艾灸对钩端螺旋体感染豚鼠延髓中c-fos表达的影响
作者：吴俊梅1 魏东焰2 黄迪君1 张燕华3
单位：吴俊梅 黄迪君(成都中医药大学针灸推拿学院，四川 成都 610075)；魏东焰(四川省第五人民医院)；张燕华(华西医科大学)
关键词：艾灸；外膜蛋白；原癌基因c-fos；基因表达；免疫保护力；钩端螺旋体
成都中医药大学学报990221 摘 要： 选用39KDa的钩端螺旋体外膜蛋白(OmpL39)免疫豚鼠并施予艾灸，研究艾灸对伤害性刺激所致延髓中枢原癌基因c-fos表达的影响。结果表明：灸加OmpL39、单用OmpL39和单纯艾灸均能使豚鼠体内出血程度减轻，抑制内部伤害所致c-fos表达的中枢积累，且灸加OmpL39组作用最强，单用OmpL39组次之，单纯艾灸组再次之。提示艾灸通过扶助正气，减轻了钩体在体内造成的病理伤害和伤害性刺激的传入，从而使原癌基因c-fos在中枢的表达减少，促进了OmpL39的免疫保护力。
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中图分类号： R245.81；R514.4 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(1999)02-0037-04
钩端螺旋体病是由钩端螺旋体(以下简称钩体)引起的一种严重危害人畜健康的自然疫源性急性传染病，早期防治是降低本病死亡率的关键。但因钩体群型众多，导致目前采用的死菌苗接种预防效果不佳，且接种量大、注射次数多、免疫效期短、免疫力不强、局部反应较强，甚至有可能出现严重副作用的病例。故寻找免疫效果好而持久、注射量少、副作用小的防疫方法，成为当务之急。钩体病在祖国医学中属温病范畴，邪正相争是确定热性病病机进退的关键，故中医治则以扶正驱邪为主[1]。针灸不失为目前“扶正祛邪”、提高疫苗预防效果，减轻其副作用的有效手段。本课题在采用钩体稳定的广谱强免疫原OmpL39[2]穴位注射的基础上施用艾灸，研究艾灸对豚鼠钩体致内部伤害性刺激诱导的c-fos在延髓的表达的影响，以期为艾灸配合穴位注射OmpL39预防钩体病，提供一定的理论依据。
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1 材料
(1)艾条由成都滨江艾灸厂生产，艾绒由艾条拆散去粗取绒而得。
(2)OmpL39抗原注射液由华西医科大学钩端螺旋体病研究室提供。
(3)问号状钩体黄疸出血群赖型017株菌液，由卫生部成都生物制品研究所钩端螺旋体菌苗组提供。
(4)兔抗c-fos抗体(购自北京中山生物技术有限公司，为SANTACRUZ产品)，ABC试剂盒(含DAB染色剂，为华美生物工程公司产品)。
(5)实验动物：选用健康荷兰种一级雄性豚鼠32只，160～210g，卫生部成都生物制品研究所实验动物中心提供并饲养，在实验条件下先驯化、喂养1周。
2 方法
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2.1 艾灸选穴及方法
选取足三里和关元穴(取穴依据有关文献[3]，并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位)，于实验第1天开始施灸，将豚鼠用铁网架固定四肢，先麦粒灸足三里穴3壮，每壮0.5mg，以灸起轻微的疤痕为度，再艾条悬灸关元穴5min，均隔日灸1次。
2.2 穴位注射及活菌攻击方法
于实验第7天、第16天分别在每只豚鼠单侧足三里穴注射OmpL39抗原注射液0.5mL，再于第24天注射1mL加强免疫。末次免疫后13天腹腔注射钩体活菌2mL(2X10条/mL)攻击。
2.3 动物分组及处理
实验开始时，将32只豚鼠随机分为以下4组，每组8只，分别予以相应处理。
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(1)艾灸加穴位注射OmpL39组(以下简称灸+OmpL39组)：8只，给予艾灸、穴位注射OmpL39和活菌攻击。
(2)穴位注射OmpL39组(以下简称OmpL39组)：8只，除不艾灸外，其余处理同灸+OmpL39组(包括每天将豚鼠固定相同时间)。
(3)单纯艾灸组(以下简称艾灸组)：8只，除不注射OmpL39外，其余处理同灸+OmpL39组。
