抑癌基因MTS1在膀胱移行上皮癌中的表达和意义
作者：方德信 熊旭林 鲁功成 王宗敏
单位：汕头大学医学院附一院(汕头 515031) 方德信；同济医科大学附属协和医院(武汉430030) 熊旭林 鲁功成；温州医学院附二院(温州325000) 王宗敏
关键词：膀胱移行上皮细胞癌；p16蛋白；免疫组织化学
华西医学990366 摘要：为探讨抑癌基因MTS1的表达产物p16蛋白在膀胱移行上皮癌中表达的意义，用免疫组化方法(SABC法)对35例膀胱移行上皮癌石蜡标本进行p16蛋白检测。结果：35例标本12例显色阴性(34.3%)。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级膀胱肿瘤的阴性显色率分别为45.5%(5/11)、31.3%(5/16)和25%(2/8)；浅表性肿瘤(Tis-T1)和浸润性肿瘤(T2-T4)的阴性显色率为36.8%(7/19)和31.5%(5/16)。不同分级、不同分期肿瘤的阴性显色率无显著差异性(P>0.05)。认为p16蛋白缺乏在膀胱移行上皮癌的发生中起一定作用，但与肿瘤的进展无关。
, 百拇医药
[中图分类号]R737.14 [文献标识码]B
Expression of the Multiple Tumer Suppressor Gene 1 in the
Transitional Cell Carcinoma of Bladder
Fang De-xing,XIONG Xu-lin,LU Gong-cheng,et al.
随着分子生物学的发展，人们认识到肿瘤的发生发展与癌基因激活、抗癌基因失活及细胞失去凋亡能力有关，其中前二者起主要作用。目前已发现10余种抗癌基因，1994年又发现一个重要的抗癌基因—多种肿瘤抑制基因-1(Mwltiple tumors suppressor gene 1,MTS1)。它编码一种分子量为16KD的蛋白质，故又称p16基因。p16蛋白为细胞周期素D(Cyclin D)/细胞周期素依赖的蛋白激酶-4(Cyclin D dependent Rinase 4,CDK4)复合物的抑制蛋白，故又称p16 ink4。p16ink4A,CDK4Ⅰ(Inhibiter of CDK4)、CDK4IA。p16蛋白参与细胞周期G1期的调控，通过抑制Cyclin D/CDK4复合物的活性，从而抑制细胞从G1期进入S期，p16蛋白的缺乏将使细胞周期失控，导致细胞癌变。为了解p16蛋白与膀胱移行上皮癌发生发展的关系，用免疫组化方法对35例肿瘤的p16蛋白缺乏情况进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 研究对象为温州医学院附属二院1990年～1996年手术切除的膀胱移行上皮癌标本。标本经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，共收集35例，其中男31例，女4例，年龄27～81岁，平均60.3岁。标本按WHO标准进行组织学分级，按UICC标准进行病理分期。病理分级：Ⅰ级11例，Ⅱ级16例，Ⅲ级8例。病理分期：Tis-T1，19例；T2-T4，16例。
1.2 试剂 兔抗人p16蛋白多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司，即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 SABC法免疫组化染色 切取4μm连续石蜡切片2张，用白胶涂胶，60℃烘烤2小时，一张用于HE染色，另一张用于免疫组化染色。免疫组化染色过程：二甲苯脱蜡，梯度酒精水化至水；3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶5分钟，PBS洗2分钟×3次；10%正常山羊血清封闭非特异性背景10分钟；加入1∶100稀释的p16多克隆抗体(一抗)，37℃2小时；生物素化二抗，37℃20分钟；SABC复合物，37℃20分钟；上述各步均以PBS洗涤，2分钟×3次；滴加DAB显色试剂，在显微镜下控制染色程度，以PBS中止染色，苏木素衬染30秒，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。实验中以乳腺癌阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，正常膀胱粘膜石蜡切片作为正常对照。
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1.4 统计学处理 不同病理分级和病理分期的p16蛋白阴性率进行卡方检验。
2 结果
显微镜下观察结果，阳性显色为棕黄色，同时分布于细胞浆和细胞核。35例中p16蛋白阴性12例，总阴性率为34.3%。3例正常膀胱粘膜均阳性。
不同病理分级标本的p16阴性显色情况见表1。其中Ⅰ级阴性显色5例，阴性显色率45.5%；Ⅱ组阴性显色5例，阴性显色率31.3%；Ⅲ级阴性显色2例，阴性显色率25.0%。经卡方检验，各级间阴性显色率的P值>0.05，各级间阴性显色率差异无显著性。
