表达人载脂蛋白AI小鼠主动脉平滑肌细胞的培养及意义
作者：谷素敏 李汇华 佘铭鹏
单位：
关键词：人载脂蛋白AI；转基因小鼠；平滑肌细胞；细胞培养
基础医学与临床000110
摘要：培养表达人apoAI转基因小鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)。从具有可诱导，高效，多组织表达人apoAI转基因小鼠分离主动脉，用改良贴块法培养血管SMC。细胞经相差显微镜和免疫细胞化学证实具有SMC特征。Northern blot 表明转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apoAI mRNA表达，而正常鼠则未检测出，为在体外从细胞和分子水平研究apoAI基因表达在胆固醇代谢及动脉粥样硬化发生中的作用提供了较理想的细胞模型。
中图分类号：Q954.66 文献标识码：A
, 百拇医药 文章编号：1001-6325(2000)01-0038-03
Culture of smooth muscle cells from the aorta of human apolipoprotein AI transgenic mice and its significance
GU Su-min，LI Hui-hua，SHE Ming-peng
(Department of Pathology，Institute of Basic Medical Sciences，Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences Beijing 100005，China)
Abstract:Culture of smoothe muscl cells originally from the aorta(VSMCs)human apolipoprotein AI(apo AI)transgenic mice was established.Fresh heart and aortac specimens were perfused immediately after the removal with trypsin at low concentration.The aorta were then cut into small pieces； washed with culture medium；and cultured with DMEM containing 20% fetal calf serum with 100U/mlpenicillin and 100ug/mL streptomycin.Under phase contrast microscope the cultured cells possessed,peak and valley characteristics for smooth muscle cells.Immunocytochemical staining with mAb against mouse smooth muscle a-actin demonstrated these cells were possitive.Northern blot analysis using human apoAI gene as the probe showed expression of human apoAI mRNA in the SMC from transgenic mice， but undetectable in the ASMCs of the control mice.It provides an ideal cell model in studying the role of apo AI in lipid metabolism and atherogenesis.
, 百拇医药
Key words:apolipoprotein AI ；the cultured treansgenic mice ； smooth muscle cells ；cell culture
血管平滑肌细胞(VSMC)是主动脉壁细胞的主要成份，其增殖和表型的改变是动脉粥样硬化(AS)，高血压和再狭窄形成的一个重要机制[1]。人载脂蛋白AI(apoAI)是高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白，主要在肝和小肠中表达，在胆固醇逆转运(RCT)过程中起着重要的作用，可有效地防止动脉细胞内脂质沉积和动脉壁粥样硬化(AS)的形成[2]。目前，主要采用较大动物如牛，猪，兔等动脉培养的VSMC作为研究心血管疾病的材料[3，4]，而小鼠主动脉SMC的培养难度较大，特别是表达人apoAI的SMC的分离和培养方法，国内外尚未见报道。本室建立的重组人apoAI转基因小鼠系具有可诱导，高效，多组织表达的特点[5]，因此，我们应用该系小鼠探索了小鼠主动脉SMC的原代培养方法，并成功地分离和培养出表达人apoAI的平滑肌细胞。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料
胎牛血清，DMEM，胰蛋白酶和异硫氰酸胍为GIBCO公司产品；抗平滑肌 Actin单克隆抗体和随机引物标记试剂盒为Promega公司产品；质粒PA-2.2由加洲大学Rubin教授惠赠；a-32PdCTP比活度TBq/mmol为英国Amersham公司产品；硝酸纤维素膜为瑞典Pharmacia公司产品。
1.2 方法
1.2.1 取材：选重18～22g健康C57BL/6小鼠(转基因鼠和对照鼠)[5]，2.5%阿丁佛腹 腔注射麻醉后，摘眼球放血处死，然后将整个小鼠浸泡于75%乙醇3～5s，用组织剪刀逐层开胸，无菌条件下取出心脏和主动脉并移至含青霉素200U/mL，链霉素200mg/mL和Hank's 液内备用。