(4)空白对照组(以下简称空白组)：8只，将豚鼠固定的时间与前3组相同，并与前3组同时接受活菌攻击，余不作其它处理。
2.4 指标及检测方法
2.4.1 内脏出血程度
活菌攻击后第5天动物开始死亡，死亡时即行尸解，未死动物于活菌攻击后第12天处死、尸解，均记录内部出血情况。
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(1)出血程度判断标准：多数脏器以出血的面积、深浅来划分：┼只要有出血点即算，++出血的面积达某脏器的1/2，+++出血的面积达某脏器的3/4，++++呈片状出血遍布某脏器。出血程度以积分法计，即┼、+、+++、++++分别计为1、2、3、4分。
(2)脾脏以肿大来划分：+脾略肿大，++++脾肿大超过正常脾的2～3倍，++和+++肿大程度介于+和++++之间。
2.4.2 延髓c-fos表达
活菌攻击后第8天抽心血处死动物，取新鲜延髓(上平髓纹，下平枕骨大孔)，2min内浸入4%多聚甲醛(PFA)中固定，待组织块下沉后换20%蔗糖PBS液2次。恒冷箱切片机作延髓冠状切片，切片厚度为40μm，每切3片取1片，共取2片。切片切下后再入上述固定液中备用。用免疫组织化学ABC法[4]处理切片后，于四川大学电子计算机图像分析中心作切片的图像分析，在高倍显微镜(×400)与电脑联结系统下，每组随机取6个豚鼠延髓切片，每片在Fos蛋白主要分布的延髓腹外侧区(双侧)、网状结构(双侧)及中央灰质5个区域的中心各取1个视场，共5个视场，计算每个视场中c-fos表达颗粒所占面积与此整个视场面积的比，这5个面积比的平均数，即作为此豚鼠延髓切片的c-fos表达颗粒面积比。同时，在高倍显微镜下对每个视场中Fos免疫阳性反应(FLI)神经元进行计数，每个切片5个视场的平均数即作为该切片FLI神经元数。
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2.4.3 实验数据的统计处理方法
单因素方差分析中的q检验法。
3 结果
3.1 不同免疫法对活菌攻击后豚鼠内脏出血程度的影响
结果见表1。
表1 活菌攻击后各组肠鼠的内部出血程度(
±s) 组 别
n
出血程度
灸+OmpL39组
8
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0.250±0.25**△
OmpL39组
8
0.625±0.80**△
艾灸组
8
14.375±4.13*
空白组
8
26.125±3.31
与空白组比较，*P<0.05，**<0.01；与艾灸组比较，△P<0.05
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从表1可知，灸加OmpL39、OmpL39和灸组豚鼠的内部出血程度都比空白组有极显著或显著减轻(P<0.01或P<0.05)；灸加OmpL39和OmpL39组间豚鼠的内部出血程度没有显著性差异，但它们均分别比艾灸组有显著减轻(P<0.05)。
3.2 不同免疫法对活菌攻击后的豚鼠中枢c-fos表达的影响
结果见表2、表3。
表2 不同免疫法对活菌攻击后豚鼠延髓c-fos表达的影响
±s 组 别
n
c-fos表达面积比
FLI神经元计数(个)
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灸+OmpL39组
6
0.0086±0.0003*△*
4.00±0.84**△＃
OmpL39组
6
0.659±0.0022*
37.00±7.17*
艾灸组
6
0.0800±0.0100*
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44.17±8.09*
空白组
6
0.1657±0.0145
78.17±8.83
与空白组比较，*P<0.05，**<0.01；与艾灸组比较，△P<0.05；与OmpL39组比较，＃P<0.05
从表2得知，灸加OmpL39组.OmpL39组和艾灸组豚鼠延髓的c-fos表达面积比均显著小于空白组(P<0.05)，灸加OmpL39组的c-fos表达面积比显著小于OmpL39组和艾灸组，而OmpL39组与艾灸组间的c-fos颗粒面积比无显著性差异。从表3中得知，灸加OmpL39组、OmpL39组和艾灸组豚鼠延髓中FLI神经元数均显著少于空白组(P<0.05)，灸加OmpL39组的FLI神经元数显著少于OmpL39组和艾灸组，而OmpL39组与艾灸组间的FLI神经元数无显著性差异(P>0.05)。
