抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体库的构建
作者：张宏斌 江悦华 王 捷 李建军 赖声礼
单位：张宏斌 江悦华 王 捷 李建军 广州军区广州总医院医学实验科(510010)；赖声礼 华南理工大学(510614)
关键词：噬菌体抗体；文库；血管生长素；构建
广东医学990902 【摘要】 目的 构建抗人血管生长素基因工程抗体文库。方法 采用PCR等分子生物学实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体可变区重、轻链基因，通过噬菌体表面呈现技术表达抗体。结果 ①获取了抗人血管生长素抗体可变区基因片段(ScFv)，②得到了抗人血管生长素基因工程抗体文库。结论 本研究建立了一种构建高效抗人血管生长素抗体文库的方法，该抗体库在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景。
Construction of library of the phage genetic engineering antibody of anti-human angiogenin
, http://www.100md.com
Zhang Hongbin, Jiang Yuehua, Wang Jie
General Hospital of Guangzhou Command of PLA , Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To construct library of the phage genetic engineering antibody of anti-human angiogenin. Methods By using molecular biological methods such as polymerase chain reaction, etc, both heavy and light chain genes of anti-human angiogenin antibody were prepared from mouse angiogenin hybridomas. Antibodies were expressed by using the technique of phage surface display libraries. Results ①The DNA fragments of variable region of anti-human angiogenin antibody were obtaines. ②The library of phage genetic engineering antibody of anti-human angiogenin were constructed. Conclusion Construction of the library of anti-human angiogenin antibody is established. This library of antibodies may provide an alternative way in the treatment of tumor.
, 百拇医药
【Key words】 Phage antibody Library Angiogenin Construction
血管生长素(angiogenin,ANG)是一种存在于正常人体血浆及实体肿瘤组织中的Mr,14 400;PI，9.5蛋白质，它具有很强的促血管生长作用。已有大量研究表明，ANG与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系[1]。ANG单抗可以通过中和ANG或阻断ANG与血管内皮细胞受体结合而实现其抑瘤作用[2]，因此ANG单抗对ANG依赖型恶性肿瘤有重要的临床应用价值。但以传统的杂交瘤技术制备ANG单抗存在周期长、费用高、产量低等缺点，而噬菌体抗体技术具有克隆筛选简捷、抗体制备方便及易进行抗体基因修饰操作等优点[3]。本文通过抗人ANG噬菌体基因工程抗体的制备研究，将为临床提供一种经济有效的新型抗体打下基础。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 ANG杂交瘤细胞：本实验室自行建制[4]。重组噬菌体基因工程抗体试剂盒购自Phamacia公司。该试剂盒包括：①抗体系统，提供扩增抗体重、轻链可变区cDNA的特异性PCR引物：Heavy primer 1, Heavy primer 2, Light primer mix及组装ScFv的PCR引物：Linker primer mix, ES Primer mix；②表达系统，提供克隆及表达噬菌体载体pCANTAB5E，宿主菌E.coli TG1等。逆转录试剂盒、dNT、Not Ⅰ、Sfi Ⅰ限制性内切酶、载体pCANTAB5E基因插入PCR检测引物R1及R2为Pharmacia公司产品；质粒微管抽提试剂盒为BIO-RAD公司产品；T4连接酶、Taq DNA多聚酶为Promega公司产品；胰蛋白胨及酵母提取物为OXOID公司产品；Nacl等试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
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1.2.1 ANG杂交瘤细胞mRNA的制备 采用oligo-dT纤维素纯化mRNA。
1.2.2 逆转录合成cDNA第1链 依照逆转录试剂盒指南，mRNA模板5 μL，RNase-free water 16 μL, primed 1st-strand mix 11 μL，DTT solution 1 μL,总体积33 μL，37℃温水水浴1 h，同时做两份。
