anti-hepatic tibrosis.Methods:we used electronmicroscope immunocytochemistry and image pattern anaiysis to detection collagen type Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ and fibronectin content in hepatocytes,H-proline incorporation content to detection collagen protein content in hepatocytes.Results:Every group of TKCnem can improve cells injury.All experiment group H-proline incorporation content in hepatocytes increased obviously,H-proline incorporation content appeared to come down tendentiously,collagen type I content in hepatooytes deereased obviously,another groups matrix content ap1 ared descending tendentiously.Conclusion:Saikosaponin has protection effect to liver cells.It expressed that relevant experiment groups DNA content in hepalocytes appcared aseending tendentiously,collagen protein and collagen types Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ and tibronectin contents decreased,and their synthesis were inhibited;so saikosaponin inhibited hepatocytes synthesis extracellular matrix.
, 百拇医药
Key words:Saikosaponin, Hepatocyte, Extracellular Matrix, Cell Cuiture Immunocytochemistry, Image Pattern Anaiysis Fixed Quantity
柴胡皂甙的抗炎、保肝、镇痛、增强免疫机能等效应，已为临床及实验研究所证实[1～4]。但有关其抗肝纤维化的作用及其作用机制，尤其是在外体培养条件下柴胡皂甙对HC合成ECM的干预作用尚未见报道。本文在肝脏细胞间调节网络的实验研究[5～7]基础上进一步就柴胡皂甙对HC增殖及合成ECM进行了实验研究[8、9]。
材料与方法
1 动物与试剂
应用雄性Wistar大鼠，以CCl4与橄榄油等量混合，皮下注射一次(150μl/g体重)4d后用于实验，试剂全部为Sigma公司提供，ABC试剂盒、兔抗鼠二抗、猪抗兔二抗为DAKO公司提供；3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究所。
, 百拇医药
2 HC、KC、FSC分离与培养
分离HC、KC选用体重140g～180g大鼠；分离FSC选用体重450g～550g大鼠，HC、KC分别由正常和CCl4损伤大鼠分离获得， FSC则由正常大鼠分离获取。分离、培养方法同前[5～7]。
3 条件培养液的制备
分别由正常、CCl4损伤大鼠分离HC、KC培养后提取培养液，分别记作HCncm、KCncm、KCtcm；由正常大鼠分离FSC，培养后分别提取“静息”FSC、自发激活的FSC培养液，分别记作FSCncm、 FSCtcm，制备方法同前[5、6、7]。
4 实验分组
各实验组FSC以含有10%胎牛血清的DMEM培养48h后，分别换用稀释度为1∶4的KC、HC各条件培养液，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/ml柴胡皂甙，以后每膈48h换液，以同样条件继续培养，至8d取样进行各项指标检测(表1)。
, 百拇医药
表1 培养大鼠FSC的实验分组及处理方法 分 组
培养0h
培养48h
培养第8天
条件培养液
柴胡皂甙(50μ g/ml)
对照
DMEM
—
—
取样检测
T对照
, 百拇医药 DMEM
-
+
取样检测
KCncm
DMEM
KCncm
-
取样检测
TKCncm
DMEM
KCncm
+
, 百拇医药
取样检测
KCtcm
DMEM
KCtcm
-
取样检测
TKCtcm
DMEM
KCtcm
+
取样检测
HCncm
DMEM
, 百拇医药
HCncm
-
取样检测
THCncm
DMEM
HCncm
+
取样检测
HCtcm
DMEM
HCtcm
-
取样检测
, 百拇医药
THCtcm
DMEM
HCtcm
+
取样检测
KCncm+HCncm
DMEM
KCncm+HCncm
-
取样检测
TKCncm+HCncm
DMEM
KCncm+HCncm
, http://www.100md.com
+
取样检测
KCncm+HCtcm
DMEM
KCncm+HCtcm
-
取样检测
TKCncm+HCtcm
DMEM
KCncm+HCtcm
+
取样检测
, 百拇医药 各实验组HC以含有10%小牛MEM培养液培养4h后，分别换用无血清MEM培养液及稀释度为1∶4的KC、FSC条件培养基培养，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/ml柴胡皂甙，24h后取样，进行各项指标检测(实验分别见表2)。表2 培养大鼠HC的实验分组及处理方法 分 组
培养0h
培养48h
培养第24h
条件培养液
柴胡皂甙(50μ g/ml)
对照
MEM
—
—
, 百拇医药
取样检测
T对照
MEM
-
+
取样检测
KCncm
MEM
KCncm