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4 讨论
4.1 艾灸使钩体感染豚鼠中枢原癌基因c-fos表达减少的中医机理
艾灸自古为国人强身健体之要法，具有温经散寒、止痛、辟秽、振奋阳气等作用。祖国医学早在两千多年前就已认识到了艾灸的免疫预防作用，历代医家积累了不少保健灸的理论和临床经验，如《诸病源侯论》卷四十五记载“灸颊以防噤”；《备急千金要方》指出，灸使“瘴疬瘟疫不能着人”；《肘后备急方.治瘴气疫疬温毒诸方》也说灸可“断温病令不相染”。近30年来也有不少学者进行了针灸应用于预防疾病的研究[5～8]，并倾向于用针灸对免疫系统的调节来解释它的这种免疫保护性。学者们选用了不同的针灸方式、针刺次数、针灸间隔、针灸穴位、实验对象等进行研究，结果表明，针灸能明显增强动物和人体的细胞及体液免疫功能。此外，针灸效应的神经内分泌免疫机制研究也日益深入。现有的研究认为，针灸可通过神经内分泌系统调节免疫系统的功能，后者也可以反过来调节前者的功能[9～16]。
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70年代中期，重庆市、绵阳地区等多个卫生防疫站采用中西医结合的方法，将钩体疫苗的1/3一针注射于足三里穴，免疫效果与皮下全程足量接种者免疫效果完全一致，而足三里一针免疫法注射后反应轻，不影响生产劳动，易于为群众所接受[17～18]。表明针灸能增强菌苗的免疫力，对钩体病的预防接种有较好的辅助作用。
本实验通过艾灸和关元、足三里穴位的特殊作用，发挥补益先后天之气，行气活血，通络止痛，辟秽解毒的功效，以达到扶正祛邪之目的，即祛除钩体感染所致的各种病理因子(配合特殊物质，祛邪能力更强)，扶助动物神经内分泌免疫系统功能恢复平衡，使钩体对人体的伤害减轻。
4.2 艾灸使钩体感染豚鼠中枢原癌基因c-fos表达减少的意义
原癌基因是一类广泛存在于细胞基因组内的基因，由于它被逆转录病毒转导后可变成有致癌活性的病毒癌基因而得名，又称细胞癌基因，它不仅参与细胞的正常生长、分化过程，而且作为信使参与细胞内的信息传递过程[19]，其中有一类如c-fos等，可在数分钟内对神经递质、激素、神经冲动等外界刺激产生反应，被定义为即刻早期基因(IEG)。
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c-fos基因编码一个由380个氨基酸组成的分子量为55KDa的核蛋白(Fos)，Fos的半衰期为2h，主要位于细胞核内。c-fos神经元可以作为神经元活性和生长因子作用的细胞水平的代谢性标记(marker)，由于伤害性刺激诱导的Fos阳性神经元的分布与行为、电生理、神经解剖的研究较为一致，故也可作为伤害性刺激的神经元激活的一个经突触标记来追踪疼痛通路和检验药理因素的效应[20]。
针刺可以抑制伤害性刺激诱导的c-fos在中枢和外周炎症局部的表达[4，21～22]，但有关艾灸的研究还未见报道。本实验结果发现，灸加穴位注射钩体OmpL39或单纯艾灸均能减少内部伤害性刺激诱导的c-fos在中枢的表达。由于随着刺激强度和持续时间的增加会导致FLI阳性神经元数增多，染色加深，分布区域扩大等[23～24]，可以推测，艾灸使c-fos表达减少是因其减轻了钩体所致豚鼠内部伤害程度的原因。此结果为艾灸保健机理的深入研究提供了可参考依据。
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4.3 艾灸使钩体感染豚鼠中枢原癌基因c-fos表达减少的可能机制
现已公认，神经内分泌免疫系统间是相互影响、相互调节的、神经内分泌对免疫系统有调节作用，因为几乎所有的免疫细胞上都有不同的接受神经递质和激素刺激的受体，这些内分泌激素和神经递质都具有免疫调节功能。另一方面，免疫系统可以通过多种途径影响神经内分泌功能，免疫细胞本身可以产生和释放内分泌激素，也可以通过它们所产生的细胞因子作用于神经内分泌及全身各器官系统。