1.2.3 重、轻链可变区cDNA第1次PCR扩增 重链PCR反应体系中，第1链反应产物33 μL，重链引物2 μL；轻链PCR反应体系中，第1链反应产物33 μL，轻链引物为2 μL。分别加入Taq DNA多聚酶5 u，总体积为99 μL。94℃ 1 min,55℃ 2 min，72℃ 2 min；循环30次。
1.2.4 重、轻链可变区cDNA第1次PCR扩增产物的纯化 扩增产物于1.5%琼脂糖电泳分离后，采用微管柱纯化法回收340 bp及325 bp DNA片段。
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1.2.5 重、轻链DNA的拼接 将纯化的重、轻链产物及引物接头电泳定量确定等摩尔比例，重链DNA 14 μL，轻链DNA 16 μL，引物接头混合液4 μL，Taq DNA多聚酶5 u，总体积50 μL，94℃ 1 min，63℃ 4 min，7次循环。
1.2.6 第2次PCR扩增及产物纯化 拼接反应液50 μL，10×PCR缓冲液5 μL，Taq DNA多聚酶5 u 20 mMdNTP 1 μL，RS引物混匀合液(含带Sfi Ⅰ位点和带Not Ⅰ位点的引物)，总体积100 μL，94 ℃ 1 min,55 ℃ 2 min,72 ℃ 2 min，30次循环。扩增产物经Sephacryl S-400HR柱层析纯化，即得单链抗体的可变区DNA片段(ScFv)。
1.2.7 ScFv与pCANTAB5E噬菌体载体的连接 Sfi Ⅰ及Not Ⅰ双酶切ScFv，Sephacryl S-400HR柱纯化后42 μL，50 μg/μL pCANTAB5E 1 μL，T4连接酶3 u，总体积50 μL，16℃反应6 h。
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1.2.8 转化形成文库 连接物按常规方法转化DMSO法制备的感受态大肠杆菌TG1形成抗体可变区基因文库。
1.2.9 文库质粒DNA的制备 接种文库菌种于2×YT-AG中扩增。依照质粒微管抽提试剂盒指南制备文库DNA。
1.2.10 载体pCANTAB5E插入基因的检测 R1 primer 2 μL，R2 primer 2μL，10×PCR buffer 10 μL，质粒DNA 3 μL，Taq DNA多聚酶5 u，总体积100 μL。94℃ 1 min, 55℃ 1 min，55 ℃ 2 min，72℃ 2 min;循环30次。
2 结果
2.1 抗体重、轻链可变区基因的PCR扩增及其拼接后的PCR扩增结果 轻链DNA长度为325 bp，重链长度为340 bp，拼接成的ScFv长度为725 bp。
, 百拇医药
2.2 抗体文库抽提质粒DNA及其PCR扩增结果 质粒长度约为6 000 bp，PCR扩增产物900+bp，因为所用引物R1及R2为载体位点，扩增产物中含有200+bp载体序列。
3 讨论
噬菌体抗体文库(surface display phage antibody library)技术是近年来迅速发展起来的一种抗体筛选技术。其技术原理是采用PCR等分子生物学实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗体可变区重、轻链基因，通过一段接头DNA拼接后，再与噬菌体头部蛋白G3P基因5′端重组，通过噬菌体表面表达技术(surface display)把单链抗体(single chain Fv, ScFv)表达在噬菌体表面，与天然抗体的折叠方式一致，能与抗原有效结合。由于其筛选方式及产量的明显优势，所以取代传统的杂交瘤单抗技术已成趋势[5，6]。目前国内外均已建立此技术，对其下游工艺及临床应用研究正在进行，但有关抗人ANG噬菌体基因工程抗体的研究作者尚未见报道。
, 百拇医药
构建噬菌体抗体文库所用抗体mRNA可来源于杂交瘤细胞、免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞、甚至体外免疫的细胞，但Kettleborough等认为[7]，考虑到高亲和力抗体筛选所需的步骤和抗体的多样性，选用淋巴细胞建库比较好。我们选用单抗杂交瘤细胞是考虑到其表达的是单一抗体轻重链基因，我们要制备单一目的的抗体以其作为mRNA来源最合适。抗体重、轻链cDNA克隆是否成功主要与mRNA纯度相关，采用oligo-dT纤维素亲和纯化技术，可以保证mRNA的纯度。
应用六聚体寡核苷酸随机引物逆转录合成抗体第1链cDNA能保持mRNA编码区及5′末端序列的完整性。本文采用针对重、轻链可变区保守序列的一组引物，设计扩增重链DNA长度为340 bp，轻链DNA长度为325 bp，通过一编码15个氨基酸的DNA接头，其一端与重链DNA 3′端相接，另一端与轻链DNA 5′端相接，形成一长度为725 bp的单链抗体可变区DNA片段(ScFv)，并能保留正常阅读框架。
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Sfi Ⅰ及Not Ⅰ酶切位点在抗体基因中极为少见，可防止与抗体基因中有重复位点，ScFv两端通过PCR方法引入SfiⅠ和Not Ⅰ酶切位点后，插入pCANTAB5E噬菌粒的M1基因前方(处于同一阅读框架)，转化大肠杆菌形成抗体可变区基因文库。
抗体基因在以Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点插入噬菌粒载体pCANTAB5E时，有因重复位点的缘故而出现抗体可变区基因部分插入的现象。在以引物R1和R2再现插入基因时出现600 bp带。在实验时要注意基因筛选。
