抗人血管生长素噬菌体基因工程单链抗体的初步制备*
作者：张宏斌 江悦华 王 捷 李建军 赖声礼 杨太成 吴锦银 李 明|, http://www.100md.com
单位：张宏斌 赖声礼(华南理工大学 广州市 510641)；江悦华 王 捷 李建军 杨太成 吴锦银 李 明(广州军区总医院医学实验科 广州市 510010)|, http://www.100md.com
关键词：噬菌体抗体 血管生长素 制备|, http://www.100md.com
免疫学杂志990421摘 要 采用PCR等分子克隆实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体可变区重、轻链基因，以DNA接头连接后与噬菌粒pCANTAB5E重组转化大肠杆菌形成抗体可变区基因库。通过噬菌体表面表达技术把抗体可变区表达在噬菌体表面。|, http://www.100md.com
中图号 R392.11|, http://www.100md.com
PREPARATION OF THE PHAGE GENETICENGINEERING|, http://www.100md.com
ANTIBODY OF ANTI-HUMAN ANGIOGENIN|, http://www.100md.com
Zhang Hongbin，Jiang Yuehua，Wang Jie，Li Jianjun，Lai Shengli，Yang Taicheng，Wu Jinyin，Li Ming|, http://www.100md.com
(South China University of Technology， Guangzhou 510641)|, http://www.100md.com
Abstract The phage display antibody of anti-human angiogenin was a new and high effective antibody prepared by using the technique of surface display phage antibody library.By using molecular biological methods such as PCR et al，immunoglobulin variable region genes were amplified from angiogenin mouse hybridomas.The heavy and light chain DNA products were assembled into a single gene by using a DNA linker.The anti-angiogenin single DNA fragment was ligated into a phage vector pCANTAB5E，and the recombinant vector was subsequently transformed into E.coli TG1 cells for construction of phage display libraries of anti-angiogenin.By phage rescue、affinity selection、reinfection and screening methods，the anti-angiogenin phage geneticengineering single chain antibody of defined specificity and affinity was obtained.
Key words Phage antibody，Angiogenin，Preparation5i[}*r, 百拇医药
血管生长素(Angiogenin，ANG)是一种存在于正常人血浆及实体肿瘤组织中的蛋白质[1]，它具有很强的促血管生长作用。大量研究表明：ANG与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系[2]。ANG单抗可以通过中和ANG或阻断ANG与血管内皮细胞受体结合而实现其抑瘤作用[3]；ANG单抗对ANG依赖型恶性肿瘤有重要的临床应用价值。但以杂交瘤技术制备ANG单抗存在周期长、费用高、产量低等缺点，而噬菌体抗体技术具有克隆筛选简捷、抗体制备方便、及易进行抗体基因修饰操作等优点[4]。本文通过抗人ANG噬菌体基因工程抗体制备的研究，将为临床提供一种经济有效的新型抗体打下基础。5i[}*r, 百拇医药
1 材料和方法5i[}*r, 百拇医药
1.1 材料5i[}*r, 百拇医药
1.1.1 ANG小鼠杂交瘤细胞系：本实验室自行构建。5i[}*r, 百拇医药
1.1.2 重组噬菌体基因工程抗体试剂盒：内含扩增抗体重、轻链可变区cDNA的特异性PCR引物Heavy primer1，Heavy primer2，Light primer Mix及组装ScFv的PCR引物linker primer mix，ES primer mix；克隆及表达噬菌体载体pCANTAB5E；宿主菌E.coli TG1及辅助噬菌体M13K07等。购自pharmacia公司。5i[}*r, 百拇医药
1.1.3 逆转录试剂盒、dNTP、NotΙ、SfiI限制性内切酶为pharmacia公司产品；T4DNA连接酶、TaqDNA多聚酶为promega公司产品；胰蛋白胨及酵母提取物为OXOID公司产品；NaCl等试剂均为国产分析纯。5i[}*r, 百拇医药
1.2 方法5i[}*r, 百拇医药
1.2.1 抗体重、轻链可变区cDNA的获取：从小鼠ANG杂交瘤细胞制备mRNA，采用oligo-dT纤维素纯化。逆转录合成cDNA第一链，同时做两份。第一链反应产物中，分别加重、轻链引物PCR扩增。5i[}*r, 百拇医药