从信号传递的角度来说，机体对外界刺激的反应有瞬间完成的，也有长时程的，长时程的适应过程涉及复杂的细胞内调节，在神经系统的反射弧中，第一级神经元的兴奋引起神经递质(如DA、NE、5-HT等)或激素的分泌，作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜上已被刺激激活的受体，再由跨膜转导机制将信号传入细胞内，激活了胞内的第二信使(包括cAMP、cGMP、甘油二脂和钙离子等等)，引起细胞瞬时反应(如神经元的兴奋或抑制、腺细胞的分泌等)，同时第二信使进入胞核，激活核内第三信使(经第二信使诱导的c-fos、c-jun等原癌基因转录的mRNA翻译合成的Fos、Jun等核蛋白)，Fos与Jun在胞核中形成复合物并与目的基因内的AP-1调节位点结合，进一步激活目的基因(如阿片肽基因等)的表达而最终对该刺激作出反应。通过这一条信号传递通路，才能把短暂的信号转为长时程的反应[19，25]。在本实验中，艾灸使豚鼠在钩体攻击下的内部出血程度减轻，沿疼痛上行传导通路到达延髓的伤害性刺激传入减少，从而减少了对延髓神经元细胞上受体的激活，相应地对第二信使的激活减少，其诱导的c-fos表达也就会随之减少。此外，艾灸可使外周IL-1、IL-2活性提高，IL-1和IL-2能促进免疫细胞中EOP前体物质的基因表达，使EOP的合成和释放增加，阿片肽类物质又可抑制伤害性刺激诱导的c-fos在中枢的表达[4]。
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由于c-fos表达从某种程度上标志伤害性刺激的强度，可推知艾灸通过信号传递通路和递质、细胞因子的分泌调控，实现神经与免疫系统功能的相互促进，一方面使豚鼠内部病理伤害减轻，另一方面大大提高了其机体免疫功能，从而使OmpL39的免疫保护力表现出增强的效果，最终达到增加生存率和提高动物生存质量的目的。
基金项目:国家自然科学基金资助课题(批准号：39670304)
作者简介：吴俊梅，女，1970年5月生；博士研究生；针灸学专业；研究方向：针灸保健与康复及腧穴的临床应用。
参考文献
1 程式整理.宋鹭冰温病论述及疑难杂症经验集.成都：四川科学技术出版社，1992.56
2 张燕华，刘家福，吴俊梅.赖型钩端螺旋体外膜蛋白抗原OmpL39的纯化、分离和免疫保护力的研究.中国学术期刊文摘(科技快报)，1997，3(1)：112
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3 李辞蓉，华兴邦，周浩良，等.豚鼠针灸穴位图谱的研制.上海针灸杂志，1992，11(2)：28
4 赵仓焕.电针对炎症痛大鼠炎症局部阿片肽及基因表达的影响：〔学位论文〕.成都：成都中医药大学.1996
5 向家伦.针灸预防部份疾病的进展情况.云南中医杂志，1984，5(6)：56
6 陈汉平，赵粹英，黄永平，等.针灸预防疾病作用的探讨.上海针灸杂志，1991，11(2)：34
7 苏同生，殷克敬，梁国栋.针刺预防激素对小鼠巨噬细胞功能抑制的实验研究.针灸临床杂志，1993，9(4)：26
8 崔永孟.足三里穴防病、抗衰老作用的研究.中国针灸，1991，11(2)：50
9 吴俊梅.针灸调节IL-2-IFN-NKC免疫网络的研究概况.中国针灸，1996，16(6)：54
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10 翟道荡，陈汉平，王瑞珍，等.直接灸免疫调节作用的β-内啡肽机制.上海针灸杂志，1994，13(5)：223
11 崔蒙.针灸对机体免疫功能影响的国外研究近况.中医杂志，1990，31(3)：52
12 王健鹤，严伟星.中枢亮啡肽在针刺免疫调节中的作用.科学通报，1990，(35)：139
13 成柏华，张开齐，王如瑶，等.针刺对免疫调整作用的机理研究.中国针灸，1991，11(5)：31
14 戴培东.植物神经在电针调整家兔细胞免疫功能中的作用.针灸学报，1990，(2)：6
15 刘文琴，赵续民，赵建础，等.肾上腺皮质系统在电针调节免疫反应中的作用.针刺研究，1996，21(2)：71
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16 赵伟康，张红度，全国琴，等.艾灸关元穴对老年大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴和IL-2的影响.上海针灸杂志，1996，15(3)：28
