表达β-1，3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因烟草及其抗真菌病的研究
作者：蓝海燕 田颖川 王长海 刘桂珍 张丽华 王兰岚 陈正华
单位：蓝海燕 田颖川 王长海(新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830000)；蓝海燕 刘桂珍 张丽华 王兰岚 陈正华(中国科学院遗传研究所，北京 100101)
关键词：β-1，3-葡聚糖酶基因；几丁质酶基因；转基因烟草；抗真菌病
遗传学报000112
摘要：利用烟草碱性β-1，3-葡聚糖酶及菜豆碱性几丁质酶基因构建了组成型表达的双价植物表达载体pBLGC,利用农杆菌介导法转化了烟草，并得到了转基因植株。对其进行分子生物学分析的结果表明，部分转基因植株在所有检测中都显示较强的阳性反应，这说明外源基因已整合到烟草基因组中并得到正确表达。活体接菌实验初步表明，转基因植株与对照相比，对赤星病的侵染具有较强的抵抗能力。
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中图分类号：Q812 文献标识码：A
文章编号：0379-4172(2000)01-0070-0077
Studies of Transgenic Tobacco Plants Expressing β-1,3-Glucanase and Chitinase Genes and Their Potential for Fungal Resistance
LAN Hai-Yan,LIU Gui-Zhen,ZHANG Li-Hua,WANG Lan-Lan,CHEN Zheng-Hua
(Institute of Genetics Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)
TIAN Ying-Chuan
, 百拇医药
(Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China)
WANG Chang-Hai
(Institute of Industrial Crops Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830000,China)
Abstract:Plant bivalent expression vector pBLGC for basic tobacco β-1,3-glucanase and bean chitinase genes were constructed,and the tobacco tissue was transformed.Transgenic tobacco plants were carried out for analysis by PCR,PCR-Southern blot,Dot blot,Western blot,etc.,and the results showed that some transgenic plants gave strong positive signal,it suggested that foreign genes have been integreted into tobacco genome,and expressed correctly.Fungal challenge with Alternaria alternata showed that transgenic plants were much more resistant to this pathogenic fungus.
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Key words:β-1;3-glucanase gene;chitinase gene;fungal resistance;transgenic tobacco plant
当植物受到病原菌及其他胁迫条件诱导时，会产生大量的病程相关蛋白(PRs)，它们与植物的防卫反应关系密切。迄今为止纯化到的PRs中，大多数具有几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性[1]。目前这两类蛋白也是报道最多的与抗真菌有关的蛋白。它们在体外能水解真菌细胞壁的两种主要成分——几丁质和葡聚糖，因而受到普遍关注。这两种酶均具有3种以上的类型，第类为碱性酶，分布在液泡中，在体外具较强抑菌活性；第、类为酸性酶，分布在细胞间隙，体外几乎无抑菌活性[2]，但可能与诱导早期防卫反应有关。总之，植物中不同类型的几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶在防卫反应中起着不同的作用.通常由于第Ⅰ类几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶可直接破坏真菌顶端生长平衡而被广泛用于植物抗真菌病基因工程中.体外抑菌实验已经证明，这两种酶同时作用于真菌时，具有很强的协同作用[3～5]，这一事实为抗真菌基因工程提供了依据。Zhu等(1994)利用组成型表达苜蓿β-1，3-葡聚糖酶 与水稻几丁质酶基因的转基因烟草做亲本，杂交筛选同时含有两种基因类型的植株，活体接菌实验结果表明，两者具有较高的协同效应，能有效抵抗尾孢菌(Cercospora nicotianae)的侵染[6]。
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基于上述研究结果，我们利用菜豆几丁质酶和烟草β-1，3-葡聚糖酶基因构建了双价植物表达载体.用此双价体转化了烟草，旨在探讨其抗真菌效应及转基因的遗传规律.目前已得到烟草转基因植株，并进行了活体接菌实验，现正对其子代的遗传及分离情况进行统计，期望在此工作基础上，为其他作物的抗真菌病转基因研究提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 植物转化所用烟草品种为K326。
1.1.2 菌种与质粒 DH5α为大肠杆菌受体菌，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为农杆菌受体菌，pD12为植物表达载体，pBLG为本实验室构建的植物表达载体(含β-1，3-葡聚糖酶cDNA)，pBch(含有几丁质酶cDNA)为本实验室构建的植物表达载体。
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1.1.3 酶与试剂 各种限制性内切酶购自Boehringer Mannhein、BRL、Bio朙ab及Promega等公司。Taq DNA聚合酶购自上海生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自Bio朙ab公司；DNA Labelling Kit (Ready-To-Go)购自Pharmacia公司，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔抗体NBT及BCIP购自Promega公司；β-1，3-葡聚糖酶兔抗血清由中科院遗传所实验动物中心协助制备.