1.2.2 重、轻链可变区cDNA PCR扩增产物的纯化：扩增产物于1.5%琼脂糖电泳分离后，采用微管柱纯化法回收340bp及325bp DNA片段。
1.2.3 重、轻链DNA的拼接：将纯化的重、轻链产物及引物接头电泳定量确定等摩尔比例，重链DNA 14μl，轻链DNA 16μl，引物接头混合液4μl，TaqDNA多聚酶5u，总体积50μl，94°C 1min，63°C 4min，7次循环。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.4 拼接后PCR扩增及产物纯化：拼接反应液50μl，10×PCR缓冲液5μl，TaqDNA多聚酶5μ，20mmol dNTP 1μl，RS引物混匀合液(含带SfiI位点和带NotI位点的引物)，总体积100μl，94°C 1min，55°C 2min，72°C 2min，30次循环。扩增产物经Sepha-cryl S-400HR柱层析纯化，即得单链抗体的可变区DNA片段(ScFv)。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.5 ScFv与pCANTAB5E噬菌体载体的连接：SfiI及NotI双酶切ScFv，Sephacryl S-400HR柱纯化后，与pCANTAB5E(经 SfiI及Not Ⅰ双酶切的开环)连接。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.6 转化：依照常规方法转化感受态大肠杆菌TG1[5]形成抗体可变区基因文库。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.7 文库的“抢救(Rescue)”：800μl转化菌中，加入含氨苄青霉素及葡萄糖的2×YT-AG培养液200μl，于37°C 250r/min培养3h，加入2.5×109 pfu M13k07辅助噬菌体，37°C 250r/min培养30min，离心收菌，重悬于10ml含氨苄青霉素及卡那霉素的2×YT-AK培养液中，37°C 250r/min培养16h，1000×g离心20min，上清即为抗ANG噬菌体单链抗体。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.8 抗体亲合筛选：直径10cm培养皿中，加入5ml 0.1mg/ml的ANG纯品包被、封闭，上述制备的抗体加等体积2%脱脂奶粉作用30min，取5ml加至抗原平皿，室温作用2h，用PBS及含0.1% Tween 20的PBS分别洗20次后，加入log-phase TG1 37°C转染30min后铺SOBAG琼脂板，30°C培养14h至克隆生长。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.9 抗体克隆化“抢救”：将SOBAG平板上的细菌克隆转入96孔板2×YT-AG中37°C 250r/min培养，进行抗体抢救(方法同1.2.7)。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.10 抗体的ELISA筛选：ANG抗原包被96孔板，GM-CSF作阴性对照，羊抗M13噬菌体IgG作阳性对照，封闭后各孔分别加抗体克隆化“抢救”上清，常规方法作ELISA，显色后测各孔A450nm值，即得单克隆的高亲和力抗ANG噬菌体基因工程单链抗体。|96x}qx, 百拇医药
2 结果|96x}qx, 百拇医药
2.1 抗体重、轻链可变区基因的PCR扩增及其拼接后的PCR扩增结果 见图1、图2。轻链DNA长度为325bp，重链长度为340bp，拼接成的ScFv长度为725bp。
|96x}qx, 百拇医药
图 1PCR产物电泳图|96x}qx, 百拇医药
Fig 1Electrophoresis of PCR producte|96x}qx, 百拇医药
1 and 2.Antibody V of heavy chain|96x}qx, 百拇医药
3 and 4.Antibody V of light chain|96x}qx, 百拇医药
5 and 6.markers of DNA of heavy chain|96x}qx, 百拇医药
2.2 抗体克隆化淘筛后的ELISA结果 见如表1。以检测孔的A450nm值/阴性孔A450nm值大于3为阳性，结果9孔是阳性，表明为高亲合力抗ANG噬菌体基因工程单链抗体。将保存的相应9孔菌种扩增后，即可进行大规模制备阶段。
|96x}qx, 百拇医药
图 2PCR产物电泳图|96x}qx, 百拇医药
Fig 2Electrophoresis of PCR producte|96x}qx, 百拇医药
1 and 2.Markers of DNA of ScFv|96x}qx, 百拇医药
3 and 4.DNA of ScFv|96x}qx, 百拇医药
表1 抗ANG噬菌体单链抗体的ELISA筛选结果
Tab 1 Result of ELISA screening of anti-AGN phage single chain antibody Group2rt%:), http://www.100md.com
Number of wells2rt%:), http://www.100md.com
A450nm(
±s)2rt%:), http://www.100md.com
Positive control group2rt%:), http://www.100md.com
22rt%:), http://www.100md.com
0.365±0.0552rt%:), http://www.100md.com
Negative control group2rt%:), http://www.100md.com