17 于恩庶.钩端螺旋体病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1992.369，282
18 四川绵阳地区卫生防疫站.钩端螺旋体菌苗足三里穴注射一针免疫效果初步观察.中华医学杂志，1976，(8)：498
19 王晓民，韩济生.原癌基因与核内第三信使.见：韩济生主编.神经科学纲要.北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社.1993.273
20 李红运.原癌基因c-fos在疼痛传导中的途径分布：〔学位论文〕.重庆：第三军医大学.1995
21 娄之聪.电针对创伤痛诱发的中枢c-fos基因表达的影响.针刺研究，1992，(2)：129
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22 孙文颖，李晓文，娄之聪，等.电针“夹脊穴”抑制创伤痛诱发的脊髓FOS蛋白表达.针刺研究，1996，21(1)：60
23 Abbadie C Honore P，Besson JM. Intense cold noxious stimulation of the rat hindpaw induces c-fos expression in lumbr apinal cordneurons.Neurosci，1994，59：457
24 Bullitt E，lee CL，Light AR，et al.The effect of stimulus durationon noxious-stimulus induced c-fos expression in lumbar spinal cordneurons.Res，1992，580：172
25 张遐，鞠躬.c-fos癌基因的诱导和显示.生理科学进展，1992，22(4)：299
(收稿日期：1999-01-11), 百拇医药(吴俊梅1 魏东焰2 黄迪君1 张燕华3)
单位：吴俊梅 黄迪君(成都中医药大学针灸推拿学院，四川 成都 610075)；魏东焰(四川省第五人民医院)；张燕华(华西医科大学)
关键词：艾灸；外膜蛋白；原癌基因c-fos；基因表达；免疫保护力；钩端螺旋体
成都中医药大学学报990221 摘 要： 选用39KDa的钩端螺旋体外膜蛋白(OmpL39)免疫豚鼠并施予艾灸，研究艾灸对伤害性刺激所致延髓中枢原癌基因c-fos表达的影响。结果表明：灸加OmpL39、单用OmpL39和单纯艾灸均能使豚鼠体内出血程度减轻，抑制内部伤害所致c-fos表达的中枢积累，且灸加OmpL39组作用最强，单用OmpL39组次之，单纯艾灸组再次之。提示艾灸通过扶助正气，减轻了钩体在体内造成的病理伤害和伤害性刺激的传入，从而使原癌基因c-fos在中枢的表达减少，促进了OmpL39的免疫保护力。
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中图分类号： R245.81；R514.4 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(1999)02-0037-04
钩端螺旋体病是由钩端螺旋体(以下简称钩体)引起的一种严重危害人畜健康的自然疫源性急性传染病，早期防治是降低本病死亡率的关键。但因钩体群型众多，导致目前采用的死菌苗接种预防效果不佳，且接种量大、注射次数多、免疫效期短、免疫力不强、局部反应较强，甚至有可能出现严重副作用的病例。故寻找免疫效果好而持久、注射量少、副作用小的防疫方法，成为当务之急。钩体病在祖国医学中属温病范畴，邪正相争是确定热性病病机进退的关键，故中医治则以扶正驱邪为主[1]。针灸不失为目前“扶正祛邪”、提高疫苗预防效果，减轻其副作用的有效手段。本课题在采用钩体稳定的广谱强免疫原OmpL39[2]穴位注射的基础上施用艾灸，研究艾灸对豚鼠钩体致内部伤害性刺激诱导的c-fos在延髓的表达的影响，以期为艾灸配合穴位注射OmpL39预防钩体病，提供一定的理论依据。
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1 材料