1.1.4 测试真菌 链格孢菌(Alternaria alternata)菌种购自中科院微生物所菌种保藏室。将其转接到PDA培养基(马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g)上使菌丝在25℃～28℃光照下生长4周左右，然后用于接菌实验。
1.1.5 PCR引物 检测β-1ρ，3-葡聚糖酶 基因引物：5′GC GGATCC GACCATGG CTGCTATCACACTCC 3′；3′ 端引物： 5′CG GTCGAC CTCACATCTC ACTTACGAGA 3′。检测几丁质酶基因引物：5′端(CaMV355启动子)引物：5′CTGACGTAAGGGATGACGC 3′；3′ 端引物：5′GGGATGACAGTGTCACTGAG 3′。
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1.2 方法
1.2.1 植物双价表达载体的构建 植物表达载体pBch含有“35S启动子—菜豆几丁质酶cDNA—Nos终止子”的表达框架，利用基因两端相同的EcoRⅠ酶切位点，将基因切下，补平并回收片段；同时将植物表达载体pD12(含有35S启动子，增强子和Nos终止子)用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后补平，再与几丁质酶cDNA连接，得到表达载体pDch后，用HindⅢ将“35S启动子—Ω增强子—chi-cDNA—Nos终止子”表达框切下并回收此片段，与同样酶切并含有“35S启动子—Ω—glu-cDNA—Nos终止子”表达框的植物表达载体pBLG[7]连接，筛选转化子，酶切鉴定。
1.2.2 植物双价表达载体的农杆菌转化及鉴定 农杆菌感受态细胞制备、转化方法及鉴定参照文献[8]进行。
1.2.3 烟草叶片组织的遗传转化及抗Kan再生苗筛选 按文献[9]所述方法进行。
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1.2.4 转基因烟草的PCR及PCR-Southern杂交分析 (1)植物总DNA的提取：采用CTAB法，参照文献[10]方法进行。(2)转基因烟草的PCR分析：取以上制备的总DNA1μ1(～100ng)，用检测β-1，3-葡聚糖酶基因的引物，或几丁质酶基因的引物，按标准反应程序进行PCR扩增。具体条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。反应总体积为20μl，反应结束后，取10μlPCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳。(3)PCR-Southern杂交：取PCR阳性反应的产物在0.8%琼脂糖胶、80V电压下电泳1～2h后，按文献[11]方法进行转膜与杂交。用HindⅢ酶切(含几丁质酶基因)或EcoRⅠ酶切(含β-1，3-葡聚糖酶基因)植物双价表达载体pBLGC，分离并纯化含几丁质酶基因或β-1，3-葡聚糖酶基因的片段，用于探针标记.按Pharmacia公司DNA Labelling Kit (Ready-To-Go)提供的随机引物法标记探针。
, 百拇医药 1.2.5 转基因烟草的点杂交分析 将100～500ng总DNA点在尼龙膜上，使携带DNA的一面暴露于紫外光源(254nm)下2min，然后将此膜直接用于预杂交和杂交，具体操作同以上PCR-Southern杂交的程序。
1.2.6 转基因烟草的Western blot分析 参照文献[10]所述方法进行。其中一抗为免抗β-1，3-葡聚糖酶抗血清，此抗血清经过与非转基因烟草幼嫩叶征的丙酮处理干粉混合过夜，以消除抗血清中非特异成分以及烟草本身存在β-1，，3-葡聚糖酶基因的微量表达对转基因植株Western blot结果的影响。一抗按1：1000稀释。二抗为碱性磷酸酯酶标记的羊抗免抗体，按1：3000稀释。
1.2.7 转基因烟草的抗真菌实验 选取生长状况一致的转基因植株(5株)和非转基因植物(3株)，将带有菌丝体的培养基切成0.5×0.5cm2小块，用保鲜膜将有菌丝的一面粘贴在植株第2或第3层幼叶背面，并使之固定[6]，然后用透明大塑料袋将整株植物罩住，使之保持良好透光状态。真菌在28℃～30℃相对湿度达饱和状态下侵染植株10天后，观察感病情况。