不同病理分期的p16阴性显色率见表2。其中Tis-T1期阳性显色7例，阴性率36.8%；T2-T4期阴性5例，阴性率31.3%。经卡方检验，二者之间P值>0.05，浅表性肿瘤(Tis-T1)与浸润性肿瘤(T2-T4)的阴性显色率之间的差异无显著性意义。
, 百拇医药
表1.不同病理分级肿瘤的p16蛋白
阴性显色率 病理分级
例数
阴性表达例数
阴性率%
Ⅰ
11
5
45.5
Ⅱ
16
5
31.3
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Ⅲ
8
2
25
合 计
35
12
34.3
表2.不同病理分期肿瘤的p16蛋白
阴性显色率 病理分期
例数
阴性表达例数
阴性率%
, 百拇医药
Tis-T1
19
7
36.8
T2-T4
16
5
31.3
合 计
35
12
34.3
, 百拇医药 3 讨论
细胞周期失控是细胞癌变的主要原因，细胞周期调控涉及细胞周期素、CDKs和CKIs。正常的细胞周期有赖于促增殖系统—Cyclins和CDKs与抑制系统—CKIs之间动态平衡的维持。促增殖系统成份的基因扩增或过度表达，抑制系统成份缺失或活性下降，都将使细胞周期失控导致细胞癌变。p16蛋白为CKIs的一种，是CyclinD/CDK4复合物的抑制蛋白〔1〕，它的作用与pRb蛋白有关〔1～3〕。p16蛋白的缺乏使Cyclin D/CDK4复合物活性增强，pRb蛋白磷酸化，磷酸化的pRb释放转录因子E2F；E2F促使能起动S期的基因如腺苷激酶基因等的表达，从而细胞进入S期〔3〕。即p16蛋白缺失使细胞失去对G1—S期关卡的调控，细胞周期失控进而发生癌变。
本文用SABC免疫组化法检测了35例膀胱移行上皮癌p16基因的表达情况，结果显示p16蛋白阴性率为34.3%，国内以前报道的阴性率分别为55.1%〔4〕和46.4%〔5〕，国外未见类似报道。本文p16蛋白阴性率较低可能与选用的免疫组化方法有关，因SABC法比S-P、ABC法更为敏感。本文也显示，p16蛋白缺乏与膀胱移行上皮癌的病理分级、病理分期无关，这与以前国内的报道〔4，5〕不一致。以前国内报道显示p16蛋白缺乏为膀胱肿瘤晚期的表现，肿瘤恶性程度越高，其p16蛋白阴性表达率越高。
, 百拇医药
p16基因位于9号染色体，国外研究〔6～9〕显示9号染色体缺乏与膀胱肿瘤的病理分级、分期无关，为膀胱肿瘤发生发展的早期事件，即9号染色体缺乏与与膀胱肿瘤的进展无关，与本文结果相符。
总之，本文揭示p16蛋白缺乏在膀胱移行上皮细胞癌的发生中起一定作用，但与肿瘤的发展无关。
4 参考文献
1 Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature 1993;366∶704.
2 Yeager T,Stadler W,Belair C,et al.Increased p16 levels correlated with pRb lateration in human urotherial cells.Cell Res 1995;55∶493.
, http://www.100md.com
3 Hengstchlager M,Hengstchlager-Ottang E,Pusch O,et al.The role of p16 in EZF-dependent thymidine kinase regulation.Oncogene 1996;12∶1635.
4 袁建林，王剑波，于茂生，等∶抑癌基因p16在膀胱肿瘤中的表达和意义。中华泌尿外科杂志，1995；16(12)∶722。
5 平季根，郭震华，陈赐龄，等∶抑癌基因p16在膀胱移行上皮细胞癌中的表达的意义。临床泌尿外科杂志，1997；12(1)∶36。
6 Gibas Z,Proat GR Jr,Conolly JG,et al. Nonrandom chromosomal changes with transitional cell carcinoma of the bladder.Cancer Res 1984;44∶1257.
, http://www.100md.com
7 Smeets W,Pauwels R,Laarakkers L,et al.Nonrandom chromosomal analysis of bladder cancer Ⅲ.Nonrandom alterations.Cancer Renet Gytogenet 1987;29∶29.
8 Tsai YC,Nichols PW,Hiti AL,et al.allelic losses of chromosome 9,11 and 17 in human bladder cancer.Cancer Res 1990;50∶44.
9 Cairns P,Show ME,Knowles MA.Preliminary mapping of the deleted region of chromosome 9 in bladder cancer.Cancer Res 1993;53∶1230.