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1.2.2 原代培养与传代：用Hank's 液自左心室灌注冲洗心脏和主动脉3次，再用0.05%胰蛋白酶液冲洗三次。然后用眼科剪剪去主动脉表面的脂肪组织和心脏。将主动脉置于无血清的DMEM液中，浸泡10min。再置于含10% NCS DMEM中10min，在青霉素小瓶中剪碎，并用DMEM冲洗。静置5min，吸出悬浮组织及上清液，将沉淀组织块再次剪碎冲洗，静置5min，反复2～3次。用弯头吸管将组织块均匀地接种于25mL 培养瓶中，倒置。加入3mL含20% NCS的DMEM培养液，置于37℃ 含95%空气和5% CO2 培养箱培养4～5h。原位将培养瓶轻轻翻转，使贴壁的组织块浸泡在培养液中，静止培养3天。于第5～7天显微镜下观察，可见有梭形细胞沿组织块边缘生长，第10～14天左右长出成片致密的细胞。3周后细胞汇集成片即可传代。细胞长满后，倾去培养液，加入10% NCS DMEM 3mL，用吸管反复吹打，按所需比例接种到新培养瓶中继续培养。一般3～5天再传代。
1.2.3 细胞冻存和复苏：取对数生长期细胞，在收集细胞24h前换液一次。按传代的方法消化细胞，加入20% NCS ，10% DMSO 的培养液一滴一滴加入离心管中，制成5×106细胞悬液，分装于若干个冻存管中，每个1.5mL。于4℃过夜，次晨用纱布将冻管包裹，以每分钟降1～2℃速度冷却至-25℃时，再以每分钟降5～10℃速度冷却至-70℃时，全部浸入液氮中储存。从液氮中取出冻存细胞，立即放入38～40℃水浴，并振荡使细胞快速解冻，移至含5mL 完全培养基的离心管。室温下1 000r/min离心10min，弃上清，加入新鲜的完全培养基，移至培养瓶中继续培养，以后每2～3天换液一次，待细胞长满后传代。
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1.2.4 细胞鉴定
1.2.4.1倒置显微镜检查。
1.2.4.2 免疫化学检查：用S-P法做平滑肌肌动蛋白免疫组化染色。
1.2.4.3 Northern Blot检测： 取转基因鼠和正常对照鼠第6～8代细胞传代72h后改用0.4%血清(人和牛各半)的DMEM 培养液培养48h(使细胞处于汇合状态)。每组4瓶(75cm2/瓶)，继续用10% NCS 的DMEM培养液培养48h。然后用0.01%胰酶消化，于4℃，1 000r/min，5min收集细胞，用10倍体积的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀两次。然后按Chomczynski等[6]方法提取总RNA。取总RNA 20mg在1.2%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。用随机引物法标记人apo AI 2.2 kb PstI片断为探针进行Northern blot检测。
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2 结果
2.1 相差显微镜检查
原代细胞中有平滑肌细胞和非平滑肌细胞，传至第5～6代时，平滑肌细胞达95%以上。经台盘蓝染色检查活细胞达99%。镜下可见贴壁的细胞呈长梭型或梭型，细胞呈平行或放射状生长(图1)。
2.2 免疫组化检查
培养的细胞经平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(S-P法)免疫组化染色，可见细胞呈阳性反应(图2)。
2.3 Northern blot检测
结果表明，转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apo AI mRNA表达，而正常鼠则未检出(图3)。
3 讨论
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培养VSMC为研究各种因素对SMC的增殖，分化与动脉粥样硬化之间的关系提供了较好的实验方法。大动物主动脉SMC的培养一般采用酶消化法和贴块法[3，4，7]，而小鼠主动脉SMC的分离与培养较为困难，国内尚未见报道。本实验改进了贴块法，成功地分离和培养出小鼠主动脉SMC。经光镜，免疫组化检查证实为平滑肌细胞，Northern blot检测表明，转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apoAI mRNA 表达，而正常鼠则未检出(图3)。
小鼠主动脉由于标本细小，尤其是转基因小鼠，成本高，材料供给比较困难。不容易除去内膜和外膜。本实验采用先灌洗后取动脉标本的优点是因为动脉连接于心脏比较固定，有利于胰酶灌洗除去膜。此外，在培养液中，根据外膜比重低而平滑肌比重高的特点，将动脉剪成细胞小组织块，用培养液反复冲洗吸去悬浮组织以除去外膜。该方法具有简单，和成活率高的优点。本实验培养的SMC来源于转基因小鼠，高效表达人apoAI mRNA。这为进一步从细胞和分子水平研究apoAI基因表达在胆固醇代谢及动脉粥样硬化发生中的作用提供了较理想的细胞模型。
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图1 平滑肌细胞相差显微镜检查
Fig 1 Light microscopy of SMCs culture originated from
the aortae of transgenic mice ×100
图2 用S-P法做平滑肌肌动蛋白免疫组化染色
Fig 2 Immunohistochemicqal staining of SMCs originated from the aortae of transgenic mice anti-mouse actin antibody,×1000
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图3 平滑肌细胞中人apoAI mRNA表达检测
Fig 3 Expression of human apoA-I mRNA in SMCs originated from the aortae of transgenic mice detected by Northern blot.