22rt%:), http://www.100md.com
0.040±0.0202rt%:), http://www.100md.com
Anti-ANG antibody group2rt%:), http://www.100md.com
92rt%:), http://www.100md.com
0.123±0.0172rt%:), http://www.100md.com
3 讨论2rt%:), http://www.100md.com
3.1 噬菌体抗体库(Surface display phage antibody library)技术是近年来迅速发展起来的一种抗体筛选技术。其技术原理是采用PCR等分子克隆实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗体可变区重、轻链基因，通过一段接头DNA拼接后，再与噬菌体头部蛋白G3P基因5′端重组，通过噬菌体表面呈现技术(Surface display)把单链抗体(Single chain Fv，ScFv)表达在噬菌体表面，与天然抗体的折叠方式一致，能与抗原有效结合。由于其筛选方式及产量的明显优势，所以取代传统的杂交瘤单抗技术已成趋势[6，7]。目前国内外均已建立此技术，对其下游工艺及临床应用研究正在进行，但有关抗人ANG噬菌体基因工程抗体的研究尚未见报道。2rt%:), http://www.100md.com
3.2 构建噬菌体抗文库所用抗体mRNA可来源于杂交瘤细胞、免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞、甚至体外免疫的细胞，但Kettleborough等认为[8]，考虑到高亲合力抗体筛选所需的步骤和抗体的多样性，选用淋巴细胞建库比较好。我们选用单抗杂交瘤细胞是考虑到其表达的是单一抗体轻重链基因，我们要制备单一目的的抗体以其作为mRNA来源最合适。抗体重、轻链cDNA克隆是否成功主要与mRNA纯度相关，采用oligo-dT纤维素亲合纯化技术，可以保证mRNA的纯度。
3.3 应用M13K07辅助噬菌体，在含氨苄青霉素及卡那霉素的无糖培养液中，对文库进行“抢救(Resuce)”，由于重组pCANTAB5E的Lac启动子去抑制，开始转录翻译合成抗ANG-G3P融合蛋白[9]；M13K07促进噬菌体复制形成完整噬菌体颗粒从细胞内释出，并在其头部呈现抗ANG单链融合抗体。m(#q2de, http://www.100md.com
3.4 用ANG抗原平皿吸附抗体文库，经多次洗涤之后高亲合力抗ANG噬菌体基因工程单链抗体保留在平皿上，加Log-phase宿主菌让保留的噬菌体重新转染宿主菌，克隆化抢救后即得高亲合力单克隆抗人ANG噬菌体基因工程单链抗体。m(#q2de, http://www.100md.com
为了更进一步实验和临床应用，所得噬菌体基因工程单链抗体要经基因序列分析、动物实验、再转染大肠杆菌HB2151制备分泌型抗人ANG基因工程单链抗体，此部分工作正在进行之中，而且已取得了部分预试验资料。m(#q2de, http://www.100md.com
* 广东省自然科学基金(960668)和军队自然科学基金(96D033)资助课题m(#q2de, http://www.100md.com
第一作者：男，27岁，硕士生，技师m(#q2de, http://www.100md.com
参考文献m(#q2de, http://www.100md.com
1 Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，et al.Isolation and cha-racterization of angiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cell.Biochemistry，1985，24(20)：5480m(#q2de, http://www.100md.com
2 Folkman J.The role of angiogenesis in tumor growth.Semin Cancer Biol，1992，3(2)：65m(#q2de, http://www.100md.com
3 Olson KA，Fett JW，French TCO，et al.Angiogenin antagonists prevent tumor growth in vivo.Prol Natl Acad Sci USA，1995，92：442m(#q2de, http://www.100md.com
4 张宏斌，江悦华，王 捷，等.抗人膀胱癌噬菌体单链抗体的初步制备.免疫学杂志，1997，13(2)：119m(#q2de, http://www.100md.com
5 彭秀玲，袁汉英，谢 毅，等.基因工程实验技术.第2版，长沙：湖南科学出版社，1997.117m(#q2de, http://www.100md.com
6 Chiswell DJ，McCafferty J.Phage antibodies：will new ′coliclonal′ antibodies replace monoclonal antibodies？TIBTECH，1992，10(3)：80m(#q2de, http://www.100md.com
7 Duenas M，Borrebaeck CA.Clonal selection and amplification of phage displayed antibodies by linking antigen recognition and phage replication.Biotechniques，1994，12(10)：999m(#q2de, http://www.100md.com