(收稿日期：1999-03-01), 百拇医药
单位：汕头大学医学院附一院(汕头 515031) 方德信；同济医科大学附属协和医院(武汉430030) 熊旭林 鲁功成；温州医学院附二院(温州325000) 王宗敏
关键词：膀胱移行上皮细胞癌；p16蛋白；免疫组织化学
华西医学990366 摘要：为探讨抑癌基因MTS1的表达产物p16蛋白在膀胱移行上皮癌中表达的意义，用免疫组化方法(SABC法)对35例膀胱移行上皮癌石蜡标本进行p16蛋白检测。结果：35例标本12例显色阴性(34.3%)。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级膀胱肿瘤的阴性显色率分别为45.5%(5/11)、31.3%(5/16)和25%(2/8)；浅表性肿瘤(Tis-T1)和浸润性肿瘤(T2-T4)的阴性显色率为36.8%(7/19)和31.5%(5/16)。不同分级、不同分期肿瘤的阴性显色率无显著差异性(P>0.05)。认为p16蛋白缺乏在膀胱移行上皮癌的发生中起一定作用，但与肿瘤的进展无关。
, 百拇医药
[中图分类号]R737.14 [文献标识码]B
Expression of the Multiple Tumer Suppressor Gene 1 in the
Transitional Cell Carcinoma of Bladder
Fang De-xing,XIONG Xu-lin,LU Gong-cheng,et al.
随着分子生物学的发展，人们认识到肿瘤的发生发展与癌基因激活、抗癌基因失活及细胞失去凋亡能力有关，其中前二者起主要作用。目前已发现10余种抗癌基因，1994年又发现一个重要的抗癌基因—多种肿瘤抑制基因-1(Mwltiple tumors suppressor gene 1,MTS1)。它编码一种分子量为16KD的蛋白质，故又称p16基因。p16蛋白为细胞周期素D(Cyclin D)/细胞周期素依赖的蛋白激酶-4(Cyclin D dependent Rinase 4,CDK4)复合物的抑制蛋白，故又称p16 ink4。p16ink4A,CDK4Ⅰ(Inhibiter of CDK4)、CDK4IA。p16蛋白参与细胞周期G1期的调控，通过抑制Cyclin D/CDK4复合物的活性，从而抑制细胞从G1期进入S期，p16蛋白的缺乏将使细胞周期失控，导致细胞癌变。为了解p16蛋白与膀胱移行上皮癌发生发展的关系，用免疫组化方法对35例肿瘤的p16蛋白缺乏情况进行了研究。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 标本来源 研究对象为温州医学院附属二院1990年～1996年手术切除的膀胱移行上皮癌标本。标本经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，共收集35例，其中男31例，女4例，年龄27～81岁，平均60.3岁。标本按WHO标准进行组织学分级，按UICC标准进行病理分期。病理分级：Ⅰ级11例，Ⅱ级16例，Ⅲ级8例。病理分期：Tis-T1，19例；T2-T4，16例。
1.2 试剂 兔抗人p16蛋白多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司，即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 SABC法免疫组化染色 切取4μm连续石蜡切片2张，用白胶涂胶，60℃烘烤2小时，一张用于HE染色，另一张用于免疫组化染色。免疫组化染色过程：二甲苯脱蜡，梯度酒精水化至水；3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶5分钟，PBS洗2分钟×3次；10%正常山羊血清封闭非特异性背景10分钟；加入1∶100稀释的p16多克隆抗体(一抗)，37℃2小时；生物素化二抗，37℃20分钟；SABC复合物，37℃20分钟；上述各步均以PBS洗涤，2分钟×3次；滴加DAB显色试剂，在显微镜下控制染色程度，以PBS中止染色，苏木素衬染30秒，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。实验中以乳腺癌阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，正常膀胱粘膜石蜡切片作为正常对照。
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1.4 统计学处理 不同病理分级和病理分期的p16蛋白阴性率进行卡方检验。
2 结果
显微镜下观察结果，阳性显色为棕黄色，同时分布于细胞浆和细胞核。35例中p16蛋白阴性12例，总阴性率为34.3%。3例正常膀胱粘膜均阳性。
不同病理分级标本的p16阴性显色情况见表1。其中Ⅰ级阴性显色5例，阴性显色率45.5%；Ⅱ组阴性显色5例，阴性显色率31.3%；Ⅲ级阴性显色2例，阴性显色率25.0%。经卡方检验，各级间阴性显色率的P值>0.05，各级间阴性显色率差异无显著性。