谷素敏(中国协和医科大学基础医学院，中国医学科学院基础医学研究所病理室，北京100005)
李汇华(中国协和医科大学基础医学院，中国医学科学院基础医学研究所病理室，北京100005)
佘铭鹏(中国协和医科大学基础医学院，中国医学科学院基础医学研究所病理室，北京100005)
[1]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature，1993，362:801-809.
, http://www.100md.com
[2]Gordon Dj， Probstfiled JL，Garrison RJ，et al.High density lipoprotein cholesterol and cardiovascular disease:four prospective American studies[J].Circulation，1989，79:8-15.
[3]Savion N and Kotev-Emeth S.Role of apolipoprotein A-I ，A-and C-I in cholesterol efflux from endothelial and smooth muscle cells[J].European Heart Journal，1993，14:930-935
[4]夏人仪，佘铭鹏，卢耀增.兔主动脉平滑肌细胞培养及形态学观察[J].中华心血管病杂志，1982，10：134-137.
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[5]李汇华，谷素敏，佘铭鹏.转基因小鼠载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响[J].中华医学杂志，1998，78：1-3.
[6]Chomczynski P and Sacchi N.Single-step method RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Analytical Biochemistry，1987，162:156-159.
[7] Cambell JC.The smooth muscle cell in culture[J].Physiol Res，1979，59:1-61.
收稿日期：1998-12-20；修订日期：1999-02-02, http://www.100md.com
单位：
关键词：人载脂蛋白AI；转基因小鼠；平滑肌细胞；细胞培养
基础医学与临床000110
摘要：培养表达人apoAI转基因小鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)。从具有可诱导，高效，多组织表达人apoAI转基因小鼠分离主动脉，用改良贴块法培养血管SMC。细胞经相差显微镜和免疫细胞化学证实具有SMC特征。Northern blot 表明转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apoAI mRNA表达，而正常鼠则未检测出，为在体外从细胞和分子水平研究apoAI基因表达在胆固醇代谢及动脉粥样硬化发生中的作用提供了较理想的细胞模型。
中图分类号：Q954.66 文献标识码：A
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Culture of smooth muscle cells from the aorta of human apolipoprotein AI transgenic mice and its significance
GU Su-min，LI Hui-hua，SHE Ming-peng
(Department of Pathology，Institute of Basic Medical Sciences，Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences Beijing 100005，China)
Abstract:Culture of smoothe muscl cells originally from the aorta(VSMCs)human apolipoprotein AI(apo AI)transgenic mice was established.Fresh heart and aortac specimens were perfused immediately after the removal with trypsin at low concentration.The aorta were then cut into small pieces； washed with culture medium；and cultured with DMEM containing 20% fetal calf serum with 100U/mlpenicillin and 100ug/mL streptomycin.Under phase contrast microscope the cultured cells possessed,peak and valley characteristics for smooth muscle cells.Immunocytochemical staining with mAb against mouse smooth muscle a-actin demonstrated these cells were possitive.Northern blot analysis using human apoAI gene as the probe showed expression of human apoAI mRNA in the SMC from transgenic mice， but undetectable in the ASMCs of the control mice.It provides an ideal cell model in studying the role of apo AI in lipid metabolism and atherogenesis.