为了更进一步实验和临床应用，所构建的基因工程抗体文库要经文库“抢救”、抗体亲和筛选、制备可溶性抗体、基因序列分析、动物实验等，此部分工作正在进行中，而且已取得部分预实验资料。
*本研究为广东省自然科学基金资助课题(编号：960668)及军队自然科学基金资助课题(编号：96D033)
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4 参考文献
1 Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth. Semin Cancer Biol,1992， 3(2):65
2 Olson KA, Fett JW, French TCO, et al. Angiogenin antagonists prevent tumor growth in vivo. Prol Natl Acad Sci Usa,1995，92:442
3 张宏斌，江悦华，王 捷，等.抗人膀胱癌噬菌体单链抗体的初步制备.免疫学杂志，1997，13(2)：119
4 杨太成，江悦华，王 捷，等.抗人血管生长素单克隆抗体的制备.中国免疫学杂志，1995， 5：23
, 百拇医药 5 Chiswell DJ, McCafferty J. Phage antibodies: will new ‘coliclonal' antibodies replace monoclonal antibodies TIBTECH,1992，10(3):80
6 Duenas M, Borrebaeck CA. Clonal selection and amplification of phage displayed antibodies by linking antigen recognition and phage replication. Biotechniques,1994，12(10):999
7 Kettleborough CA, Ansell KH, Allen RW et al. Isolation of tumor cell-specific single-chain Fv from immunized mice using phage-antibody libraries and the reconstruction of whole antibodies from these antibody fragments. Bur J Immunol,1994，24(4):952, http://www.100md.com
单位：张宏斌 江悦华 王 捷 李建军 广州军区广州总医院医学实验科(510010)；赖声礼 华南理工大学(510614)
关键词：噬菌体抗体；文库；血管生长素；构建
广东医学990902 【摘要】 目的 构建抗人血管生长素基因工程抗体文库。方法 采用PCR等分子生物学实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体可变区重、轻链基因，通过噬菌体表面呈现技术表达抗体。结果 ①获取了抗人血管生长素抗体可变区基因片段(ScFv)，②得到了抗人血管生长素基因工程抗体文库。结论 本研究建立了一种构建高效抗人血管生长素抗体文库的方法，该抗体库在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景。
Construction of library of the phage genetic engineering antibody of anti-human angiogenin
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Zhang Hongbin, Jiang Yuehua, Wang Jie
General Hospital of Guangzhou Command of PLA , Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To construct library of the phage genetic engineering antibody of anti-human angiogenin. Methods By using molecular biological methods such as polymerase chain reaction, etc, both heavy and light chain genes of anti-human angiogenin antibody were prepared from mouse angiogenin hybridomas. Antibodies were expressed by using the technique of phage surface display libraries. Results ①The DNA fragments of variable region of anti-human angiogenin antibody were obtaines. ②The library of phage genetic engineering antibody of anti-human angiogenin were constructed. Conclusion Construction of the library of anti-human angiogenin antibody is established. This library of antibodies may provide an alternative way in the treatment of tumor.