(1)艾条由成都滨江艾灸厂生产，艾绒由艾条拆散去粗取绒而得。
(2)OmpL39抗原注射液由华西医科大学钩端螺旋体病研究室提供。
(3)问号状钩体黄疸出血群赖型017株菌液，由卫生部成都生物制品研究所钩端螺旋体菌苗组提供。
(4)兔抗c-fos抗体(购自北京中山生物技术有限公司，为SANTACRUZ产品)，ABC试剂盒(含DAB染色剂，为华美生物工程公司产品)。
(5)实验动物：选用健康荷兰种一级雄性豚鼠32只，160～210g，卫生部成都生物制品研究所实验动物中心提供并饲养，在实验条件下先驯化、喂养1周。
2 方法
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2.1 艾灸选穴及方法
选取足三里和关元穴(取穴依据有关文献[3]，并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位)，于实验第1天开始施灸，将豚鼠用铁网架固定四肢，先麦粒灸足三里穴3壮，每壮0.5mg，以灸起轻微的疤痕为度，再艾条悬灸关元穴5min，均隔日灸1次。
2.2 穴位注射及活菌攻击方法
于实验第7天、第16天分别在每只豚鼠单侧足三里穴注射OmpL39抗原注射液0.5mL，再于第24天注射1mL加强免疫。末次免疫后13天腹腔注射钩体活菌2mL(2X10条/mL)攻击。
2.3 动物分组及处理
实验开始时，将32只豚鼠随机分为以下4组，每组8只，分别予以相应处理。
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(1)艾灸加穴位注射OmpL39组(以下简称灸+OmpL39组)：8只，给予艾灸、穴位注射OmpL39和活菌攻击。
(2)穴位注射OmpL39组(以下简称OmpL39组)：8只，除不艾灸外，其余处理同灸+OmpL39组(包括每天将豚鼠固定相同时间)。
(3)单纯艾灸组(以下简称艾灸组)：8只，除不注射OmpL39外，其余处理同灸+OmpL39组。
(4)空白对照组(以下简称空白组)：8只，将豚鼠固定的时间与前3组相同，并与前3组同时接受活菌攻击，余不作其它处理。
2.4 指标及检测方法
2.4.1 内脏出血程度
活菌攻击后第5天动物开始死亡，死亡时即行尸解，未死动物于活菌攻击后第12天处死、尸解，均记录内部出血情况。
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(1)出血程度判断标准：多数脏器以出血的面积、深浅来划分：┼只要有出血点即算，++出血的面积达某脏器的1/2，+++出血的面积达某脏器的3/4，++++呈片状出血遍布某脏器。出血程度以积分法计，即┼、+、+++、++++分别计为1、2、3、4分。
(2)脾脏以肿大来划分：+脾略肿大，++++脾肿大超过正常脾的2～3倍，++和+++肿大程度介于+和++++之间。
2.4.2 延髓c-fos表达
活菌攻击后第8天抽心血处死动物，取新鲜延髓(上平髓纹，下平枕骨大孔)，2min内浸入4%多聚甲醛(PFA)中固定，待组织块下沉后换20%蔗糖PBS液2次。恒冷箱切片机作延髓冠状切片，切片厚度为40μm，每切3片取1片，共取2片。切片切下后再入上述固定液中备用。用免疫组织化学ABC法[4]处理切片后，于四川大学电子计算机图像分析中心作切片的图像分析，在高倍显微镜(×400)与电脑联结系统下，每组随机取6个豚鼠延髓切片，每片在Fos蛋白主要分布的延髓腹外侧区(双侧)、网状结构(双侧)及中央灰质5个区域的中心各取1个视场，共5个视场，计算每个视场中c-fos表达颗粒所占面积与此整个视场面积的比，这5个面积比的平均数，即作为此豚鼠延髓切片的c-fos表达颗粒面积比。同时，在高倍显微镜下对每个视场中Fos免疫阳性反应(FLI)神经元进行计数，每个切片5个视场的平均数即作为该切片FLI神经元数。
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2.4.3 实验数据的统计处理方法
单因素方差分析中的q检验法。
3 结果
3.1 不同免疫法对活菌攻击后豚鼠内脏出血程度的影响
结果见表1。
表1 活菌攻击后各组肠鼠的内部出血程度(
±s) 组 别n
出血程度
灸+OmpL39组
8