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2 结果与讨论
2.1 植物双价表达载体的构建及农杆菌转化
植物表达载体pBch以植物表达载体pBin437为基础而构建[12]，它含有CaMV35S启动子，但不含有TMV“Ω”翻译增强子片段。为了增强其翻译水平，并减少几丁质酶基因两端的酶切位点(含有2个EcoRⅠ及BamHⅠ等位点，对进一步的载体构建不利)，将几丁质酶基因从最内端的两个EcoRⅠ位点切下，补平，插入用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后补平的载体pD12(含双表达框架的植物表达载体)即得到中间载体pDch，经酶切检查，几丁质酶基因以正确的方向插入载体中。用HindⅢ将pDch中含几丁质酶基因的表达框切下，插入到同样用HindⅢ酶切的植物表达载体pBLG(含有β-1，3-葡聚糖酶cDNA的植物表达载体)中，从而得到同时含有几丁质酶cDNA及β-1，3-葡聚糖酶cDNA两个表达框架的双价植物表达载体pBLGC(图1)。
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图1 双价植物表达载体pBLGC构建图谱
Fig.1 Construction map of bivalent expression vector pBLGC
分别用BamHⅠ+SalI、HindⅢ和EcoRⅠ3种酶对pBLG和pBLGC进行酶切。经BamHⅠ+SalI双酶切时，pBLG和pBLGC均能切出1条1.1kb的片段；当用HindⅢ或EcoRⅠ酶切时，pBLGC均能切出1条2.1kb大小的片段，而pBLG却只能被切成线性，未切出片段(图2)。这说明此双价表达载体的构建是正确的。
图2 双价植物表达载体pBLGC及单价植物表达载体pBLG酶切电泳分析
1，8：1kb DNA对照；2，3：pBLGC和pBLGC经BsmHⅠ和SalⅠ酶切；
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4，5：pBLG和pBLGC经EcoRⅠ酶切；6，7：pBLG和pBLGC经HindⅢ酶切
Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of plant expression vector pBLGC and pBLG
1，8：1kb DNA ladder；2，3：BamHⅠ/SalⅠ digestion of pBLG adn pBLGC；
4，5：EcoRⅠ digestion of pBLG adn pBLGC；6，7：HindⅢ digestion of pBLG and pBLGC
用转化根癌农杆菌的pBLGC侵染烟草叶片组织，在选择培养基上，我们共获得26株再生植株。
2.2 转化植株的PCR法鉴定
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以植物总DNA为模板，用可扩增β-1，3-葡聚糖酶cDNA及几丁质酶cDNA的引物进行PCR反应检测外源基因是否整合到基因组中。整合有外源基因的植株，PCR产物中应含有相应大小的片段(葡聚糖酶cDNA约1.08kb；几丁质酶cDNA本身大小为1.1kb，但由于5′端引物为35S启动子的引物，因此它扩增所得的片段大小约1.2kb)。对26株再生植株分别进行了两种基因的检测，PCR全部表现阳性(图3a，b)，这初步证明外源基因已整合到这些植物的基因组中。在β-1，3-葡聚糖酶cDNA的PCR检测中发现，除了1.1kb的条带，在约1.8kb处也出现1条带。这可能是由于烟草基因组本身就存在β-1，3-葡聚糖酶基因，而且饮食一个0.7kb的内含子，因此出现1条1.8kb的条带。
图3 转基因烟草的β-1，3-葡聚糖酶cDNA PCR检测的电泳分析
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(a)和转基因烟草的几丁质酶cDNA PCR检测的电泳分析(b)
a：1～13.转基因植株；14.非转基因植株；15.阳性对照；
b：1～4.转基因植株；5.非转基因植株；6.阳性对照；7.1kb DNA对照
Fig.3 Electrophoresis of PVR products of transgenic plant with β-1，3-glucanase cDNA primers.