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【Key words】 Phage antibody Library Angiogenin Construction
血管生长素(angiogenin,ANG)是一种存在于正常人体血浆及实体肿瘤组织中的Mr,14 400;PI，9.5蛋白质，它具有很强的促血管生长作用。已有大量研究表明，ANG与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系[1]。ANG单抗可以通过中和ANG或阻断ANG与血管内皮细胞受体结合而实现其抑瘤作用[2]，因此ANG单抗对ANG依赖型恶性肿瘤有重要的临床应用价值。但以传统的杂交瘤技术制备ANG单抗存在周期长、费用高、产量低等缺点，而噬菌体抗体技术具有克隆筛选简捷、抗体制备方便及易进行抗体基因修饰操作等优点[3]。本文通过抗人ANG噬菌体基因工程抗体的制备研究，将为临床提供一种经济有效的新型抗体打下基础。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 ANG杂交瘤细胞：本实验室自行建制[4]。重组噬菌体基因工程抗体试剂盒购自Phamacia公司。该试剂盒包括：①抗体系统，提供扩增抗体重、轻链可变区cDNA的特异性PCR引物：Heavy primer 1, Heavy primer 2, Light primer mix及组装ScFv的PCR引物：Linker primer mix, ES Primer mix；②表达系统，提供克隆及表达噬菌体载体pCANTAB5E，宿主菌E.coli TG1等。逆转录试剂盒、dNT、Not Ⅰ、Sfi Ⅰ限制性内切酶、载体pCANTAB5E基因插入PCR检测引物R1及R2为Pharmacia公司产品；质粒微管抽提试剂盒为BIO-RAD公司产品；T4连接酶、Taq DNA多聚酶为Promega公司产品；胰蛋白胨及酵母提取物为OXOID公司产品；Nacl等试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
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1.2.1 ANG杂交瘤细胞mRNA的制备 采用oligo-dT纤维素纯化mRNA。
1.2.2 逆转录合成cDNA第1链 依照逆转录试剂盒指南，mRNA模板5 μL，RNase-free water 16 μL, primed 1st-strand mix 11 μL，DTT solution 1 μL,总体积33 μL，37℃温水水浴1 h，同时做两份。
1.2.3 重、轻链可变区cDNA第1次PCR扩增 重链PCR反应体系中，第1链反应产物33 μL，重链引物2 μL；轻链PCR反应体系中，第1链反应产物33 μL，轻链引物为2 μL。分别加入Taq DNA多聚酶5 u，总体积为99 μL。94℃ 1 min,55℃ 2 min，72℃ 2 min；循环30次。
1.2.4 重、轻链可变区cDNA第1次PCR扩增产物的纯化 扩增产物于1.5%琼脂糖电泳分离后，采用微管柱纯化法回收340 bp及325 bp DNA片段。
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1.2.5 重、轻链DNA的拼接 将纯化的重、轻链产物及引物接头电泳定量确定等摩尔比例，重链DNA 14 μL，轻链DNA 16 μL，引物接头混合液4 μL，Taq DNA多聚酶5 u，总体积50 μL，94℃ 1 min，63℃ 4 min，7次循环。
1.2.6 第2次PCR扩增及产物纯化 拼接反应液50 μL，10×PCR缓冲液5 μL，Taq DNA多聚酶5 u 20 mMdNTP 1 μL，RS引物混匀合液(含带Sfi Ⅰ位点和带Not Ⅰ位点的引物)，总体积100 μL，94 ℃ 1 min,55 ℃ 2 min,72 ℃ 2 min，30次循环。扩增产物经Sephacryl S-400HR柱层析纯化，即得单链抗体的可变区DNA片段(ScFv)。
1.2.7 ScFv与pCANTAB5E噬菌体载体的连接 Sfi Ⅰ及Not Ⅰ双酶切ScFv，Sephacryl S-400HR柱纯化后42 μL，50 μg/μL pCANTAB5E 1 μL，T4连接酶3 u，总体积50 μL，16℃反应6 h。
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1.2.8 转化形成文库 连接物按常规方法转化DMSO法制备的感受态大肠杆菌TG1形成抗体可变区基因文库。
1.2.9 文库质粒DNA的制备 接种文库菌种于2×YT-AG中扩增。依照质粒微管抽提试剂盒指南制备文库DNA。
1.2.10 载体pCANTAB5E插入基因的检测 R1 primer 2 μL，R2 primer 2μL，10×PCR buffer 10 μL，质粒DNA 3 μL，Taq DNA多聚酶5 u，总体积100 μL。94℃ 1 min, 55℃ 1 min，55 ℃ 2 min，72℃ 2 min;循环30次。
2 结果
2.1 抗体重、轻链可变区基因的PCR扩增及其拼接后的PCR扩增结果 轻链DNA长度为325 bp，重链长度为340 bp，拼接成的ScFv长度为725 bp。