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0.250±0.25**△
OmpL39组
8
0.625±0.80**△
艾灸组
8
14.375±4.13*
空白组
8
26.125±3.31
与空白组比较，*P<0.05，**<0.01；与艾灸组比较，△P<0.05
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从表1可知，灸加OmpL39、OmpL39和灸组豚鼠的内部出血程度都比空白组有极显著或显著减轻(P<0.01或P<0.05)；灸加OmpL39和OmpL39组间豚鼠的内部出血程度没有显著性差异，但它们均分别比艾灸组有显著减轻(P<0.05)。
3.2 不同免疫法对活菌攻击后的豚鼠中枢c-fos表达的影响
结果见表2、表3。
表2 不同免疫法对活菌攻击后豚鼠延髓c-fos表达的影响
±s 组 别n
c-fos表达面积比
FLI神经元计数(个)
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灸+OmpL39组
6
0.0086±0.0003*△*
4.00±0.84**△＃
OmpL39组
6
0.659±0.0022*
37.00±7.17*
艾灸组
6
0.0800±0.0100*
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44.17±8.09*
空白组
6
0.1657±0.0145
78.17±8.83
与空白组比较，*P<0.05，**<0.01；与艾灸组比较，△P<0.05；与OmpL39组比较，＃P<0.05
从表2得知，灸加OmpL39组.OmpL39组和艾灸组豚鼠延髓的c-fos表达面积比均显著小于空白组(P<0.05)，灸加OmpL39组的c-fos表达面积比显著小于OmpL39组和艾灸组，而OmpL39组与艾灸组间的c-fos颗粒面积比无显著性差异。从表3中得知，灸加OmpL39组、OmpL39组和艾灸组豚鼠延髓中FLI神经元数均显著少于空白组(P<0.05)，灸加OmpL39组的FLI神经元数显著少于OmpL39组和艾灸组，而OmpL39组与艾灸组间的FLI神经元数无显著性差异(P>0.05)。
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4 讨论
4.1 艾灸使钩体感染豚鼠中枢原癌基因c-fos表达减少的中医机理
艾灸自古为国人强身健体之要法，具有温经散寒、止痛、辟秽、振奋阳气等作用。祖国医学早在两千多年前就已认识到了艾灸的免疫预防作用，历代医家积累了不少保健灸的理论和临床经验，如《诸病源侯论》卷四十五记载“灸颊以防噤”；《备急千金要方》指出，灸使“瘴疬瘟疫不能着人”；《肘后备急方.治瘴气疫疬温毒诸方》也说灸可“断温病令不相染”。近30年来也有不少学者进行了针灸应用于预防疾病的研究[5～8]，并倾向于用针灸对免疫系统的调节来解释它的这种免疫保护性。学者们选用了不同的针灸方式、针刺次数、针灸间隔、针灸穴位、实验对象等进行研究，结果表明，针灸能明显增强动物和人体的细胞及体液免疫功能。此外，针灸效应的神经内分泌免疫机制研究也日益深入。现有的研究认为，针灸可通过神经内分泌系统调节免疫系统的功能，后者也可以反过来调节前者的功能[9～16]。
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70年代中期，重庆市、绵阳地区等多个卫生防疫站采用中西医结合的方法，将钩体疫苗的1/3一针注射于足三里穴，免疫效果与皮下全程足量接种者免疫效果完全一致，而足三里一针免疫法注射后反应轻，不影响生产劳动，易于为群众所接受[17～18]。表明针灸能增强菌苗的免疫力，对钩体病的预防接种有较好的辅助作用。
本实验通过艾灸和关元、足三里穴位的特殊作用，发挥补益先后天之气，行气活血，通络止痛，辟秽解毒的功效，以达到扶正祛邪之目的，即祛除钩体感染所致的各种病理因子(配合特殊物质，祛邪能力更强)，扶助动物神经内分泌免疫系统功能恢复平衡，使钩体对人体的伤害减轻。
4.2 艾灸使钩体感染豚鼠中枢原癌基因c-fos表达减少的意义
