半套式PCR扩增人抗HFRS病毒抗体基因及Fd段基因的克隆和序列分析*
作者：吴兴安 徐志凯 阎岩 白文涛 王海涛 张芳琳 薛小平
单位：第四军医大学微生物学教研室，西安，710032
关键词：HFRS病毒；聚合酶链反应；免疫球蛋白；Fd段基因；测序
细胞与分子免疫学杂志990205摘 要：从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞(PBL)中提取细胞总RNA，反转录成cDNA。以之为模板，用半套式聚合酶链反应(PCR)扩增人IgG抗体Fd段及轻链基因，并将Fd段基因克隆入噬菌体载体pcomb3；经酶切鉴定后，再亚克隆入pGEM7zf，筛选阳性克隆测序。经计算机分析，Fd段基因的全长为639bp，编码213个氨基酸，属于人IgG2亚类。
中国图书资料分类号：Q78
Amplification of genes of human antibodies against HFRS virus
, 百拇医药
using semi-nested polymerase chain reaction and
cloning, sequencing of Fd fragments
Wu Xingan, Xu Zhikai,Yan Yan, Bai Wentao, Wang Haitao, Zhang Fanglin, Xue Xiaoping.
(Department of Microbiology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords：HFRS virus PCR immunoglobulin Fd fragment gene sequencing
Abstract：The total cell RNA extracted from peripheral lymphocytes of HFRS patient was transcribed reversely into cDNA. The Fd fragments and light chain genes of human antibodies were amplified from cDNA using semi-nested polymerase chain reaction. Fd fragments genes were cloned into vector pcomb3 and pGEM7zf. One of positive clones selected randomly was sequenced.The results indicated that the Fd fragment gene consisted of 639bp, encoded 213 amino acid residues,and belonged to human IgG2.
, 百拇医药
肾综合征出血热(HFRS)在我国是危害最严重的病毒性传染病之一，目前尚无特异有效的治疗方法。90年代出现的噬菌体抗体库技术[1]已用于制备人源性mAb，可克服用杂交瘤技术制备人源性mAb所遇到的一些难题，如融合率不高，杂交瘤不稳定和抗体产量低等。获得人抗体基因是用噬菌体抗体库技术制备人mAb的关键。本文参照文献[2,3]设计了一组扩增人抗体Fd段基因及轻链基因的引物,从HFRS恢复期患者外周血淋巴细胞(PBL)中，成功地扩增出Fd段基因及轻链基因，并对Fd段基因进行了克隆及序列分析。
1 材料和方法
1.1 人PBL的分离 采取抗HFRS IgG阳性的HFRS恢复期患者血液，用淋巴细胞分离液按常规方法分离PBL。
1.2 总RNA的提取及逆转录 用Gibco公司的TrizolReagent,提取淋巴细胞中的RNA，并用Promega公司的Reverse Transcription System逆转录得到cDNA第1链，具体方法均参照其说明书进行。
, http://www.100md.com
1.3 PCR引物的设计 参照文献[2,3]，设计用于扩增人抗体重链Fd段基因及轻链基因的引物，引的序列如下:
HuHL1:5′-ATGGACTGGTCCAGGAG(GC)(GTA)TC(CT)T(CT)T-3′
HuHL2:5′-ATGGAG(CT)T(GT)GGGCTGAGCTGG(GAC)TTTT-3′
HuHL3:5′-ATGAAACA(TC)CT(GT)TG(GT)(TC)TC(AT)TC(CT)T(TC)CT-3′
HuCHs:5′-AGCACTAGTTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTT-3′
HuB1X:5′-CAGCTCGAGCAGTCTGG(AG)GC(AT)GAGGTG-3′
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HuB3X:5′-CAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAG-3′
HuKL1:(5′-ATGAGG(GC)TCC(TC)(TC)(AG)CTC(AT)GCT(CT)CTGGGG-3′
HuKL2:5′-ATGGAA(AG)CCC(AC)(AG)(AG)C(GT)CA(GC)(GC)T(TC)(TC)TC-3′
HvKBs:5′-CAGCCATGGCCGAGCTCAC(GC)CAGTCTCC-3′
HucKXb:5′-GCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAGGCC-3′
HuHL1,HuHL2和HuHL3为重链前导肽引物，HuCHs为重链恒定区1(CH1)引物，HuB1X和HuB3X为重链框架区(FR1)引物。HuKL1和HuKL2为轻链前导肽引物，HvKBs为轻链框架区(FR1)引物，HucKXb为轻链恒定区(Cκ)引物，引物中均含简并码。
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1.4 半套式PCR扩增重链Fd段基因及轻链基因 取上述逆转录反应液5μl，用重链前导肽引物和CH1引物配对进行PCR，然后用重链FR1及重链CH1引物配对做第2轮PCR扩增Fd段基因。同理，用轻链前导肽引物和Cκ引物配对做半套式PCR，再用轻链FR1区及Cκ引物做第2轮PCR扩增轻链基因。反应条件如下：反应体积100μl，每端引物加45pmol，于94℃、1min;50℃、1min;72℃、1.5min;扩增35个循环。
1.5 人抗体重链Fd段基因的克隆及序列分析 将重链Fd段基因克隆入pcomb3载体，用Xho I及Spe I酶切鉴定是否有目的基因片段插入。然后用Xho I和EcoR I将插入片段切下,再亚克隆入pGEM7zf，酶切鉴定筛选阳性克隆，任选1个克隆进行自动测序。
2 结果
2.1 PCR扩增人抗体重链Fd段基因及轻链基因 采用所设计的引物,从cDNA扩增出约660bp左右的人抗体重链Fd段基因及轻链基因[4](图1)。