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2.2 抗体文库抽提质粒DNA及其PCR扩增结果 质粒长度约为6 000 bp，PCR扩增产物900+bp，因为所用引物R1及R2为载体位点，扩增产物中含有200+bp载体序列。
3 讨论
噬菌体抗体文库(surface display phage antibody library)技术是近年来迅速发展起来的一种抗体筛选技术。其技术原理是采用PCR等分子生物学实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗体可变区重、轻链基因，通过一段接头DNA拼接后，再与噬菌体头部蛋白G3P基因5′端重组，通过噬菌体表面表达技术(surface display)把单链抗体(single chain Fv, ScFv)表达在噬菌体表面，与天然抗体的折叠方式一致，能与抗原有效结合。由于其筛选方式及产量的明显优势，所以取代传统的杂交瘤单抗技术已成趋势[5，6]。目前国内外均已建立此技术，对其下游工艺及临床应用研究正在进行，但有关抗人ANG噬菌体基因工程抗体的研究作者尚未见报道。
, 百拇医药
构建噬菌体抗体文库所用抗体mRNA可来源于杂交瘤细胞、免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞、甚至体外免疫的细胞，但Kettleborough等认为[7]，考虑到高亲和力抗体筛选所需的步骤和抗体的多样性，选用淋巴细胞建库比较好。我们选用单抗杂交瘤细胞是考虑到其表达的是单一抗体轻重链基因，我们要制备单一目的的抗体以其作为mRNA来源最合适。抗体重、轻链cDNA克隆是否成功主要与mRNA纯度相关，采用oligo-dT纤维素亲和纯化技术，可以保证mRNA的纯度。
应用六聚体寡核苷酸随机引物逆转录合成抗体第1链cDNA能保持mRNA编码区及5′末端序列的完整性。本文采用针对重、轻链可变区保守序列的一组引物，设计扩增重链DNA长度为340 bp，轻链DNA长度为325 bp，通过一编码15个氨基酸的DNA接头，其一端与重链DNA 3′端相接，另一端与轻链DNA 5′端相接，形成一长度为725 bp的单链抗体可变区DNA片段(ScFv)，并能保留正常阅读框架。
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Sfi Ⅰ及Not Ⅰ酶切位点在抗体基因中极为少见，可防止与抗体基因中有重复位点，ScFv两端通过PCR方法引入SfiⅠ和Not Ⅰ酶切位点后，插入pCANTAB5E噬菌粒的M1基因前方(处于同一阅读框架)，转化大肠杆菌形成抗体可变区基因文库。
抗体基因在以Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点插入噬菌粒载体pCANTAB5E时，有因重复位点的缘故而出现抗体可变区基因部分插入的现象。在以引物R1和R2再现插入基因时出现600 bp带。在实验时要注意基因筛选。
为了更进一步实验和临床应用，所构建的基因工程抗体文库要经文库“抢救”、抗体亲和筛选、制备可溶性抗体、基因序列分析、动物实验等，此部分工作正在进行中，而且已取得部分预实验资料。
*本研究为广东省自然科学基金资助课题(编号：960668)及军队自然科学基金资助课题(编号：96D033)
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4 参考文献
1 Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth. Semin Cancer Biol,1992， 3(2):65
2 Olson KA, Fett JW, French TCO, et al. Angiogenin antagonists prevent tumor growth in vivo. Prol Natl Acad Sci Usa,1995，92:442
3 张宏斌，江悦华，王 捷，等.抗人膀胱癌噬菌体单链抗体的初步制备.免疫学杂志，1997，13(2)：119
4 杨太成，江悦华，王 捷，等.抗人血管生长素单克隆抗体的制备.中国免疫学杂志，1995， 5：23
, 百拇医药 5 Chiswell DJ, McCafferty J. Phage antibodies: will new ‘coliclonal' antibodies replace monoclonal antibodies TIBTECH,1992，10(3):80
6 Duenas M, Borrebaeck CA. Clonal selection and amplification of phage displayed antibodies by linking antigen recognition and phage replication. Biotechniques,1994，12(10):999
7 Kettleborough CA, Ansell KH, Allen RW et al. Isolation of tumor cell-specific single-chain Fv from immunized mice using phage-antibody libraries and the reconstruction of whole antibodies from these antibody fragments. Bur J Immunol,1994，24(4):952, http://www.100md.com