(a)adn electrophoresis of PCR products of transgenic plant with chitinase cDNA primers (b)
a：1～13.Transgenic plants；14.Non-transgenic plant；15.Positive control；b：1～4.Transgenic plants；5.Non-transgenic plant；6.Positive control；7.1kb DNA ladder
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2.3 转基因烟草的PCR-Southern杂交及点杂交分析
将PCR检测为阳性的转基因植株总DNA进行PCR-Southern杂交及基因组DNA点杂交分析。PCR-Southern杂交结果(图4a，5a)显示，所测的两株PCR阳性的转基因植株在利用β-1，3-葡聚糖酶cDNA和几丁质酶cDNA做探针的Southern杂交中，结果也表现阳性，进一步说明了外源基因已整合到烟草基因组中。需要说明的是，图3a中显示出外源(1.1kb)及内源(1.8kb)葡聚糖酶基因的2条PCR带，而PCR-Southern杂交中只显示出1.1kb的条带，这可能由于两次PCR所用材料不同：前者为无菌苗所提总DNA，其含杂质少，质量较高；而后者为温室中生长2～3个月的植株，由此得到的总DNA质量较差，因此，内源的较大的葡聚糖酶基因片段未扩增出来。
图4 转基因烟草的β-1，3-葡聚糖酶cDNA的PCR-Southern杂交及点杂交分析
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a：PCR-Southern杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3、4.转基因植株.
b：点杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3～8.转基因植株
Fig.4 PCR-Southern blot and dot blot analysis of
tobacco transgenic plant with β-1，3-glucanase probe
a：PCR-Southern blot.1.Positive control;2.Non-transgenic plant;
3,4.Transgenic plants;b:Dot blot.1.Positive control;
, 百拇医药 2.Non-transgenic plant;3～8.Transgenic plants
图5 转基因烟草制造丁质酶cDNA的PCR-Southern杂交及点杂交分析
a：PCR-Sounthern杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3、4.转基因植株.
b：点杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3～8.转基因植株
Fig.5 PCR-Southern blot and Dot blot analysis of
tobacco transgenic plant with chitinase probe
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a:PCR-Southern blot.1.Positive control;2.Non-transgenic plant;
3,4.Transgenic plants.b:Dot blot.1.Positive control;
2.Non-transgenic plant;3～8.Transgenic plants
用5个转基因及1个非转基因植株进行点杂交，以质粒做阳性对照。结果显示(图4b，5b)，当分别用β-1，3-葡聚糖酶cDNA和几丁质酶cDNA做探针，转基因植株的总DNA均表现出较强的杂交信号；非转基因植株对β-1，3-葡聚糖酶cDNA探针表现阳性反应，这表明烟草本身含有此基因；而对几丁质酶cDNA探针则无此反应，这从另一方面说明外源基因已插入烟草基因组中。
2.4 转基因烟草的Western blot分析
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在本研究中，只对新克隆的β-1，3-葡聚糖酶基因构建了大肠杆菌表达载体，并制备了抗血清.而几丁质酶基因未做相同构建，所以这里只能检测转基因植株的β-1，3-葡聚糖酶基因的表达情况.对15株转基因植株进行了Western blot分析，其中有5株的蛋白可与β-113-葡聚糖酶 抗血清有较明显特异免疫反应(图6).这里我们所取的是植株顶部的幼嫩叶片，因崦，在总蛋白中，即使烟草本身存在的β-1，3-葡聚糖酶基因也有表达，其量是极低的.Keefe等(1990)认为，β-1，3-葡聚糖酶主要分布在老叶及根中，在植株的顶部几乎检测不到[13]。而且由于β-1，3-葡聚糖酶抗血清经非转基因植株幼嫩叶片的吸附处理，完全可以消除抗体对于本身基因微量表达的特异反应，而且这种吸附处理也使图6中的非特异条带大大降低(资料略)。其他PCR阳性的转基因植株在Western blot中的免疫反应不明显或无特异条带，原因可能为：蛋白的纯度或量不够。而这可能是由于内部本身的β-1，3-葡聚糖酶基因与外源导入的基因发生了共抑制效应，从而使得此基因表达量比非转基因植株还低[14]。