-
取样检测
TKCncm
MEM
, http://www.100md.com
KCncm
+
取样检测
KCtcm
MEM
KCtcm
-
取样检测
TKCtcm
MEM
KCtcm
+
取样检测
, http://www.100md.com
FSCncm
MEM
FSCncm
-
取样检测
TFSCncm
MEM
FSCncm
+
取样检测
FSCtcm
MEM
FSCtcm
, 百拇医药
-
取样检测
TFSCtcm
MEM
FSCtcm
+
取样检测
5 透射电镜标本制备
常规清洗，3%戊二醛磷酸缓冲液固定，离心，再固定，脱水，树脂包埋，薄切80nm，电子染色，JEM—1200EX电镜观察。
6 流式细胞仪检测细胞内DNA含量
弃去培养液，加入0.25%胰酶200μl～400μl，在倒置显微镜下观察，细胞稍变圆时，加入30μl～50μl小牛血清终止清化。用吸管反复吹打，200r/min，离心7min收集细胞，加入3ml～4ml无Ca2+、Mg2+PBS液，离心7min。弃上清，约留0.5ml细胞悬液，振荡使细胞分离。用注射器迅速将细胞注入70%4℃冷乙醇中，置4℃冰箱固定至少18h。调细胞悬液为106个/ml，加入RNA酶A(每样品50μg/ml)，于37℃水浴中孵育30min后，立即放入冰箱中，终止RNA酶的作用。加入50μg/ml碘化丙啶液，进行DNA染色。上机前尼龙网过滤。BECTON FACS420流式细胞仪，在激发光为480nm，发射光为585nm条件下，检测DNA含量。
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7 3H-脯氨酸掺入检测
每孔加入3H-脯氨酸1μci/ml。培养48h后弃去培养液，加入0.25%胰酶90μl，倒置显微镜下观察，细胞变圆后加入10μl小牛血清，吹打细胞至脱壁，49型玻璃纤维滤纸收集细胞，美国Beckman LS5801型液体闪烁计数仪进行胶原蛋白合成总量的检测。
8 免疫细胞化学及图像分析
以稀释度为1∶4的不同条件培养基培养24h后，取出盖玻片，用ABC免疫酶法分别检测细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和FN，并用美国TN∶8502图像分析测量[7]。结果
1 电镜观察
KCcm各组HC内均可见核周隙增宽，内质网扩张，脱颗粒，胞质内可见胶原原纤维；FSCtem组细胞内内质网明显增多，轻度扩张，FSCncm组细胞生长良好，可见有丝分裂，TKCcm各组细胞核间隙和内质网基本恢复。
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2 HC内DNA含量检测
KCncm、 KCtcm、 FSCtcm及HC内DNA均呈下调趋势，而FSCncm则明显上调。与相应的实验组相比，TKCncm、TKCtcm、 TFSCtcm各组DNA含量则分别升高24%、53%、43%，TFSCncm组DNA含量也趋于升量(表3)。
3 HC内胶原蛋白总量的检测
与对照组相比，各实验组HC内3H-脯氨酸掺入量均明显升高(表4)；而TKCncm、 TKCtcm、 TFSCtcm、 TFSCncm各组分别下降21%、22%、33%、15%，与实验组相比均有统计学意义(表3)。
表3 各组HC内DNA含量及3H-脯氨酸掺入量(
±s) HC培养条件, 百拇医药
DNA含量(道数) n=3
3H-脯氨酸掺入量(CPM) n=4
治疗组
实验组
实验组
治疗组
MEM
141.17±22.06
160.31±29.30
138.67±8.50
150.31±19.30
, 百拇医药 KCncm
103.02±12.29
134.88±12.07△
167.47±15.55★
132.10±10.64△
KCtcm
79.64±10.15★
122.00±21.06△
192.66±22.43★
149.61±11.36△
, 百拇医药
FSCncm
323.83±20.31★★
342.30±29.48
222.33±29.50★★
189.77±15.00
FSCtcm
99.36±11.49★
141.63±18.49△
112.02±9.23★
74.83±11.49△
, 百拇医药
注：与MEM处理组比较：★P<0.05,★★P<0.01；与各组相应实验组比较：△P<0.05,△△P<0.01。
4 胶原免疫细胞化学观察
Ⅰ型胶原：各实验组HC内I型胶原在胞质内含有丰富的棕褐色阳性反应颗粒。与对照组相比，除FSCncm组无明显变化外，其余各组其阳性反应明显增强(表4)，而各相应治疗组其阳性反应颗粒减少，反应强度减弱，其中TKCncm、 TKCtcm、 TSFCtcm组分别下降16%、15%、18%，具有统计学意义(表4)。Ⅲ型胶原：各实验组HC内Ⅲ型胶原阳性反应颗粒在胞质内含量较多，呈棕褐色，与实验组相比，TKCncm、TFSCtcm组Ⅲ型胶原含量分别下降19%、18%，具有统计学意义(表4)。Ⅳ型胶原：与Ⅰ、Ⅲ型胶原相比，各治疗组中除FSCncm组外，其余各组阳性反应均明显增强(表4)。各治疗组Ⅳ型胶原含量均有所下降(表4)。
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表4 各组HC Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量(
±s) HC培养条件n=6Ⅰ型胶原含量(MOD)
Ⅳ型胶原含量(MOD)
Ⅳ型胶原含量(x±s)
实验组
治疗组
实验组
治疗组
实验组
治疗组
MEM
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232.44±24.67
119.95±116.01
205.02±25.63
225.41±20.46
124.53±25.76
117.23±18.21
KCncm
280.92±14.73★
237.32±12.29△
261.33±21.14★
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210.77±19.64△
203.06±23.86★
152.20±18.22△
KCtcm