8 Kettleborough CA，Ansell KH，Allen RW，et al.Isolation of tumor cell-specific single-chain Fv from immunized mice using phage-antibody libraries and the reconstruction of whole antibodies from these antibody fragments.Bur J Immunol，1994，24(4)：953m(#q2de, http://www.100md.com
9 McCafferty J，Griffiths AD，Winter G，et al.Phage antibodies：filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature，1990，348：552m(#q2de, http://www.100md.com
(1999-02-25收稿；1999-07-27修回)(张宏斌 江悦华 王 捷 李建军 赖声礼 杨太成 吴锦银 李 明)
单位：张宏斌 赖声礼(华南理工大学 广州市 510641)；江悦华 王 捷 李建军 杨太成 吴锦银 李 明(广州军区总医院医学实验科 广州市 510010)|, http://www.100md.com
关键词：噬菌体抗体 血管生长素 制备|, http://www.100md.com
免疫学杂志990421摘 要 采用PCR等分子克隆实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体可变区重、轻链基因，以DNA接头连接后与噬菌粒pCANTAB5E重组转化大肠杆菌形成抗体可变区基因库。通过噬菌体表面表达技术把抗体可变区表达在噬菌体表面。|, http://www.100md.com
中图号 R392.11|, http://www.100md.com
PREPARATION OF THE PHAGE GENETICENGINEERING|, http://www.100md.com
ANTIBODY OF ANTI-HUMAN ANGIOGENIN|, http://www.100md.com
Zhang Hongbin，Jiang Yuehua，Wang Jie，Li Jianjun，Lai Shengli，Yang Taicheng，Wu Jinyin，Li Ming|, http://www.100md.com
(South China University of Technology， Guangzhou 510641)|, http://www.100md.com
Abstract The phage display antibody of anti-human angiogenin was a new and high effective antibody prepared by using the technique of surface display phage antibody library.By using molecular biological methods such as PCR et al，immunoglobulin variable region genes were amplified from angiogenin mouse hybridomas.The heavy and light chain DNA products were assembled into a single gene by using a DNA linker.The anti-angiogenin single DNA fragment was ligated into a phage vector pCANTAB5E，and the recombinant vector was subsequently transformed into E.coli TG1 cells for construction of phage display libraries of anti-angiogenin.By phage rescue、affinity selection、reinfection and screening methods，the anti-angiogenin phage geneticengineering single chain antibody of defined specificity and affinity was obtained.
Key words Phage antibody，Angiogenin，Preparation5i[}*r, 百拇医药
血管生长素(Angiogenin，ANG)是一种存在于正常人血浆及实体肿瘤组织中的蛋白质[1]，它具有很强的促血管生长作用。大量研究表明：ANG与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系[2]。ANG单抗可以通过中和ANG或阻断ANG与血管内皮细胞受体结合而实现其抑瘤作用[3]；ANG单抗对ANG依赖型恶性肿瘤有重要的临床应用价值。但以杂交瘤技术制备ANG单抗存在周期长、费用高、产量低等缺点，而噬菌体抗体技术具有克隆筛选简捷、抗体制备方便、及易进行抗体基因修饰操作等优点[4]。本文通过抗人ANG噬菌体基因工程抗体制备的研究，将为临床提供一种经济有效的新型抗体打下基础。5i[}*r, 百拇医药
1 材料和方法5i[}*r, 百拇医药
1.1 材料5i[}*r, 百拇医药
1.1.1 ANG小鼠杂交瘤细胞系：本实验室自行构建。5i[}*r, 百拇医药
