HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达
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山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：陈华波 赵蔚明 于修平 周亚滨 卞继峰 栾怡
单位：山东医科大学微生物学与免疫学教研室
关键词：乳头状瘤病毒；人；克隆；分子；真核细胞
山东医科大学学报000204
摘 要：目的：探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法：采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段，将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体，脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果：成功构建了真核表达质粒pLNCE6C，免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论：选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试，为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。
, 百拇医药
分类号：R373.1；Q785 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0123-03
GENE CLONINGAND AND EUKARYOTIC EXPRESSION OF HPV16E6 C-TERMINAL REGION
CHEN Hua-bo ,ZHAO Wei-ming ,YU Xlu-ping
(Dept.of Microbiology and Immunology，Shandong Medical University)
Abstract：Objectives: To explore the feasibility of utilizing the gene fragment of C-terminal region of human papillomavirus type 16 E6(HPV16 E6)for DNA vaccine.Methods:E6C gene fragment was amplified from genome of pHPV16 by PCR, and cloned into eukaryotic plasmid pLNCX, then teansfected LA795 cell with the recombinant plasmid pLNCE6C using lipofectamine reagent. Results: The result showed recombinant pLNCE6C was successfully constructed and the E6 protein was detected by immunohistochemistry in the transfected cells. Conclusion: This study provides a good basis for further research on HPV16 E6C DNA vaccine.
, 百拇医药
Keywords：Papillomavirus,human; Clone, molecule;Eukaryotic cell 研究表明，高危型人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16，HPV16)早期基因E6可在HPV相关肿瘤中持续表达，是研制HPV治疗性疫苗的重要靶抗原之一。体外试验也证明E6蛋白上存有T细胞和B细胞免疫表位。但由于E6是转化基因，采用全长E6具有恶性转化的危险性，对E6基因进行适当改造，去除转化活性保留其免疫原性是构建人体疫苗的前提。自然感染的HPV16免疫原性低下，不能有效激发机体产生特异性抗肿瘤免疫效应。通过DNA疫苗介导的免疫可望达到增强免疫、防治HPV相关肿瘤的目的，具有良好的应用前景[1]。
本研究根据HPV16E6免疫表位的研究进展，选择HPV16早期基因E6羧基(C)端基因片段(去除氨基端转化活性部位，保留大部分免疫表位)构建含CMV启动子的真核表达质粒并在体外观察其表达，为进一步动物体内基因免疫试验打下基础。
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1材料与方法
1.1材料
1.1.1载体、菌种及细胞株质粒pHPV16由美国Galloway教授惠赠，质粒pLNCX由Thomas教授惠赠。pGEMTEasy载体购于北京化学试剂公司，工程菌DH5a，JM109为本室贮存，LA795小鼠肺腺癌细胞由本校附属医院刘春生副教授惠赠。
1.1.2引物设计参照HPV16全序列及引物设计原则，利用计算机软件设计E6CPCR引物，扩增HPV16E6C基因片段(nt254-559)。上游引物在ATG前加HindⅢ内切酶识别序列及Kozak序列，下游引物加ClaⅠ内切酶识别序列。引物序列如下：E6C上游引物：5’CCGCTAAGCTTCCACCATGTGCATAGTAG3’E6C下游引物：5’CGCCTATCGATTTACAGCTGGGTTTCTCTACG3’引物合成由北京赛百盛(美国)生物工程公司代理，OPC纯化。
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1.1.3主要试剂限制性内切酶HindⅢ、ClaⅠ、TaqDNA聚合酶，T4连接酶，LipofectamineReagent,G418,RPMI1640均为GIBCO公司产品；兔抗HPV16多克隆抗体由Galloway教授惠赠。