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图6 转基因烟草的β-1，3-葡聚糖酶 的Western blot分析
1～5.转基因植株(20μg总蛋白)；6.非转基因植株(20μg总蛋白)；
7.阳性对照(大肠杆菌表达产物)；8.阴性对照(大肠杆菌表达产物)；9.标准蛋白对照
Fig.6 Western blot analysis of tobacco transgenic plant with β-1,3-glucanase
1～5.Transgenic plants (20μg total protein);
6.Non-transgenic plant (20μg total protein);
7.Positive control (expression product in E.coli);
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8.Negative contro(expression product in E.coli);9.Standard protein marker
如图6所示，因为阳性对照中的为β-1，3-葡聚糖酶前体蛋白(包括n-端信号肽约2kDa、成熟蛋白约35kDa及C端导向肽约2kDa)，在植株体内，当此酶的前体穿过内质网膜进入液泡成为成熟蛋白过程中，经历了N-端信号肽及C-端导向肽的切除[15，16]。因此阳性对照中特异反应条带位于39kDa左右，而转基因植株样品中的特异性条带出现在35kDa左右，它们相差约4kDa，这说明外源基因产物在烟草植株中得到了正确加工。
2.5 转基因烟草的抑菌实验
从PCR阳性的转基因烟草中选5株生长状态较一致的植株做接菌实验，以3株非转基因烟草做对照，接菌10天后观察接菌叶片的变化。5株转基因烟草中仅有1株的叶片表现出轻微的针刺状斑点(图未显示)，其他4株未见明显的病斑。而相应的对照植株其中2株叶片上产生了典型的赤星病症(病斑产生同心轮纹，病斑边缘明显外围有淡黄色晕环且病斑质脆、易破，图7)。由于接菌叶间较短(10天)，且在此过程中有5天左右较低温度(低于20℃)，因此，在植物体内潜期较长且只局部叶片形成病斑，未及扩散到整株叶片。
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图7 转基因烟草活体接种赤星病菌
(Alternaria alternata)实验结果
1.非转基因植株；2～4.转基因植株
Fig.7 Results of fungal challenge with Alternaria
alternata on tobacco transgenic plants
1.Non-transgenic plant;2～4.Transgenic plangts
这只是抗病的初步结果，进一步的抗病鉴定还有待在子代进行。对于这些初步筛选的抗病植株需进行子代纯合系的筛选，从而为利用此抗真菌病双价载体转化其他植物并筛选抗病品种提供理论依据。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 植物转化所用烟草品种为K326。
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1.1.3 酶与试剂 各种限制性内切酶购自Boehringer Mannhein、BRL、Bio朙ab及Promega等公司。Taq DNA聚合酶购自上海生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自Bio朙ab公司；DNA Labelling Kit (Ready-To-Go)购自Pharmacia公司，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔抗体NBT及BCIP购自Promega公司；β-1，3-葡聚糖酶兔抗血清由中科院遗传所实验动物中心协助制备.
1.1.4 测试真菌 链格孢菌(Alternaria alternata)菌种购自中科院微生物所菌种保藏室。将其转接到PDA培养基(马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g)上使菌丝在25℃～28℃光照下生长4周左右，然后用于接菌实验。
1.1.5 PCR引物 检测β-1ρ，3-葡聚糖酶 基因引物：5′GC GGATCC GACCATGG CTGCTATCACACTCC 3′；3′ 端引物： 5′CG GTCGAC CTCACATCTC ACTTACGAGA 3′。检测几丁质酶基因引物：5′端(CaMV355启动子)引物：5′CTGACGTAAGGGATGACGC 3′；3′ 端引物：5′GGGATGACAGTGTCACTGAG 3′。
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1.2 方法