1.1.2 重组噬菌体基因工程抗体试剂盒：内含扩增抗体重、轻链可变区cDNA的特异性PCR引物Heavy primer1，Heavy primer2，Light primer Mix及组装ScFv的PCR引物linker primer mix，ES primer mix；克隆及表达噬菌体载体pCANTAB5E；宿主菌E.coli TG1及辅助噬菌体M13K07等。购自pharmacia公司。5i[}*r, 百拇医药
1.1.3 逆转录试剂盒、dNTP、NotΙ、SfiI限制性内切酶为pharmacia公司产品；T4DNA连接酶、TaqDNA多聚酶为promega公司产品；胰蛋白胨及酵母提取物为OXOID公司产品；NaCl等试剂均为国产分析纯。5i[}*r, 百拇医药
1.2 方法5i[}*r, 百拇医药
1.2.1 抗体重、轻链可变区cDNA的获取：从小鼠ANG杂交瘤细胞制备mRNA，采用oligo-dT纤维素纯化。逆转录合成cDNA第一链，同时做两份。第一链反应产物中，分别加重、轻链引物PCR扩增。5i[}*r, 百拇医药
1.2.2 重、轻链可变区cDNA PCR扩增产物的纯化：扩增产物于1.5%琼脂糖电泳分离后，采用微管柱纯化法回收340bp及325bp DNA片段。
1.2.3 重、轻链DNA的拼接：将纯化的重、轻链产物及引物接头电泳定量确定等摩尔比例，重链DNA 14μl，轻链DNA 16μl，引物接头混合液4μl，TaqDNA多聚酶5u，总体积50μl，94°C 1min，63°C 4min，7次循环。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.4 拼接后PCR扩增及产物纯化：拼接反应液50μl，10×PCR缓冲液5μl，TaqDNA多聚酶5μ，20mmol dNTP 1μl，RS引物混匀合液(含带SfiI位点和带NotI位点的引物)，总体积100μl，94°C 1min，55°C 2min，72°C 2min，30次循环。扩增产物经Sepha-cryl S-400HR柱层析纯化，即得单链抗体的可变区DNA片段(ScFv)。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.5 ScFv与pCANTAB5E噬菌体载体的连接：SfiI及NotI双酶切ScFv，Sephacryl S-400HR柱纯化后，与pCANTAB5E(经 SfiI及Not Ⅰ双酶切的开环)连接。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.6 转化：依照常规方法转化感受态大肠杆菌TG1[5]形成抗体可变区基因文库。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.7 文库的“抢救(Rescue)”：800μl转化菌中，加入含氨苄青霉素及葡萄糖的2×YT-AG培养液200μl，于37°C 250r/min培养3h，加入2.5×109 pfu M13k07辅助噬菌体，37°C 250r/min培养30min，离心收菌，重悬于10ml含氨苄青霉素及卡那霉素的2×YT-AK培养液中，37°C 250r/min培养16h，1000×g离心20min，上清即为抗ANG噬菌体单链抗体。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.8 抗体亲合筛选：直径10cm培养皿中，加入5ml 0.1mg/ml的ANG纯品包被、封闭，上述制备的抗体加等体积2%脱脂奶粉作用30min，取5ml加至抗原平皿，室温作用2h，用PBS及含0.1% Tween 20的PBS分别洗20次后，加入log-phase TG1 37°C转染30min后铺SOBAG琼脂板，30°C培养14h至克隆生长。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.9 抗体克隆化“抢救”：将SOBAG平板上的细菌克隆转入96孔板2×YT-AG中37°C 250r/min培养，进行抗体抢救(方法同1.2.7)。'y.#&, http://www.100md.com
1.2.10 抗体的ELISA筛选：ANG抗原包被96孔板，GM-CSF作阴性对照，羊抗M13噬菌体IgG作阳性对照，封闭后各孔分别加抗体克隆化“抢救”上清，常规方法作ELISA，显色后测各孔A450nm值，即得单克隆的高亲和力抗ANG噬菌体基因工程单链抗体。|96x}qx, 百拇医药
2 结果|96x}qx, 百拇医药
2.1 抗体重、轻链可变区基因的PCR扩增及其拼接后的PCR扩增结果 见图1、图2。轻链DNA长度为325bp，重链长度为340bp，拼接成的ScFv长度为725bp。
|96x}qx, 百拇医药图 1PCR产物电泳图|96x}qx, 百拇医药
Fig 1Electrophoresis of PCR producte|96x}qx, 百拇医药
1 and 2.Antibody V of heavy chain|96x}qx, 百拇医药
3 and 4.Antibody V of light chain|96x}qx, 百拇医药
5 and 6.markers of DNA of heavy chain|96x}qx, 百拇医药
2.2 抗体克隆化淘筛后的ELISA结果 见如表1。以检测孔的A450nm值/阴性孔A450nm值大于3为阳性，结果9孔是阳性，表明为高亲合力抗ANG噬菌体基因工程单链抗体。将保存的相应9孔菌种扩增后，即可进行大规模制备阶段。
|96x}qx, 百拇医药图 2PCR产物电泳图|96x}qx, 百拇医药
Fig 2Electrophoresis of PCR producte|96x}qx, 百拇医药
1 and 2.Markers of DNA of ScFv|96x}qx, 百拇医药