1.2方法
1.2.1PCR扩增以质粒pHPV16为模板PCR扩增E6C基因片段。PCR扩增按常规方法进行，最后延伸时间加长至15min。PCR产物纯化后采用上游引物做自动荧光DNA测序。
1.2.2E6CTA克隆构建用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增时，最后延伸时间加长可使绝大部分PCR产物带有单个3‘A外凸末端。利用这一特性，使之与3’端带有T外凸末端的线性载体pGEM-TEasy直接相连，于4℃连接过夜，转化JM109感受态菌，蓝/白斑筛选阳性菌落，EcoRI酶切鉴定重组体pTACE6C。
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1.2.3E6C真核表达质粒pLNCE6C构建TA克隆质粒pT16E6C经HindⅢ和ClaⅠ双酶切，低熔点琼脂糖法回收片段E6C，定向重组入表达质粒pLNCX，转化DH5a感受态菌，酶切鉴定重组体。
1.2.4细胞转染及筛选pLNCE6C质粒经PEC法纯化，以脂质体转染的方法导人37℃5%CO2条件下培养至60%汇合的LA795细胞中，用G418筛选导入质粒的细胞。
1.2.5转染基因在细胞中表达的检测将筛选出的阳性细胞接种于加盖玻片的6孔培养板，待细胞长至80%汇合，取出盖玻片，做间接免疫细胞化学染色，检测LA195细胞中的E6C基因的表达(一抗为抗E6兔抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔抗体)
2结果
2.1PCR扩增及DNA序列测定结果利用特异引物以pHPV16为模板扩增出约320bp的E6CDNA片段(n5254～559)，该片段编码E6第51～151位氨基酸，PCR产物两端分别带有HindⅢ和ClaⅠ酶切位点。经自动荧光DNA测序鉴定其序列正确。
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2.2TA克隆PTA16E6C的构建PCR扩增片段E6C与T载体相连，重组体经EcoRI酶切释放出约350bp的DNA片段，证实E6C基因片段已插入pGEM-TEasy载体。
2.3真核表达质粒pLNCE6C的构建PTA16E6C质粒经HindⅢ和ClaⅠ双酶切，回收E6C片段，定向重组入pLNCX。重组体经HindⅢ和ClaⅠ双酶切释放E6C片段(见图1)，证实E6C基因片段已重组入pLNCX。
图1表达质粒pLNCE6C酶切结果
1：DNAmarker12：DNAmarker23：质粒pLNCE6C的HindⅢ、claⅠ酶切结果4：质粒pLNCE6C的HindⅢ酶切结果5：质粒pLNCE6C
Fig.1DigestiveanalysisforrecombinantplasmidpLNCE6C
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1:λDNA/HindⅢ2:pBR322/HinfⅠ3:pLNCE6C/HindⅢ+ClaⅠ4:pLNCE6C/HindⅢ5:pLNCE6C
2.4脂质体转染及免疫组化结果质粒pLNCE6C转染LA795细胞，经G418筛选获得的阳性克隆做免疫细胞化学染色。结果显示转染细胞呈棕色(见图2)，表明E6C蛋白获得有效表达。
图2pLNCE6C转染LA795细胞免疫组化染色
Fig.2ImmunochemistralassayofcellstransfectedwithpLNCE6Cplasmid
3讨论
目前，HPV相关肿瘤治疗性疫苗抗原基因的研究多集中于早期基因E6和E7。研究者希望通过E6和(或)E7疫苗接种，增强免疫原性，激发特异的CTL反应，从而对表达同样抗原的肿瘤细胞发挥杀伤效应。此设想已通过动物试验得到证实，采用HPV16E6重组病毒疫苗已在小鼠体内成功诱导特异的细胞免疫反应[2]。然而，由于E6是转化基因，利用全长E6直接作为疫苗具有诱导细胞恶性转化的危险性，所以去除E6的转化活性，保留其免疫原性是利用E6研制HPV疫苗的前提。
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HPV16E6开放读码框架(openreadingframe，ORF)位于65-559核苷酸，编码含151个氨基酸的小分子量核磷蛋白。通过E6突变体的功能研究发现：E6氨基端突变体降解p53的活性丧失怠尽。NakagawaS等研究也发现E6蛋白第一锌指区突变，其转化功能完全丧失。提示E6蛋白的N端是其恶性转化功能所必需的[3]。而许多资料亦表明E6蛋白C端含大多数免疫表位[4]。根据E6免疫学研究的进展，我们设计了HPV16E6C端PCR引物，得到N端缺失的E6C基因片段(nt254～559)，以此作为疫苗的抗原基因，期望在消除完整E6蛋白潜在致癌性的前提下研究其诱导特异免疫反应的作用。
DNA疫苗是指含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA，经直接接种体内后，被体细胞摄取、表达相应的抗原，然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答。目前基因免疫这项技术已用于多种传染病、肿瘤及自身免疫病的实验研究[5]。真核表达质粒是DNA疫苗的主体。表达载体表达抗原蛋白的能力越强，诱发宿主免疫应答越强。DNA进入人体后，其激活机体反应的时间、强度与表达启动子强度密切相关。根据ChengL等报道[6]，CMVIE和RSV启动子是适应性较广的启动子，对肌肉注射而言，CMVIE更为理想。另外改建质粒结构，如在构建的真核表达质粒中添加免疫激活DNA序列(ISS)，以及增强真核表达的Kozak序列等，也可增强DNA疫苗的表达效率及免疫效果[7]。本研究选择的表达质粒含氨苄抗性选择基因，因氨苄抗性选择基因含有ISS，保证了其免疫激活作用。在设计PCR引物时，我们在起始密码ATG前加入了Kozak序列，对在真核细胞内获得有效表达起到了促进作用。体外转染结果显示本研究构建的含CMVIE启动子表达质粒pLNCE6C能在LA795真核细胞中有效表达E6C蛋白，证明HPV16E6C真核表达质粒构建成功。此工作为进一步进行动物实验研究HPVE6CDNA疫苗的免疫效果奠定了基础。