1.2.1 植物双价表达载体的构建 植物表达载体pBch含有“35S启动子—菜豆几丁质酶cDNA—Nos终止子”的表达框架，利用基因两端相同的EcoRⅠ酶切位点，将基因切下，补平并回收片段；同时将植物表达载体pD12(含有35S启动子，增强子和Nos终止子)用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后补平，再与几丁质酶cDNA连接，得到表达载体pDch后，用HindⅢ将“35S启动子—Ω增强子—chi-cDNA—Nos终止子”表达框切下并回收此片段，与同样酶切并含有“35S启动子—Ω—glu-cDNA—Nos终止子”表达框的植物表达载体pBLG[7]连接，筛选转化子，酶切鉴定。
1.2.2 植物双价表达载体的农杆菌转化及鉴定 农杆菌感受态细胞制备、转化方法及鉴定参照文献[8]进行。
1.2.3 烟草叶片组织的遗传转化及抗Kan再生苗筛选 按文献[9]所述方法进行。
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1.2.4 转基因烟草的PCR及PCR-Southern杂交分析 (1)植物总DNA的提取：采用CTAB法，参照文献[10]方法进行。(2)转基因烟草的PCR分析：取以上制备的总DNA1μ1(～100ng)，用检测β-1，3-葡聚糖酶基因的引物，或几丁质酶基因的引物，按标准反应程序进行PCR扩增。具体条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。反应总体积为20μl，反应结束后，取10μlPCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳。(3)PCR-Southern杂交：取PCR阳性反应的产物在0.8%琼脂糖胶、80V电压下电泳1～2h后，按文献[11]方法进行转膜与杂交。用HindⅢ酶切(含几丁质酶基因)或EcoRⅠ酶切(含β-1，3-葡聚糖酶基因)植物双价表达载体pBLGC，分离并纯化含几丁质酶基因或β-1，3-葡聚糖酶基因的片段，用于探针标记.按Pharmacia公司DNA Labelling Kit (Ready-To-Go)提供的随机引物法标记探针。
, 百拇医药 1.2.5 转基因烟草的点杂交分析 将100～500ng总DNA点在尼龙膜上，使携带DNA的一面暴露于紫外光源(254nm)下2min，然后将此膜直接用于预杂交和杂交，具体操作同以上PCR-Southern杂交的程序。
1.2.6 转基因烟草的Western blot分析 参照文献[10]所述方法进行。其中一抗为免抗β-1，3-葡聚糖酶抗血清，此抗血清经过与非转基因烟草幼嫩叶征的丙酮处理干粉混合过夜，以消除抗血清中非特异成分以及烟草本身存在β-1，，3-葡聚糖酶基因的微量表达对转基因植株Western blot结果的影响。一抗按1：1000稀释。二抗为碱性磷酸酯酶标记的羊抗免抗体，按1：3000稀释。
1.2.7 转基因烟草的抗真菌实验 选取生长状况一致的转基因植株(5株)和非转基因植物(3株)，将带有菌丝体的培养基切成0.5×0.5cm2小块，用保鲜膜将有菌丝的一面粘贴在植株第2或第3层幼叶背面，并使之固定[6]，然后用透明大塑料袋将整株植物罩住，使之保持良好透光状态。真菌在28℃～30℃相对湿度达饱和状态下侵染植株10天后，观察感病情况。
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2 结果与讨论
2.1 植物双价表达载体的构建及农杆菌转化
植物表达载体pBch以植物表达载体pBin437为基础而构建[12]，它含有CaMV35S启动子，但不含有TMV“Ω”翻译增强子片段。为了增强其翻译水平，并减少几丁质酶基因两端的酶切位点(含有2个EcoRⅠ及BamHⅠ等位点，对进一步的载体构建不利)，将几丁质酶基因从最内端的两个EcoRⅠ位点切下，补平，插入用BamHⅠ和SalⅠ双酶切后补平的载体pD12(含双表达框架的植物表达载体)即得到中间载体pDch，经酶切检查，几丁质酶基因以正确的方向插入载体中。用HindⅢ将pDch中含几丁质酶基因的表达框切下，插入到同样用HindⅢ酶切的植物表达载体pBLG(含有β-1，3-葡聚糖酶cDNA的植物表达载体)中，从而得到同时含有几丁质酶cDNA及β-1，3-葡聚糖酶cDNA两个表达框架的双价植物表达载体pBLGC(图1)。
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图1 双价植物表达载体pBLGC构建图谱
Fig.1 Construction map of bivalent expression vector pBLGC
分别用BamHⅠ+SalI、HindⅢ和EcoRⅠ3种酶对pBLG和pBLGC进行酶切。经BamHⅠ+SalI双酶切时，pBLG和pBLGC均能切出1条1.1kb的片段；当用HindⅢ或EcoRⅠ酶切时，pBLGC均能切出1条2.1kb大小的片段，而pBLG却只能被切成线性，未切出片段(图2)。这说明此双价表达载体的构建是正确的。
图2 双价植物表达载体pBLGC及单价植物表达载体pBLG酶切电泳分析
1，8：1kb DNA对照；2，3：pBLGC和pBLGC经BsmHⅠ和SalⅠ酶切；
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4，5：pBLG和pBLGC经EcoRⅠ酶切；6，7：pBLG和pBLGC经HindⅢ酶切
Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of plant expression vector pBLGC and pBLG
1，8：1kb DNA ladder；2，3：BamHⅠ/SalⅠ digestion of pBLG adn pBLGC；
4，5：EcoRⅠ digestion of pBLG adn pBLGC；6，7：HindⅢ digestion of pBLG and pBLGC
用转化根癌农杆菌的pBLGC侵染烟草叶片组织，在选择培养基上，我们共获得26株再生植株。
2.2 转化植株的PCR法鉴定
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以植物总DNA为模板，用可扩增β-1，3-葡聚糖酶cDNA及几丁质酶cDNA的引物进行PCR反应检测外源基因是否整合到基因组中。整合有外源基因的植株，PCR产物中应含有相应大小的片段(葡聚糖酶cDNA约1.08kb；几丁质酶cDNA本身大小为1.1kb，但由于5′端引物为35S启动子的引物，因此它扩增所得的片段大小约1.2kb)。对26株再生植株分别进行了两种基因的检测，PCR全部表现阳性(图3a，b)，这初步证明外源基因已整合到这些植物的基因组中。在β-1，3-葡聚糖酶cDNA的PCR检测中发现，除了1.1kb的条带，在约1.8kb处也出现1条带。这可能是由于烟草基因组本身就存在β-1，3-葡聚糖酶基因，而且饮食一个0.7kb的内含子，因此出现1条1.8kb的条带。
图3 转基因烟草的β-1，3-葡聚糖酶cDNA PCR检测的电泳分析
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(a)和转基因烟草的几丁质酶cDNA PCR检测的电泳分析(b)
a：1～13.转基因植株；14.非转基因植株；15.阳性对照；
b：1～4.转基因植株；5.非转基因植株；6.阳性对照；7.1kb DNA对照
Fig.3 Electrophoresis of PVR products of transgenic plant with β-1，3-glucanase cDNA primers.
(a)adn electrophoresis of PCR products of transgenic plant with chitinase cDNA primers (b)
a：1～13.Transgenic plants；14.Non-transgenic plant；15.Positive control；b：1～4.Transgenic plants；5.Non-transgenic plant；6.Positive control；7.1kb DNA ladder
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2.3 转基因烟草的PCR-Southern杂交及点杂交分析
将PCR检测为阳性的转基因植株总DNA进行PCR-Southern杂交及基因组DNA点杂交分析。PCR-Southern杂交结果(图4a，5a)显示，所测的两株PCR阳性的转基因植株在利用β-1，3-葡聚糖酶cDNA和几丁质酶cDNA做探针的Southern杂交中，结果也表现阳性，进一步说明了外源基因已整合到烟草基因组中。需要说明的是，图3a中显示出外源(1.1kb)及内源(1.8kb)葡聚糖酶基因的2条PCR带，而PCR-Southern杂交中只显示出1.1kb的条带，这可能由于两次PCR所用材料不同：前者为无菌苗所提总DNA，其含杂质少，质量较高；而后者为温室中生长2～3个月的植株，由此得到的总DNA质量较差，因此，内源的较大的葡聚糖酶基因片段未扩增出来。
图4 转基因烟草的β-1，3-葡聚糖酶cDNA的PCR-Southern杂交及点杂交分析
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a：PCR-Southern杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3、4.转基因植株.
b：点杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3～8.转基因植株
Fig.4 PCR-Southern blot and dot blot analysis of
tobacco transgenic plant with β-1，3-glucanase probe
a：PCR-Southern blot.1.Positive control;2.Non-transgenic plant;
3,4.Transgenic plants;b:Dot blot.1.Positive control;
, 百拇医药 2.Non-transgenic plant;3～8.Transgenic plants
图5 转基因烟草制造丁质酶cDNA的PCR-Southern杂交及点杂交分析
a：PCR-Sounthern杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3、4.转基因植株.