3 and 4.DNA of ScFv|96x}qx, 百拇医药
表1 抗ANG噬菌体单链抗体的ELISA筛选结果
Tab 1 Result of ELISA screening of anti-AGN phage single chain antibody Group2rt%:), http://www.100md.com
Number of wells2rt%:), http://www.100md.com
A450nm(
±s)2rt%:), http://www.100md.comPositive control group2rt%:), http://www.100md.com
22rt%:), http://www.100md.com
0.365±0.0552rt%:), http://www.100md.com
Negative control group2rt%:), http://www.100md.com
22rt%:), http://www.100md.com
0.040±0.0202rt%:), http://www.100md.com
Anti-ANG antibody group2rt%:), http://www.100md.com
92rt%:), http://www.100md.com
0.123±0.0172rt%:), http://www.100md.com
3 讨论2rt%:), http://www.100md.com
3.1 噬菌体抗体库(Surface display phage antibody library)技术是近年来迅速发展起来的一种抗体筛选技术。其技术原理是采用PCR等分子克隆实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗体可变区重、轻链基因，通过一段接头DNA拼接后，再与噬菌体头部蛋白G3P基因5′端重组，通过噬菌体表面呈现技术(Surface display)把单链抗体(Single chain Fv，ScFv)表达在噬菌体表面，与天然抗体的折叠方式一致，能与抗原有效结合。由于其筛选方式及产量的明显优势，所以取代传统的杂交瘤单抗技术已成趋势[6，7]。目前国内外均已建立此技术，对其下游工艺及临床应用研究正在进行，但有关抗人ANG噬菌体基因工程抗体的研究尚未见报道。2rt%:), http://www.100md.com
3.2 构建噬菌体抗文库所用抗体mRNA可来源于杂交瘤细胞、免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞、甚至体外免疫的细胞，但Kettleborough等认为[8]，考虑到高亲合力抗体筛选所需的步骤和抗体的多样性，选用淋巴细胞建库比较好。我们选用单抗杂交瘤细胞是考虑到其表达的是单一抗体轻重链基因，我们要制备单一目的的抗体以其作为mRNA来源最合适。抗体重、轻链cDNA克隆是否成功主要与mRNA纯度相关，采用oligo-dT纤维素亲合纯化技术，可以保证mRNA的纯度。
3.3 应用M13K07辅助噬菌体，在含氨苄青霉素及卡那霉素的无糖培养液中，对文库进行“抢救(Resuce)”，由于重组pCANTAB5E的Lac启动子去抑制，开始转录翻译合成抗ANG-G3P融合蛋白[9]；M13K07促进噬菌体复制形成完整噬菌体颗粒从细胞内释出，并在其头部呈现抗ANG单链融合抗体。m(#q2de, http://www.100md.com
3.4 用ANG抗原平皿吸附抗体文库，经多次洗涤之后高亲合力抗ANG噬菌体基因工程单链抗体保留在平皿上，加Log-phase宿主菌让保留的噬菌体重新转染宿主菌，克隆化抢救后即得高亲合力单克隆抗人ANG噬菌体基因工程单链抗体。m(#q2de, http://www.100md.com
为了更进一步实验和临床应用，所得噬菌体基因工程单链抗体要经基因序列分析、动物实验、再转染大肠杆菌HB2151制备分泌型抗人ANG基因工程单链抗体，此部分工作正在进行之中，而且已取得了部分预试验资料。m(#q2de, http://www.100md.com
* 广东省自然科学基金(960668)和军队自然科学基金(96D033)资助课题m(#q2de, http://www.100md.com
第一作者：男，27岁，硕士生，技师m(#q2de, http://www.100md.com
参考文献m(#q2de, http://www.100md.com
1 Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，et al.Isolation and cha-racterization of angiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cell.Biochemistry，1985，24(20)：5480m(#q2de, http://www.100md.com
2 Folkman J.The role of angiogenesis in tumor growth.Semin Cancer Biol，1992，3(2)：65m(#q2de, http://www.100md.com
3 Olson KA，Fett JW，French TCO，et al.Angiogenin antagonists prevent tumor growth in vivo.Prol Natl Acad Sci USA，1995，92：442m(#q2de, http://www.100md.com
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(1999-02-25收稿；1999-07-27修回)(张宏斌 江悦华 王 捷 李建军 赖声礼 杨太成 吴锦银 李 明)