不同病理分期的p16阴性显色率见表2。其中Tis-T1期阳性显色7例，阴性率36.8%；T2-T4期阴性5例，阴性率31.3%。经卡方检验，二者之间P值>0.05，浅表性肿瘤(Tis-T1)与浸润性肿瘤(T2-T4)的阴性显色率之间的差异无显著性意义。
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表1.不同病理分级肿瘤的p16蛋白
阴性显色率 病理分级
例数
阴性表达例数
阴性率%
Ⅰ
11
5
45.5
Ⅱ
16
5
31.3
, http://www.100md.com
Ⅲ
8
2
25
合 计
35
12
34.3
表2.不同病理分期肿瘤的p16蛋白
阴性显色率 病理分期
例数
阴性表达例数
阴性率%
, 百拇医药
Tis-T1
19
7
36.8
T2-T4
16
5
31.3
合 计
35
12
34.3
, 百拇医药 3 讨论
细胞周期失控是细胞癌变的主要原因，细胞周期调控涉及细胞周期素、CDKs和CKIs。正常的细胞周期有赖于促增殖系统—Cyclins和CDKs与抑制系统—CKIs之间动态平衡的维持。促增殖系统成份的基因扩增或过度表达，抑制系统成份缺失或活性下降，都将使细胞周期失控导致细胞癌变。p16蛋白为CKIs的一种，是CyclinD/CDK4复合物的抑制蛋白〔1〕，它的作用与pRb蛋白有关〔1～3〕。p16蛋白的缺乏使Cyclin D/CDK4复合物活性增强，pRb蛋白磷酸化，磷酸化的pRb释放转录因子E2F；E2F促使能起动S期的基因如腺苷激酶基因等的表达，从而细胞进入S期〔3〕。即p16蛋白缺失使细胞失去对G1—S期关卡的调控，细胞周期失控进而发生癌变。
本文用SABC免疫组化法检测了35例膀胱移行上皮癌p16基因的表达情况，结果显示p16蛋白阴性率为34.3%，国内以前报道的阴性率分别为55.1%〔4〕和46.4%〔5〕，国外未见类似报道。本文p16蛋白阴性率较低可能与选用的免疫组化方法有关，因SABC法比S-P、ABC法更为敏感。本文也显示，p16蛋白缺乏与膀胱移行上皮癌的病理分级、病理分期无关，这与以前国内的报道〔4，5〕不一致。以前国内报道显示p16蛋白缺乏为膀胱肿瘤晚期的表现，肿瘤恶性程度越高，其p16蛋白阴性表达率越高。
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p16基因位于9号染色体，国外研究〔6～9〕显示9号染色体缺乏与膀胱肿瘤的病理分级、分期无关，为膀胱肿瘤发生发展的早期事件，即9号染色体缺乏与与膀胱肿瘤的进展无关，与本文结果相符。
总之，本文揭示p16蛋白缺乏在膀胱移行上皮细胞癌的发生中起一定作用，但与肿瘤的发展无关。
4 参考文献
1 Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature 1993;366∶704.
2 Yeager T,Stadler W,Belair C,et al.Increased p16 levels correlated with pRb lateration in human urotherial cells.Cell Res 1995;55∶493.
, http://www.100md.com
3 Hengstchlager M,Hengstchlager-Ottang E,Pusch O,et al.The role of p16 in EZF-dependent thymidine kinase regulation.Oncogene 1996;12∶1635.
4 袁建林，王剑波，于茂生，等∶抑癌基因p16在膀胱肿瘤中的表达和意义。中华泌尿外科杂志，1995；16(12)∶722。
5 平季根，郭震华，陈赐龄，等∶抑癌基因p16在膀胱移行上皮细胞癌中的表达的意义。临床泌尿外科杂志，1997；12(1)∶36。
6 Gibas Z,Proat GR Jr,Conolly JG,et al. Nonrandom chromosomal changes with transitional cell carcinoma of the bladder.Cancer Res 1984;44∶1257.
, http://www.100md.com
7 Smeets W,Pauwels R,Laarakkers L,et al.Nonrandom chromosomal analysis of bladder cancer Ⅲ.Nonrandom alterations.Cancer Renet Gytogenet 1987;29∶29.
8 Tsai YC,Nichols PW,Hiti AL,et al.allelic losses of chromosome 9,11 and 17 in human bladder cancer.Cancer Res 1990;50∶44.
9 Cairns P,Show ME,Knowles MA.Preliminary mapping of the deleted region of chromosome 9 in bladder cancer.Cancer Res 1993;53∶1230.
(收稿日期：1999-03-01), 百拇医药