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Key words:apolipoprotein AI ；the cultured treansgenic mice ； smooth muscle cells ；cell culture
血管平滑肌细胞(VSMC)是主动脉壁细胞的主要成份，其增殖和表型的改变是动脉粥样硬化(AS)，高血压和再狭窄形成的一个重要机制[1]。人载脂蛋白AI(apoAI)是高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白，主要在肝和小肠中表达，在胆固醇逆转运(RCT)过程中起着重要的作用，可有效地防止动脉细胞内脂质沉积和动脉壁粥样硬化(AS)的形成[2]。目前，主要采用较大动物如牛，猪，兔等动脉培养的VSMC作为研究心血管疾病的材料[3，4]，而小鼠主动脉SMC的培养难度较大，特别是表达人apoAI的SMC的分离和培养方法，国内外尚未见报道。本室建立的重组人apoAI转基因小鼠系具有可诱导，高效，多组织表达的特点[5]，因此，我们应用该系小鼠探索了小鼠主动脉SMC的原代培养方法，并成功地分离和培养出表达人apoAI的平滑肌细胞。
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1 材料和方法
1.1 材料
胎牛血清，DMEM，胰蛋白酶和异硫氰酸胍为GIBCO公司产品；抗平滑肌 Actin单克隆抗体和随机引物标记试剂盒为Promega公司产品；质粒PA-2.2由加洲大学Rubin教授惠赠；a-32PdCTP比活度TBq/mmol为英国Amersham公司产品；硝酸纤维素膜为瑞典Pharmacia公司产品。
1.2 方法
1.2.1 取材：选重18～22g健康C57BL/6小鼠(转基因鼠和对照鼠)[5]，2.5%阿丁佛腹 腔注射麻醉后，摘眼球放血处死，然后将整个小鼠浸泡于75%乙醇3～5s，用组织剪刀逐层开胸，无菌条件下取出心脏和主动脉并移至含青霉素200U/mL，链霉素200mg/mL和Hank's 液内备用。
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1.2.2 原代培养与传代：用Hank's 液自左心室灌注冲洗心脏和主动脉3次，再用0.05%胰蛋白酶液冲洗三次。然后用眼科剪剪去主动脉表面的脂肪组织和心脏。将主动脉置于无血清的DMEM液中，浸泡10min。再置于含10% NCS DMEM中10min，在青霉素小瓶中剪碎，并用DMEM冲洗。静置5min，吸出悬浮组织及上清液，将沉淀组织块再次剪碎冲洗，静置5min，反复2～3次。用弯头吸管将组织块均匀地接种于25mL 培养瓶中，倒置。加入3mL含20% NCS的DMEM培养液，置于37℃ 含95%空气和5% CO2 培养箱培养4～5h。原位将培养瓶轻轻翻转，使贴壁的组织块浸泡在培养液中，静止培养3天。于第5～7天显微镜下观察，可见有梭形细胞沿组织块边缘生长，第10～14天左右长出成片致密的细胞。3周后细胞汇集成片即可传代。细胞长满后，倾去培养液，加入10% NCS DMEM 3mL，用吸管反复吹打，按所需比例接种到新培养瓶中继续培养。一般3～5天再传代。
1.2.3 细胞冻存和复苏：取对数生长期细胞，在收集细胞24h前换液一次。按传代的方法消化细胞，加入20% NCS ，10% DMSO 的培养液一滴一滴加入离心管中，制成5×106细胞悬液，分装于若干个冻存管中，每个1.5mL。于4℃过夜，次晨用纱布将冻管包裹，以每分钟降1～2℃速度冷却至-25℃时，再以每分钟降5～10℃速度冷却至-70℃时，全部浸入液氮中储存。从液氮中取出冻存细胞，立即放入38～40℃水浴，并振荡使细胞快速解冻，移至含5mL 完全培养基的离心管。室温下1 000r/min离心10min，弃上清，加入新鲜的完全培养基，移至培养瓶中继续培养，以后每2～3天换液一次，待细胞长满后传代。
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1.2.4 细胞鉴定
1.2.4.1倒置显微镜检查。
1.2.4.2 免疫化学检查：用S-P法做平滑肌肌动蛋白免疫组化染色。
1.2.4.3 Northern Blot检测： 取转基因鼠和正常对照鼠第6～8代细胞传代72h后改用0.4%血清(人和牛各半)的DMEM 培养液培养48h(使细胞处于汇合状态)。每组4瓶(75cm2/瓶)，继续用10% NCS 的DMEM培养液培养48h。然后用0.01%胰酶消化，于4℃，1 000r/min，5min收集细胞，用10倍体积的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀两次。然后按Chomczynski等[6]方法提取总RNA。取总RNA 20mg在1.2%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。用随机引物法标记人apo AI 2.2 kb PstI片断为探针进行Northern blot检测。
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2 结果
2.1 相差显微镜检查
原代细胞中有平滑肌细胞和非平滑肌细胞，传至第5～6代时，平滑肌细胞达95%以上。经台盘蓝染色检查活细胞达99%。镜下可见贴壁的细胞呈长梭型或梭型，细胞呈平行或放射状生长(图1)。
2.2 免疫组化检查