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基金项目：山东省科委资助课题
参考文献：
[1]Lowy DR.HPV infection:future prospects[J],Clin Dermatol,1997,25:299
[2]Gao L,Chain B,Sinclair C,et al.Immune response to human papillomavirus type 16 E6 gene in a live vaccinia vector[J],J Gen Virol,1994,75:157
[3]Nakagawa S,Watanabe S,Yoshikawa H,et al.Mutational analysis of human papillomavirus type 16 E6 protein:transforming function for human cells and degradation of p53 in vitro[J].J Virol,1995,212(2):535
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[4]陈华波，于修平.人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展[J].国外医学微生物学分册，1998，21(5)：11
[5]Tang DC,Devit M, Johnston SA,et al. Genetic immunization is a sample method for eliciting an immune response[J].Nature,1992,358(6365):152
[6]Cheng L,Zieglhoffer PR,Yang NS,et al.In vivo promoter activity and trangene expression in mammalian somatic tissues evaluated by using particale bombardment[J].PNAS,1993;90:4455
[7]Tighe H,Corr M,Roman M,et al.Gene vaccination:plamid DNA is more than just a blueprint[J].Immunol Today,1998,19(2):89
收稿日期：1999-03-21, http://www.100md.com
单位：山东医科大学微生物学与免疫学教研室
关键词：乳头状瘤病毒；人；克隆；分子；真核细胞
山东医科大学学报000204
摘 要：目的：探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法：采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段，将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体，脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果：成功构建了真核表达质粒pLNCE6C，免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论：选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试，为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。
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分类号：R373.1；Q785 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0123-03
GENE CLONINGAND AND EUKARYOTIC EXPRESSION OF HPV16E6 C-TERMINAL REGION
CHEN Hua-bo ,ZHAO Wei-ming ,YU Xlu-ping
(Dept.of Microbiology and Immunology，Shandong Medical University)
Abstract：Objectives: To explore the feasibility of utilizing the gene fragment of C-terminal region of human papillomavirus type 16 E6(HPV16 E6)for DNA vaccine.Methods:E6C gene fragment was amplified from genome of pHPV16 by PCR, and cloned into eukaryotic plasmid pLNCX, then teansfected LA795 cell with the recombinant plasmid pLNCE6C using lipofectamine reagent. Results: The result showed recombinant pLNCE6C was successfully constructed and the E6 protein was detected by immunohistochemistry in the transfected cells. Conclusion: This study provides a good basis for further research on HPV16 E6C DNA vaccine.