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图1 人抗体Fd段基因及轻链基因的PCR产物
Fig1 The PCR products of Fd fragment and light chain genes of human antibody
1：DNA markers,pGEM7zf(+)HaeⅢ;2：Fd gene;3：Light chain gene
2.2 人抗体Fd段基因的克隆及酶切鉴定 将扩增产物(660bp的Fd段基因)克隆入pcomb3载体，重组质粒为pcomb3-Fd。经XhoI及SpeI双酶切鉴定，6个菌落提取的质粒中3个含660bp片段，即为插入的目的基因Fd段(图2)。用XhoI和EcoRI双酶切pcomb3-Fd重组质粒，将含Fd段基因的片段亚克隆入pGEM7zf，重组质粒为pGEM7zf-Fd。经XhoI和EcoRI双酶切鉴定，6个菌落提取的质粒中3个含1.5kb左右的片段(图3)。
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图2 重组质粒pcomb3-Fd的酶切鉴定
Fig2 Identification of recombinant plasmid pcomb3-Fd by enzyme digestion
1:DNAmarkers,pGEM7zf(+)Hae Ⅲ;3,6,7:Positive clones;2,4,5:Negative clones
图3 重组质粒pGEM7zf-Fd的酶切鉴定
Fig3 Identification of recombinant plasmid pGEM7zf-Fd by enzyme digestion
7:DNAmarkers,λDNA/EcoR I+ HindⅢ;2,3,5:Positive clones;1,4,6:Negative clones
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2.3 人抗体Fd段基因的序列分析 自动测序结果表明，Fd段基因全长为639bp，编码213个氨基酸，属于人IgG2亚类。其核苷酸序列及推导的氨基酸序列见图4。
图4 人抗体Fd段基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Fd gene in human antibody
3 讨论
本研究参照文献设计并改进了引物，采用逆转录、半套式PCR的方法，成功地从HFRS恢复期患者PBL中扩增出人抗体Fd段基因及轻链基因。本文使用的引物含有简并码，不仅可最大限度地和模板匹配[5]，同时可节约一定的经费。采用半套式PCR，还可提高扩增的敏感性和特异性。本研究将得到的Fd段基因克隆入噬菌体表达载体pcomb3，构建了一个Fd段基因库，库容量为3×105。再将Fd段基因亚克隆入pGEM7zf，进行序列分析，结果表明，此Fd段基因属于人IgG2亚类。在此基础上，下一步便可以克隆轻链基因，并设法提高Fd段及轻链基因库的容量[6]和克隆效率，构建一个较理想的人Fab抗体库。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目，No.39570661
作者简介：吴兴安，男，31岁，博士生。西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526
参考文献
[1]Winter G, Griffiths AD, Robert E, et al. Making antibodies by phage display technology. Ann Rev Immunol,1994;12:433
[2]Kang AS, Burton DR, Jones TM, et al. Combinatorial immunoglobulin libraries in phage λ .Methods: A companion to method in enzymol,1991;2(2):111～118
, 百拇医药
[3]Marks JD, Hoogenboom HK, Bonnert TP, et al. By-passing immunization/human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol,1991;222(3):581～597
[4]Barbas CF, Burton DR, Darid L, et al. Monoclonal antibodies from combinatorial libraries. Laboratory Mannal. Cold Spring Harbor Laboratory. 1993:29
[5]Larrick JW, Danielsson L, Brenner CA, et al. Polymerase chain reaction using mixed primer:cloning of human monoclonal antibody variable region genes from single hybridoma cells. Bio/Technol,1989;7:934～938
[6]Waterhouse P, Griffiths AD, Johnson KS, et al. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. Nucleic Acids Res,1993;21(9):2265～2266
收稿：1999-01-07
修回：1999-02-26, 百拇医药
单位：第四军医大学微生物学教研室，西安，710032
关键词：HFRS病毒；聚合酶链反应；免疫球蛋白；Fd段基因；测序
细胞与分子免疫学杂志990205摘 要：从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞(PBL)中提取细胞总RNA，反转录成cDNA。以之为模板，用半套式聚合酶链反应(PCR)扩增人IgG抗体Fd段及轻链基因，并将Fd段基因克隆入噬菌体载体pcomb3；经酶切鉴定后，再亚克隆入pGEM7zf，筛选阳性克隆测序。经计算机分析，Fd段基因的全长为639bp，编码213个氨基酸，属于人IgG2亚类。
中国图书资料分类号：Q78
Amplification of genes of human antibodies against HFRS virus
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using semi-nested polymerase chain reaction and
cloning, sequencing of Fd fragments
Wu Xingan, Xu Zhikai,Yan Yan, Bai Wentao, Wang Haitao, Zhang Fanglin, Xue Xiaoping.