404.58±29.61★★★
346.30±20.41
300.47±33.86★
269.48±19.82△
229.45±32.65★
, 百拇医药
184.91±21.31
FSCncm
242.84±17.43
219.25±14.13△
212.56±12.17
229.40±25.74
110.22±7.76
130.10±14.41
FSCtcm
308.24±17.71★
252.89±20.95△
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298.12±19.24★★
246.09±21.01△
194.68±17.37★
169.34±11.13
注：与DMEM组比较：★P<0.05,★★P<0.01；与各组相应实验组比较：△P<0.05,△△P<0.01。
5 FN各实验组HC内FN呈棕褐色阳性反应较强，充满于胞质内
与对照组相比，除FSCncm组外，其余各组均明显增强(表5)。而治疗组TKCncm、TKCtcm、TFSCtcm组较实验组FN含量均呈下降趋势(表5)。
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表5 各实验组HC内FN含量(
±s) FSC培养条件n=6
FN含量(MOD)
实验组
治疗组
MEM
254.66±26.71
280.35±17.16
KCncm
312.18±20.15★
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272.73±20.49
KCtcm
366.38±31.22★
332.52±20.64
FSCncm
242.18±19.51
270.25±23.90
FSCtcm
347.95±25.38★
301.55±26.19
注：与DMEM处理组比较：★P<0.05,★★P<0.01；与各组相应实验组比较：△P<0.05。
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讨论
肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，其起始于HC坏死，随之是炎症反应、纤维生成介质释放、FSC激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡，导致细胞外基质过度蓄积为必然结局。在此过程中，HC坏死是纤维化发生的前提，KC是继之发生的FSC激活级联反应及ECM沉积的重要中介细胞，而FSC的激活则是纤维化启动和迁延的关键所在。因此，如能有效地防止HC损伤和坏死，阻断KC及其释放的有关因子的中介作用，抑制FSC的激活，即能有效地抑制肝纤维化的发生、发展进程。本实验就是以柴胡皂甙对体外培养细胞观察其对HC增殖及细胞外基质合成的影响。
本实验结果表明，柴胡皂甙可改变KCcm诱发的HC核周隙增宽，核变形，内质网扩张等膜系统的损伤性改变，下调激活的KC、FSC条件培养对HC中DNA合成具有抑制效应，与相应的实验组相比，TKCncm、TKCtcm、TFSCtcm组DNA含量分别升高31%、53%和14%，这不仅从形态学方面证实了柴胡皂甙对HC的保护作用与其稳定细胞膜系统有关，而且提供柴胡皂甙可中和激活的KC及FSC释放可溶性细胞因子对HC增殖的抑制效应，从而间接上调HC有丝分裂的相对活性，改善HC的功能，我们曾证实了KC对FSC激活的上调效应，并论证了HC、KC在FSC激活过程中的协调作用[5、6、7、9]。
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柴胡皂甙可抑制HC内ECM的合成，3H-脯氨酸掺入量显示TKCncm、TKCtcm及TFSCtcm组胶原蛋白合成总量明显下降，与相应实验组相比具有统计学意义(表3)。免疫组化证明，各治疗组HC内I型胶原含量明显减少，与相应实验组相比TKCncm、TKCtcm、TFSCtcm组具有统计学意义(表4)。故提示：①柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用，这与其稳定HC膜系统、中和可溶性细胞因子对HC增殖的抑制效应有关；②柴胡皂甙也可直接抑制FSC DNA合成及中和可溶性细胞因子促增殖效应，抑制FSC的增殖，直接或间接地抑制FSC合成ECM的能力。
* 国家教委博士点科研基金资助
参考文献
[1] 范金茹，贺石林，王行宽.参附注射液与柴胡注射液抗脂质过氧化的作用.中成药 1991； 13(2)：25
[2] 迁冈悦二.初代培养大鼠肝细胞中和汉药作用机理的研究——柴胡皂甙对体外实验中CCl4肝损伤的影响.国外医学.中医中药分册 1983；5(6)：50
, 百拇医药
[3] Liu, YP, Liu J,JiaXS. et al. Protective effects of fulovotopentosides on acetaminopheninduced hepatotoxicity. Acta Pharmacol. Sin, 1992; 13(3):209
[4] 于庆海，万立萍.柴胡皂甙抗炎作用初探.沈阳药学院学报 1986； 3(1)：14
[5] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.KC对原代培养FSC激活的调节作用.解剖学杂志(待发表).
[6] 陈爽，贲长恩，赵丽云，等.HC和KC在贮脂细胞激活过程中的协同作用(待发表).
[7] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.KC和FSC对肝细胞增殖及合成功能的影响.解剖科学进展(待发表).
[8] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.芍药甙对实验性大鼠培养肝细胞损伤的防治作用的形态学及生物化学研究.中西医结合肝病杂志 1997；7(4)：217
[9] 陈爽，贲长恩，杨美娟，等.柴胡皂甙对FSC激活级合成细胞外基质的实验研究.北京中医药大学学报(待发表).
(收稿日期 1998—07—15 修回日期 1998—12—16), 百拇医药