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Keywords：Papillomavirus,human; Clone, molecule;Eukaryotic cell 研究表明，高危型人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16，HPV16)早期基因E6可在HPV相关肿瘤中持续表达，是研制HPV治疗性疫苗的重要靶抗原之一。体外试验也证明E6蛋白上存有T细胞和B细胞免疫表位。但由于E6是转化基因，采用全长E6具有恶性转化的危险性，对E6基因进行适当改造，去除转化活性保留其免疫原性是构建人体疫苗的前提。自然感染的HPV16免疫原性低下，不能有效激发机体产生特异性抗肿瘤免疫效应。通过DNA疫苗介导的免疫可望达到增强免疫、防治HPV相关肿瘤的目的，具有良好的应用前景[1]。
本研究根据HPV16E6免疫表位的研究进展，选择HPV16早期基因E6羧基(C)端基因片段(去除氨基端转化活性部位，保留大部分免疫表位)构建含CMV启动子的真核表达质粒并在体外观察其表达，为进一步动物体内基因免疫试验打下基础。
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1材料与方法
1.1材料
1.1.1载体、菌种及细胞株质粒pHPV16由美国Galloway教授惠赠，质粒pLNCX由Thomas教授惠赠。pGEMTEasy载体购于北京化学试剂公司，工程菌DH5a，JM109为本室贮存，LA795小鼠肺腺癌细胞由本校附属医院刘春生副教授惠赠。
1.1.2引物设计参照HPV16全序列及引物设计原则，利用计算机软件设计E6CPCR引物，扩增HPV16E6C基因片段(nt254-559)。上游引物在ATG前加HindⅢ内切酶识别序列及Kozak序列，下游引物加ClaⅠ内切酶识别序列。引物序列如下：E6C上游引物：5’CCGCTAAGCTTCCACCATGTGCATAGTAG3’E6C下游引物：5’CGCCTATCGATTTACAGCTGGGTTTCTCTACG3’引物合成由北京赛百盛(美国)生物工程公司代理，OPC纯化。
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1.1.3主要试剂限制性内切酶HindⅢ、ClaⅠ、TaqDNA聚合酶，T4连接酶，LipofectamineReagent,G418,RPMI1640均为GIBCO公司产品；兔抗HPV16多克隆抗体由Galloway教授惠赠。
1.2方法
1.2.1PCR扩增以质粒pHPV16为模板PCR扩增E6C基因片段。PCR扩增按常规方法进行，最后延伸时间加长至15min。PCR产物纯化后采用上游引物做自动荧光DNA测序。
1.2.2E6CTA克隆构建用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增时，最后延伸时间加长可使绝大部分PCR产物带有单个3‘A外凸末端。利用这一特性，使之与3’端带有T外凸末端的线性载体pGEM-TEasy直接相连，于4℃连接过夜，转化JM109感受态菌，蓝/白斑筛选阳性菌落，EcoRI酶切鉴定重组体pTACE6C。
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1.2.3E6C真核表达质粒pLNCE6C构建TA克隆质粒pT16E6C经HindⅢ和ClaⅠ双酶切，低熔点琼脂糖法回收片段E6C，定向重组入表达质粒pLNCX，转化DH5a感受态菌，酶切鉴定重组体。
1.2.4细胞转染及筛选pLNCE6C质粒经PEC法纯化，以脂质体转染的方法导人37℃5%CO2条件下培养至60%汇合的LA795细胞中，用G418筛选导入质粒的细胞。
1.2.5转染基因在细胞中表达的检测将筛选出的阳性细胞接种于加盖玻片的6孔培养板，待细胞长至80%汇合，取出盖玻片，做间接免疫细胞化学染色，检测LA195细胞中的E6C基因的表达(一抗为抗E6兔抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔抗体)
2结果
2.1PCR扩增及DNA序列测定结果利用特异引物以pHPV16为模板扩增出约320bp的E6CDNA片段(n5254～559)，该片段编码E6第51～151位氨基酸，PCR产物两端分别带有HindⅢ和ClaⅠ酶切位点。经自动荧光DNA测序鉴定其序列正确。
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2.2TA克隆PTA16E6C的构建PCR扩增片段E6C与T载体相连，重组体经EcoRI酶切释放出约350bp的DNA片段，证实E6C基因片段已插入pGEM-TEasy载体。
2.3真核表达质粒pLNCE6C的构建PTA16E6C质粒经HindⅢ和ClaⅠ双酶切，回收E6C片段，定向重组入pLNCX。重组体经HindⅢ和ClaⅠ双酶切释放E6C片段(见图1)，证实E6C基因片段已重组入pLNCX。
图1表达质粒pLNCE6C酶切结果
1：DNAmarker12：DNAmarker23：质粒pLNCE6C的HindⅢ、claⅠ酶切结果4：质粒pLNCE6C的HindⅢ酶切结果5：质粒pLNCE6C
Fig.1DigestiveanalysisforrecombinantplasmidpLNCE6C
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1:λDNA/HindⅢ2:pBR322/HinfⅠ3:pLNCE6C/HindⅢ+ClaⅠ4:pLNCE6C/HindⅢ5:pLNCE6C