(Department of Microbiology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords：HFRS virus PCR immunoglobulin Fd fragment gene sequencing
Abstract：The total cell RNA extracted from peripheral lymphocytes of HFRS patient was transcribed reversely into cDNA. The Fd fragments and light chain genes of human antibodies were amplified from cDNA using semi-nested polymerase chain reaction. Fd fragments genes were cloned into vector pcomb3 and pGEM7zf. One of positive clones selected randomly was sequenced.The results indicated that the Fd fragment gene consisted of 639bp, encoded 213 amino acid residues,and belonged to human IgG2.
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肾综合征出血热(HFRS)在我国是危害最严重的病毒性传染病之一，目前尚无特异有效的治疗方法。90年代出现的噬菌体抗体库技术[1]已用于制备人源性mAb，可克服用杂交瘤技术制备人源性mAb所遇到的一些难题，如融合率不高，杂交瘤不稳定和抗体产量低等。获得人抗体基因是用噬菌体抗体库技术制备人mAb的关键。本文参照文献[2,3]设计了一组扩增人抗体Fd段基因及轻链基因的引物,从HFRS恢复期患者外周血淋巴细胞(PBL)中，成功地扩增出Fd段基因及轻链基因，并对Fd段基因进行了克隆及序列分析。
1 材料和方法
1.1 人PBL的分离 采取抗HFRS IgG阳性的HFRS恢复期患者血液，用淋巴细胞分离液按常规方法分离PBL。
1.2 总RNA的提取及逆转录 用Gibco公司的TrizolReagent,提取淋巴细胞中的RNA，并用Promega公司的Reverse Transcription System逆转录得到cDNA第1链，具体方法均参照其说明书进行。
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1.3 PCR引物的设计 参照文献[2,3]，设计用于扩增人抗体重链Fd段基因及轻链基因的引物，引的序列如下:
HuHL1:5′-ATGGACTGGTCCAGGAG(GC)(GTA)TC(CT)T(CT)T-3′
HuHL2:5′-ATGGAG(CT)T(GT)GGGCTGAGCTGG(GAC)TTTT-3′
HuHL3:5′-ATGAAACA(TC)CT(GT)TG(GT)(TC)TC(AT)TC(CT)T(TC)CT-3′
HuCHs:5′-AGCACTAGTTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTT-3′
HuB1X:5′-CAGCTCGAGCAGTCTGG(AG)GC(AT)GAGGTG-3′
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HuB3X:5′-CAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAG-3′
HuKL1:(5′-ATGAGG(GC)TCC(TC)(TC)(AG)CTC(AT)GCT(CT)CTGGGG-3′
HuKL2:5′-ATGGAA(AG)CCC(AC)(AG)(AG)C(GT)CA(GC)(GC)T(TC)(TC)TC-3′
HvKBs:5′-CAGCCATGGCCGAGCTCAC(GC)CAGTCTCC-3′
HucKXb:5′-GCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAGGCC-3′
HuHL1,HuHL2和HuHL3为重链前导肽引物，HuCHs为重链恒定区1(CH1)引物，HuB1X和HuB3X为重链框架区(FR1)引物。HuKL1和HuKL2为轻链前导肽引物，HvKBs为轻链框架区(FR1)引物，HucKXb为轻链恒定区(Cκ)引物，引物中均含简并码。
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1.4 半套式PCR扩增重链Fd段基因及轻链基因 取上述逆转录反应液5μl，用重链前导肽引物和CH1引物配对进行PCR，然后用重链FR1及重链CH1引物配对做第2轮PCR扩增Fd段基因。同理，用轻链前导肽引物和Cκ引物配对做半套式PCR，再用轻链FR1区及Cκ引物做第2轮PCR扩增轻链基因。反应条件如下：反应体积100μl，每端引物加45pmol，于94℃、1min;50℃、1min;72℃、1.5min;扩增35个循环。
1.5 人抗体重链Fd段基因的克隆及序列分析 将重链Fd段基因克隆入pcomb3载体，用Xho I及Spe I酶切鉴定是否有目的基因片段插入。然后用Xho I和EcoR I将插入片段切下,再亚克隆入pGEM7zf，酶切鉴定筛选阳性克隆，任选1个克隆进行自动测序。
2 结果
2.1 PCR扩增人抗体重链Fd段基因及轻链基因 采用所设计的引物,从cDNA扩增出约660bp左右的人抗体重链Fd段基因及轻链基因[4](图1)。