b：点杂交.1.阳性对照；2.非转基因植株；3～8.转基因植株
Fig.5 PCR-Southern blot and Dot blot analysis of
tobacco transgenic plant with chitinase probe
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a:PCR-Southern blot.1.Positive control;2.Non-transgenic plant;
3,4.Transgenic plants.b:Dot blot.1.Positive control;
2.Non-transgenic plant;3～8.Transgenic plants
用5个转基因及1个非转基因植株进行点杂交，以质粒做阳性对照。结果显示(图4b，5b)，当分别用β-1，3-葡聚糖酶cDNA和几丁质酶cDNA做探针，转基因植株的总DNA均表现出较强的杂交信号；非转基因植株对β-1，3-葡聚糖酶cDNA探针表现阳性反应，这表明烟草本身含有此基因；而对几丁质酶cDNA探针则无此反应，这从另一方面说明外源基因已插入烟草基因组中。
2.4 转基因烟草的Western blot分析
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在本研究中，只对新克隆的β-1，3-葡聚糖酶基因构建了大肠杆菌表达载体，并制备了抗血清.而几丁质酶基因未做相同构建，所以这里只能检测转基因植株的β-1，3-葡聚糖酶基因的表达情况.对15株转基因植株进行了Western blot分析，其中有5株的蛋白可与β-113-葡聚糖酶 抗血清有较明显特异免疫反应(图6).这里我们所取的是植株顶部的幼嫩叶片，因崦，在总蛋白中，即使烟草本身存在的β-1，3-葡聚糖酶基因也有表达，其量是极低的.Keefe等(1990)认为，β-1，3-葡聚糖酶主要分布在老叶及根中，在植株的顶部几乎检测不到[13]。而且由于β-1，3-葡聚糖酶抗血清经非转基因植株幼嫩叶片的吸附处理，完全可以消除抗体对于本身基因微量表达的特异反应，而且这种吸附处理也使图6中的非特异条带大大降低(资料略)。其他PCR阳性的转基因植株在Western blot中的免疫反应不明显或无特异条带，原因可能为：蛋白的纯度或量不够。而这可能是由于内部本身的β-1，3-葡聚糖酶基因与外源导入的基因发生了共抑制效应，从而使得此基因表达量比非转基因植株还低[14]。
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图6 转基因烟草的β-1，3-葡聚糖酶 的Western blot分析
1～5.转基因植株(20μg总蛋白)；6.非转基因植株(20μg总蛋白)；
7.阳性对照(大肠杆菌表达产物)；8.阴性对照(大肠杆菌表达产物)；9.标准蛋白对照
Fig.6 Western blot analysis of tobacco transgenic plant with β-1,3-glucanase
1～5.Transgenic plants (20μg total protein);
6.Non-transgenic plant (20μg total protein);
7.Positive control (expression product in E.coli);
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8.Negative contro(expression product in E.coli);9.Standard protein marker
如图6所示，因为阳性对照中的为β-1，3-葡聚糖酶前体蛋白(包括n-端信号肽约2kDa、成熟蛋白约35kDa及C端导向肽约2kDa)，在植株体内，当此酶的前体穿过内质网膜进入液泡成为成熟蛋白过程中，经历了N-端信号肽及C-端导向肽的切除[15，16]。因此阳性对照中特异反应条带位于39kDa左右，而转基因植株样品中的特异性条带出现在35kDa左右，它们相差约4kDa，这说明外源基因产物在烟草植株中得到了正确加工。
2.5 转基因烟草的抑菌实验
从PCR阳性的转基因烟草中选5株生长状态较一致的植株做接菌实验，以3株非转基因烟草做对照，接菌10天后观察接菌叶片的变化。5株转基因烟草中仅有1株的叶片表现出轻微的针刺状斑点(图未显示)，其他4株未见明显的病斑。而相应的对照植株其中2株叶片上产生了典型的赤星病症(病斑产生同心轮纹，病斑边缘明显外围有淡黄色晕环且病斑质脆、易破，图7)。由于接菌叶间较短(10天)，且在此过程中有5天左右较低温度(低于20℃)，因此，在植物体内潜期较长且只局部叶片形成病斑，未及扩散到整株叶片。
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图7 转基因烟草活体接种赤星病菌
(Alternaria alternata)实验结果
1.非转基因植株；2～4.转基因植株
Fig.7 Results of fungal challenge with Alternaria
alternata on tobacco transgenic plants
1.Non-transgenic plant;2～4.Transgenic plangts
这只是抗病的初步结果，进一步的抗病鉴定还有待在子代进行。对于这些初步筛选的抗病植株需进行子代纯合系的筛选，从而为利用此抗真菌病双价载体转化其他植物并筛选抗病品种提供理论依据。
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