原癌基因是一类广泛存在于细胞基因组内的基因，由于它被逆转录病毒转导后可变成有致癌活性的病毒癌基因而得名，又称细胞癌基因，它不仅参与细胞的正常生长、分化过程，而且作为信使参与细胞内的信息传递过程[19]，其中有一类如c-fos等，可在数分钟内对神经递质、激素、神经冲动等外界刺激产生反应，被定义为即刻早期基因(IEG)。
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c-fos基因编码一个由380个氨基酸组成的分子量为55KDa的核蛋白(Fos)，Fos的半衰期为2h，主要位于细胞核内。c-fos神经元可以作为神经元活性和生长因子作用的细胞水平的代谢性标记(marker)，由于伤害性刺激诱导的Fos阳性神经元的分布与行为、电生理、神经解剖的研究较为一致，故也可作为伤害性刺激的神经元激活的一个经突触标记来追踪疼痛通路和检验药理因素的效应[20]。
针刺可以抑制伤害性刺激诱导的c-fos在中枢和外周炎症局部的表达[4，21～22]，但有关艾灸的研究还未见报道。本实验结果发现，灸加穴位注射钩体OmpL39或单纯艾灸均能减少内部伤害性刺激诱导的c-fos在中枢的表达。由于随着刺激强度和持续时间的增加会导致FLI阳性神经元数增多，染色加深，分布区域扩大等[23～24]，可以推测，艾灸使c-fos表达减少是因其减轻了钩体所致豚鼠内部伤害程度的原因。此结果为艾灸保健机理的深入研究提供了可参考依据。
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4.3 艾灸使钩体感染豚鼠中枢原癌基因c-fos表达减少的可能机制
现已公认，神经内分泌免疫系统间是相互影响、相互调节的、神经内分泌对免疫系统有调节作用，因为几乎所有的免疫细胞上都有不同的接受神经递质和激素刺激的受体，这些内分泌激素和神经递质都具有免疫调节功能。另一方面，免疫系统可以通过多种途径影响神经内分泌功能，免疫细胞本身可以产生和释放内分泌激素，也可以通过它们所产生的细胞因子作用于神经内分泌及全身各器官系统。
从信号传递的角度来说，机体对外界刺激的反应有瞬间完成的，也有长时程的，长时程的适应过程涉及复杂的细胞内调节，在神经系统的反射弧中，第一级神经元的兴奋引起神经递质(如DA、NE、5-HT等)或激素的分泌，作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜上已被刺激激活的受体，再由跨膜转导机制将信号传入细胞内，激活了胞内的第二信使(包括cAMP、cGMP、甘油二脂和钙离子等等)，引起细胞瞬时反应(如神经元的兴奋或抑制、腺细胞的分泌等)，同时第二信使进入胞核，激活核内第三信使(经第二信使诱导的c-fos、c-jun等原癌基因转录的mRNA翻译合成的Fos、Jun等核蛋白)，Fos与Jun在胞核中形成复合物并与目的基因内的AP-1调节位点结合，进一步激活目的基因(如阿片肽基因等)的表达而最终对该刺激作出反应。通过这一条信号传递通路，才能把短暂的信号转为长时程的反应[19，25]。在本实验中，艾灸使豚鼠在钩体攻击下的内部出血程度减轻，沿疼痛上行传导通路到达延髓的伤害性刺激传入减少，从而减少了对延髓神经元细胞上受体的激活，相应地对第二信使的激活减少，其诱导的c-fos表达也就会随之减少。此外，艾灸可使外周IL-1、IL-2活性提高，IL-1和IL-2能促进免疫细胞中EOP前体物质的基因表达，使EOP的合成和释放增加，阿片肽类物质又可抑制伤害性刺激诱导的c-fos在中枢的表达[4]。
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由于c-fos表达从某种程度上标志伤害性刺激的强度，可推知艾灸通过信号传递通路和递质、细胞因子的分泌调控，实现神经与免疫系统功能的相互促进，一方面使豚鼠内部病理伤害减轻，另一方面大大提高了其机体免疫功能，从而使OmpL39的免疫保护力表现出增强的效果，最终达到增加生存率和提高动物生存质量的目的。
基金项目:国家自然科学基金资助课题(批准号：39670304)
作者简介：吴俊梅，女，1970年5月生；博士研究生；针灸学专业；研究方向：针灸保健与康复及腧穴的临床应用。
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(收稿日期：1999-01-11), 百拇医药(吴俊梅1 魏东焰2 黄迪君1 张燕华3)