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图1 人抗体Fd段基因及轻链基因的PCR产物
Fig1 The PCR products of Fd fragment and light chain genes of human antibody
1：DNA markers,pGEM7zf(+)HaeⅢ;2：Fd gene;3：Light chain gene
2.2 人抗体Fd段基因的克隆及酶切鉴定 将扩增产物(660bp的Fd段基因)克隆入pcomb3载体，重组质粒为pcomb3-Fd。经XhoI及SpeI双酶切鉴定，6个菌落提取的质粒中3个含660bp片段，即为插入的目的基因Fd段(图2)。用XhoI和EcoRI双酶切pcomb3-Fd重组质粒，将含Fd段基因的片段亚克隆入pGEM7zf，重组质粒为pGEM7zf-Fd。经XhoI和EcoRI双酶切鉴定，6个菌落提取的质粒中3个含1.5kb左右的片段(图3)。
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图2 重组质粒pcomb3-Fd的酶切鉴定
Fig2 Identification of recombinant plasmid pcomb3-Fd by enzyme digestion
1:DNAmarkers,pGEM7zf(+)Hae Ⅲ;3,6,7:Positive clones;2,4,5:Negative clones
图3 重组质粒pGEM7zf-Fd的酶切鉴定
Fig3 Identification of recombinant plasmid pGEM7zf-Fd by enzyme digestion
7:DNAmarkers,λDNA/EcoR I+ HindⅢ;2,3,5:Positive clones;1,4,6:Negative clones
, http://www.100md.com
2.3 人抗体Fd段基因的序列分析 自动测序结果表明，Fd段基因全长为639bp，编码213个氨基酸，属于人IgG2亚类。其核苷酸序列及推导的氨基酸序列见图4。
图4 人抗体Fd段基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Fd gene in human antibody
3 讨论
本研究参照文献设计并改进了引物，采用逆转录、半套式PCR的方法，成功地从HFRS恢复期患者PBL中扩增出人抗体Fd段基因及轻链基因。本文使用的引物含有简并码，不仅可最大限度地和模板匹配[5]，同时可节约一定的经费。采用半套式PCR，还可提高扩增的敏感性和特异性。本研究将得到的Fd段基因克隆入噬菌体表达载体pcomb3，构建了一个Fd段基因库，库容量为3×105。再将Fd段基因亚克隆入pGEM7zf，进行序列分析，结果表明，此Fd段基因属于人IgG2亚类。在此基础上，下一步便可以克隆轻链基因，并设法提高Fd段及轻链基因库的容量[6]和克隆效率，构建一个较理想的人Fab抗体库。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目，No.39570661
作者简介：吴兴安，男，31岁，博士生。西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526
参考文献
[1]Winter G, Griffiths AD, Robert E, et al. Making antibodies by phage display technology. Ann Rev Immunol,1994;12:433
[2]Kang AS, Burton DR, Jones TM, et al. Combinatorial immunoglobulin libraries in phage λ .Methods: A companion to method in enzymol,1991;2(2):111～118
, 百拇医药
[3]Marks JD, Hoogenboom HK, Bonnert TP, et al. By-passing immunization/human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol,1991;222(3):581～597
[4]Barbas CF, Burton DR, Darid L, et al. Monoclonal antibodies from combinatorial libraries. Laboratory Mannal. Cold Spring Harbor Laboratory. 1993:29
[5]Larrick JW, Danielsson L, Brenner CA, et al. Polymerase chain reaction using mixed primer:cloning of human monoclonal antibody variable region genes from single hybridoma cells. Bio/Technol,1989;7:934～938
[6]Waterhouse P, Griffiths AD, Johnson KS, et al. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. Nucleic Acids Res,1993;21(9):2265～2266
收稿：1999-01-07
修回：1999-02-26, 百拇医药