2.4脂质体转染及免疫组化结果质粒pLNCE6C转染LA795细胞，经G418筛选获得的阳性克隆做免疫细胞化学染色。结果显示转染细胞呈棕色(见图2)，表明E6C蛋白获得有效表达。
图2pLNCE6C转染LA795细胞免疫组化染色
Fig.2ImmunochemistralassayofcellstransfectedwithpLNCE6Cplasmid
3讨论
目前，HPV相关肿瘤治疗性疫苗抗原基因的研究多集中于早期基因E6和E7。研究者希望通过E6和(或)E7疫苗接种，增强免疫原性，激发特异的CTL反应，从而对表达同样抗原的肿瘤细胞发挥杀伤效应。此设想已通过动物试验得到证实，采用HPV16E6重组病毒疫苗已在小鼠体内成功诱导特异的细胞免疫反应[2]。然而，由于E6是转化基因，利用全长E6直接作为疫苗具有诱导细胞恶性转化的危险性，所以去除E6的转化活性，保留其免疫原性是利用E6研制HPV疫苗的前提。
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HPV16E6开放读码框架(openreadingframe，ORF)位于65-559核苷酸，编码含151个氨基酸的小分子量核磷蛋白。通过E6突变体的功能研究发现：E6氨基端突变体降解p53的活性丧失怠尽。NakagawaS等研究也发现E6蛋白第一锌指区突变，其转化功能完全丧失。提示E6蛋白的N端是其恶性转化功能所必需的[3]。而许多资料亦表明E6蛋白C端含大多数免疫表位[4]。根据E6免疫学研究的进展，我们设计了HPV16E6C端PCR引物，得到N端缺失的E6C基因片段(nt254～559)，以此作为疫苗的抗原基因，期望在消除完整E6蛋白潜在致癌性的前提下研究其诱导特异免疫反应的作用。
DNA疫苗是指含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA，经直接接种体内后，被体细胞摄取、表达相应的抗原，然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答。目前基因免疫这项技术已用于多种传染病、肿瘤及自身免疫病的实验研究[5]。真核表达质粒是DNA疫苗的主体。表达载体表达抗原蛋白的能力越强，诱发宿主免疫应答越强。DNA进入人体后，其激活机体反应的时间、强度与表达启动子强度密切相关。根据ChengL等报道[6]，CMVIE和RSV启动子是适应性较广的启动子，对肌肉注射而言，CMVIE更为理想。另外改建质粒结构，如在构建的真核表达质粒中添加免疫激活DNA序列(ISS)，以及增强真核表达的Kozak序列等，也可增强DNA疫苗的表达效率及免疫效果[7]。本研究选择的表达质粒含氨苄抗性选择基因，因氨苄抗性选择基因含有ISS，保证了其免疫激活作用。在设计PCR引物时，我们在起始密码ATG前加入了Kozak序列，对在真核细胞内获得有效表达起到了促进作用。体外转染结果显示本研究构建的含CMVIE启动子表达质粒pLNCE6C能在LA795真核细胞中有效表达E6C蛋白，证明HPV16E6C真核表达质粒构建成功。此工作为进一步进行动物实验研究HPVE6CDNA疫苗的免疫效果奠定了基础。
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基金项目：山东省科委资助课题
参考文献：
[1]Lowy DR.HPV infection:future prospects[J],Clin Dermatol,1997,25:299
[2]Gao L,Chain B,Sinclair C,et al.Immune response to human papillomavirus type 16 E6 gene in a live vaccinia vector[J],J Gen Virol,1994,75:157
[3]Nakagawa S,Watanabe S,Yoshikawa H,et al.Mutational analysis of human papillomavirus type 16 E6 protein:transforming function for human cells and degradation of p53 in vitro[J].J Virol,1995,212(2):535
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[4]陈华波，于修平.人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展[J].国外医学微生物学分册，1998，21(5)：11
[5]Tang DC,Devit M, Johnston SA,et al. Genetic immunization is a sample method for eliciting an immune response[J].Nature,1992,358(6365):152
[6]Cheng L,Zieglhoffer PR,Yang NS,et al.In vivo promoter activity and trangene expression in mammalian somatic tissues evaluated by using particale bombardment[J].PNAS,1993;90:4455
[7]Tighe H,Corr M,Roman M,et al.Gene vaccination:plamid DNA is more than just a blueprint[J].Immunol Today,1998,19(2):89
收稿日期：1999-03-21, http://www.100md.com