培养的细胞经平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(S-P法)免疫组化染色，可见细胞呈阳性反应(图2)。
2.3 Northern blot检测
结果表明，转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apo AI mRNA表达，而正常鼠则未检出(图3)。
3 讨论
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培养VSMC为研究各种因素对SMC的增殖，分化与动脉粥样硬化之间的关系提供了较好的实验方法。大动物主动脉SMC的培养一般采用酶消化法和贴块法[3，4，7]，而小鼠主动脉SMC的分离与培养较为困难，国内尚未见报道。本实验改进了贴块法，成功地分离和培养出小鼠主动脉SMC。经光镜，免疫组化检查证实为平滑肌细胞，Northern blot检测表明，转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apoAI mRNA 表达，而正常鼠则未检出(图3)。
小鼠主动脉由于标本细小，尤其是转基因小鼠，成本高，材料供给比较困难。不容易除去内膜和外膜。本实验采用先灌洗后取动脉标本的优点是因为动脉连接于心脏比较固定，有利于胰酶灌洗除去膜。此外，在培养液中，根据外膜比重低而平滑肌比重高的特点，将动脉剪成细胞小组织块，用培养液反复冲洗吸去悬浮组织以除去外膜。该方法具有简单，和成活率高的优点。本实验培养的SMC来源于转基因小鼠，高效表达人apoAI mRNA。这为进一步从细胞和分子水平研究apoAI基因表达在胆固醇代谢及动脉粥样硬化发生中的作用提供了较理想的细胞模型。
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图1 平滑肌细胞相差显微镜检查
Fig 1 Light microscopy of SMCs culture originated from
the aortae of transgenic mice ×100
图2 用S-P法做平滑肌肌动蛋白免疫组化染色
Fig 2 Immunohistochemicqal staining of SMCs originated from the aortae of transgenic mice anti-mouse actin antibody,×1000
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图3 平滑肌细胞中人apoAI mRNA表达检测
Fig 3 Expression of human apoA-I mRNA in SMCs originated from the aortae of transgenic mice detected by Northern blot.
谷素敏(中国协和医科大学基础医学院，中国医学科学院基础医学研究所病理室，北京100005)
李汇华(中国协和医科大学基础医学院，中国医学科学院基础医学研究所病理室，北京100005)
佘铭鹏(中国协和医科大学基础医学院，中国医学科学院基础医学研究所病理室，北京100005)
[1]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature，1993，362:801-809.
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[2]Gordon Dj， Probstfiled JL，Garrison RJ，et al.High density lipoprotein cholesterol and cardiovascular disease:four prospective American studies[J].Circulation，1989，79:8-15.
[3]Savion N and Kotev-Emeth S.Role of apolipoprotein A-I ，A-and C-I in cholesterol efflux from endothelial and smooth muscle cells[J].European Heart Journal，1993，14:930-935
[4]夏人仪，佘铭鹏，卢耀增.兔主动脉平滑肌细胞培养及形态学观察[J].中华心血管病杂志，1982，10：134-137.
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[5]李汇华，谷素敏，佘铭鹏.转基因小鼠载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响[J].中华医学杂志，1998，78：1-3.
[6]Chomczynski P and Sacchi N.Single-step method RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Analytical Biochemistry，1987，162:156-159.
[7] Cambell JC.The smooth muscle cell in culture[J].Physiol Res，1979，59:1-61.
收稿日期：1998-12-20；修订日期：1999-02-02, http://www.100md.com